全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(4): 596−601 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家科技支撑计划项目(2008BADB3B05)和现代农业产业技术体系建设专项资金资助。
*
通讯作者(Corresponding authors): 杨青川, E-mail: qchyang66@yahoo.com.cn; 王凭青, E-mail: wang_pq@21cn.com
第一作者联系方式: E-mail: qinzhihui999@163.com
Received(收稿日期): 2009-11-10; Accepted(接受日期): 2010-01-07.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00596
紫花苜蓿锌指蛋白基因 RNAi表达载体的构建及在苜蓿的转化
秦智慧 1,2 晁跃辉 1 杨青川 1,* 康俊梅 1 孙 彦 3 王凭青 2,* 龙瑞才 1
1 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193; 2 重庆大学生物工程学院, 重庆 400030; 3 中国农业大学, 北京 100193
摘 要: 根据紫花苜蓿锌指蛋白MsZFN基因(GenBank登录号为 EU624138)序列, 设计两对含有酶切位点的特异性引
物, 以紫花苜蓿 cDNA为模板, 分别合成用于构建干扰载体的正反义片段, 将正反义片段分别插入表达载体 pART27
的相应位置, 构建成含有发夹结构的 RNAi 载体 pART-F-R。利用农杆菌介导方法, 将 pART-F-R 转化到紫花苜蓿中,
经过 PCR检测, 获得了 3株转基因植株。经过 RT-PCR检测, 证明转基因植株中 MsZFN基因表达量明显低于未转基
因的植株。结果表明, 已构建成功具有发夹结构的 RNAi载体 pART-F-R, 它可有效的抑制紫花苜蓿MsZFN基因。
关键词: 紫花苜蓿; 锌指蛋白; RNAi; 转基因
Construction and Transformation of RNAi Vector of MsZFN Gene from Alfalfa
(Medicago sativa L.)
QIN Zhi-Hui1,2, CHAO Yue-Hui1, YANG Qing-Chuan1,*, KANG Jun-Mei1, SUN Yan3, WANG Ping-Qing2,*,
and LONG Rui-Cai1
1 Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2 Bioengineering College of Chongqing University,
Chongqing 400030, China; 3 College of Animal Science and Technology, China Agriculture University, Beijing 100191, China
Abstract: On the basis of the sequence of Medicago sativa Zinc Finger Protein (MsZFN) gene (GenBank accession No.
EU624138), two pairs of specific primers containing different enzyme sites were designed. With the template of full-length cDNA,
positive-sense strand and antisense strand were obtained, which were separately inserted into the expression vector pART27. The
RNAi vector pART-F-R containing a hairpin structure was constructed. Mediated by Agrobacterium tumefaciens, pART-F-R was
transformed into alfalfa plants. PCR testing showed that three transgenic plants were obtained. The result of RT-PCR showed that
transgenic alfalfas had lower expression level of MsZFN gene than the wild type. These results indicated that the RNAi vector
pART-F-R containing a hairpin structure was constructed successfully and highly efficient for the simultaneous silence of MsZFN
gene.
Keywords: Alfalfa (Medicago sativa L.); Zinc finger protein; RNAi; Transgene
近年来的研究表明, 一些小的双链 RNA可以高
效、特异地阻断体内特定基因表达, 促使 mRNA 降
解 , 诱使细胞表现出特定基因缺失的表型 , 称为
RNA 干扰(RNA interference, 简称 RNAi)[1]。RNAi
作为一种反向遗传学的研究方法, 为后基因组时代
的基因功能分析提供了一种可靠、快速的应用技术
平台。随着双子叶模式植物拟南芥和单子叶模式植
物水稻测序工作的完成, 植物基因组学的重心已由
结构基因组学转向功能基因组学, 功能基因的分析
迫使人们需要一种高效、高通量的鉴定基因功能的
技术, 而RNAi技术适应了这种时代需求, 以其高度
专一性和有效的干扰特性, 特异地使特定基因沉默,
获得功能丧失或降低的突变体, 已成为功能基因组
学的一种强有力的研究工具。
锌指蛋白是真核生物基因组中最丰富的一类转
录因子, 这种蛋白质与 Zn2+结合形成稳定的手指结
构, 在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育等生
命过程中发挥重要作用。锌指蛋白主要通过与核酸
的相互作用, 从而表现出不同的功能, 如促进转录、
抑制转录、单链 DNA结合、RNA结合或 RNA/DNA
双向结合等。作为一种转录调控因子, 对锌指蛋白
的研究具有重要意义。目前, 关于锌指蛋白已有广
第 4期 秦智慧等: 紫花苜蓿锌指蛋白基因 RNAi表达载体的构建及在苜蓿的转化 597
泛的研究, 但对 CCCH 类型的锌指蛋白的功能研究
比较少, 主要集中在动物中, 研究最多的是 TTP。该
蛋白含有两个 CCCH 锌指结构, 可以直接与 mRNA
的 3′非编码区的 AU 富含区域结合, 而引起 mRNA
的降解, 是对胰岛素、TPA 响应的早期基因的蛋白
产物[2]。有关植物中的 CCCH型锌指蛋白研究较少。
在拟南芥中, 锌指蛋白 HUA1被证明是一种 RNA结
合蛋白, 可能在植物开花中起到一种新的调控机制[3]。
AtCPSF30能够编码小的多肽, 与哺乳动物卵裂和多
聚特异性因子 30 kD 的亚基具有的同源性, 被证明
是一种核定位蛋白, 起到 RNA 结合的作用, 而且
能够与钙调素相结合[4]。在水稻中, OsDOS 蛋白也
是一种核定位蛋白, 可以通过影响茉莉酸甲酯信号
通路从而延迟叶片的衰老 [5]。在拟南芥中发现的
SOMNUS 蛋白, 编码一种核定位 CCCH 类型的锌指
蛋白, 对影响光依赖种子发芽的下游蛋白起负调控
作用[6]。拟南芥中的 PEI1作为一种 DNA结合蛋白,
是一种胚胎发育调控的鉴定因子 [7], 另外两种在拟
南芥中分离得到的 CCCH 类型锌指蛋白 AtSZF1 和
AtSZF2可以在盐胁迫条件下起一定作用[8]。
紫花苜蓿是一种重要的优质高产牧草, 对畜牧
业的发展起着重要的作用。紫花苜蓿锌指蛋白
MsZFN基因是在盐诱导抑制消减杂交 cDNA文库中
分离出来的 [9], 说明其可能与抗盐相关 , 但还需进
一步研究。植物 RNAi技术, 主要是构建具有目的基
因特定序列正、反向互补重复区段的 DNA载体, 将
其转化到植物体内实现干扰作用。RNAi技术可以在
转录水平上抑制基因表达, 成为一种广泛用于研究
基因功能的技术。本研究利用已获得的 MsZFN序列,
构建紫花苜蓿锌指蛋白基因的 ihpRNA 表达载体,
并将其转入紫花苜蓿以期获得干扰植株, 为揭示该
基因功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌菌株为 E. coli
DH5α 购自北京天根生物科技有限公司; 克隆载体
pMD18-T 购自 TaKaRa 公司 ; 干扰载体的质粒
pKANNIBAL 和 pART27 为澳大利亚 CSIRO Plant
Industry惠赠; 农杆菌菌株 LBA4404, 以及扩增的克
隆载体 pMD-ZFN为本实验室保存。
1.1.2 酶及生化试剂 限制性内切酶、T4 DNA
连接酶和凝胶电泳 DNA 回收试剂盒等购自 TaKaRa
公司; Taq DNA 聚合酶购自北京天根生物科技有限
公司; DNA Marker DL2000购自北京诺德金生物科
技有限公司; 其他试剂为进口分装或国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 引 物 设 计 根 据 MsZFN 基 因 及
pKANNIBL序列, 使用 Primer Premier 5.0设计 4对
引物(表 1), 其中, ZFNf 和 ZFNr用于MsZFN基因全
长 cDNA 克隆; ZFNf1 和 ZFNf2 用于紫花苜蓿锌指
蛋白基因正向片段扩增; ZFNr1 和 ZFNr2 用于紫花
苜蓿锌指蛋白基因反向片段扩增; pdk1和 pdk2用于
pdk内含子片段扩增。
表 1 用于载体构建及检测的引物序列
Table 1 Primers sequence used for vector construction and testing
引物
Primer
序列
Sequence (5′–3′)
ZFNf ATGCCATCCCTCAAGAGGCAATGTG
ZFNr CCCATTTCCAAGAGACAACATTATCCC
ZFNf1 CCGCTCGAGCAGACAGTCCACAACAAACAATGAG
ZFNf2 CGGGGTACCCTCAACAAGTCCTCTGATGATAAA
ZFNr1 CCATCGATCTCAACAAGTCCTCTGATGATAAA
ZFNr2 GCTCTAGACAGACAGTCCACAACAAACAATGAG
pdk1 GTGATGTGTAAGACGAAGAAGATAA
pdk2 ATTACAAFCAGATTGGAATT
1.2.2 pMD-F 和 pMD-R 载体构建 将紫花苜蓿
幼苗在石英砂上培养 10 d 后, 以全株为样本, 采用
异硫氰酸胍法提取总 RNA; 利用 Primescrip 反转录
酶, 获得第一链 cDNA。以第一链 cDNA为模板, 以
ZFNf1 和 ZFNf2 为引物 , 扩增基因正义片段 ; 以
ZFNr1 和 ZFNr2 为引物, 扩增基因反义片段。PCR
扩增条件为 94℃预变性 3 min; 94℃变性 30 s, 55℃
退火 30 s, 72℃延伸 1 min, 30个循环; 72℃稳定 5
min; 4℃保存。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后,
连接克隆载体 pMD18-T, 连接产物转化大肠杆菌
DH5α 感受态细胞, 重组子经 PCR 鉴定后送北京奥
莱博生物技术有限公司测序。正、反义基因片段重
组子分别被命名为 pMD-F和 pMD-R。
1.2.3 锌指蛋白基因 ihpRNA 表达载体构建及鉴定
将正义片段和反义片段分别插入克隆载体
pKANNIBAL 的相应位置, 经酶切和 PCR 检测, 将
阳性重组子命名为 pKA-F-R; 对重组子 pKA-F-R和
载体 pART27用 Not I单酶切, 将目的条带切胶回收
后, 在 T4 连接酶作用下, 16℃反应过夜, 连接产物
转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, PCR 及酶切鉴定,
将阳性重组子命名为 pART-F-R (图 1)并送北京奥莱
博生物技术有限公司测序。
598 作 物 学 报 第 36卷
图 1 紫花苜蓿锌指蛋白基因的 RNAi载体的结构图
Fig. 1 Sketch map of RNAi vector of MsZFN gene from alfalfa
1.2.4 苜蓿转化 提取 pART-F-R 质粒并纯化,
用 CaCl2转化方法导入农杆菌 LBA4404 中, 并用菌
液 PCR 方法鉴定出阳性克隆。通过农杆菌介导将
pART-F-R整合到紫花苜蓿基因组中, 将受侵染的苜
蓿子叶转移至共培养培养基[UM+2.0 mg L–1 2,4-D
(2,4-二氯苯氧乙酸) + 0.25 mg L–1 KT (激动素) + 8 g
L–1琼脂], 24℃黑暗条件下培养 3 d 后, 转移到高选
择压的分化培养基[UM + 2.0 mg L–1 2,4-D + 0.25 mg
L–1 KT + 400 mg L–1 Cef (头孢霉素) + 50 mg L–1 Kan
(卡纳霉素) + 8 g L–1琼脂], 经过 4周的诱导愈伤后,
转移到诱芽培养基 [UM+ 2.0 mg L–1 KT+200 mg L–1
Cef + 50 mg L–1 Kan + 8 g L–1琼脂]中, 出芽后转到
生根培养基(1/2MS + 75 mg L–1 Kan +8 g L–1琼脂)中,
培养条件是 24℃、光照 16 h d−1。
1.2.5 再生植株检测 利用 CTAB 法提取再生植
株基因组 DNA; 利用异硫氰酸胍法, 提取再生植株
的总 RNA, 通过反转录获得第一链 cDNA。以 pdk1
和 pdk2 为引物, 以基因组 DNA 为模板, 进行 PCR
检测, PCR程序为 94℃预变性 3 min; 94℃变性 30 s,
55 (℃ 每个循环降低 0.33 )℃ 退火 30 s, 72℃延伸 1 min,
30个循环; 72℃稳定 5 min; 4℃保存。以第一链 cDNA
为模板, ZFNf 和 ZFNr为引物, 进行 PCR扩增, PCR
程序为 94℃预变性 3 min; 94℃变性 30 s, 58℃退火
30 s, 72℃延伸 1 min, 30个循环; 72℃稳定 5 min; 4℃
保存。
2 结果与分析
2.1 紫花苜蓿锌指蛋白基因 RNAi植物表达载体
构建及鉴定
以含有紫花苜蓿锌指蛋白基因完整开放性阅读
框的 pMD-ZFN 为模板, 以引物 ZFNf1 和 ZFNf2 进
行正向片段扩增, 以引物 ZFNr1和 ZFNr2进行反向
片段扩增, 以电泳检测扩增产物, 得到预期大小的
泳带(图 2)。将 PCR产物分别经凝胶电泳回收后, 连
接到 pMD18-T载体上。测序结果表明, 获得正确序
列的目的基因片段。
用 Xho I/Kpn I对 pMD-F双酶切, 将回收的目的
片段连接到用相同酶切处理的 pKANNIBAL 上; 对
pMD-R用 Cal I/Xba I进行双酶切, 将回收的目的片
段连接到经鉴定为阳性的 pKA-F 质粒上(相同的酶
切处理)。以待检测的 pKA-F-R质粒为模板, 以引物
pdk1和 pdk2进行 PCR扩增, 扩增产物为 304 bp。
电泳检测扩增产物, 得到预期大小的泳带(图 3)。提
取质粒 , 分别用 Xho I/Kpn I 和 Cla I/Xba I 对
pKA-F-R进行双酶切, 均在 500 bp左右得到一条电
泳条带, 用 Not I对质粒进行单酶切, 得到 3 000 bp
和 4 000 bp 两条带, 经电泳分析, 得到与预期大小
一致的条带(图 4)。
用Not I对质粒 pKA-F-R进行单酶切, 回收目的
片段, 连接到经过相同酶切处理的 pART27质粒上。
以待检测的 pART-F-R 质粒为模板, 以引物 pdk1 和
pdk2进行 PCR扩增, 扩增产物为 304 bp。电泳检测
扩增产物, 得到预期大小的泳带(图 5)。用 Not I 对
质粒进行单酶切, 在 4 000 bp左右得到 1条条带, 经
电泳分析, 得到与预期大小一致的条带(图 6)。经测
序得知, 载体 pART-F-R构建正确。各种酶切、PCR
图 2 MsZFN基因 PCR扩增
Fig. 2 PCR products of MsZFN gene
M: DNA marker, DL2000; 1: 正义片段 PCR结果; 2: 反义片段
PCR结果。
M: DNA marker, DL2000; 1: PCR products of sense; 2: PCR
products of antisense.
图 3 pKA-F-R质粒 PCR检测
Fig. 3 PCR detection of pKA-F-R plasmid
M: DNA marker, DL2000;1, 2: pKA-F-R质粒 PCR产物。
M: DNA marker, DL2000; 1, 2: pKA-F-R plasmid PCR products.
第 4期 秦智慧等: 紫花苜蓿锌指蛋白基因 RNAi表达载体的构建及在苜蓿的转化 599
鉴定以及测序结果表明 , 紫花苜蓿锌指蛋白基因
RNAi表达载体构建成功。
2.2 农杆菌中表达载体的菌液 PCR鉴定
大量提取 RNAi表达载体质粒 DNA, 转化农杆菌
LBA4404 感受态细胞, 在含有利福平(100 μg mL–1),
链霉素(50 μg mL–1)和卡那霉素(50 μg mL–1)的 YEB
固体培养基上筛选转化子。挑取单菌落在含有相同
抗生素的 YEB液体培养基中摇菌, 并对所得的菌液
用特异性引物 pdk1和 pdk2进行 PCR扩增, 同时进
行以未转化的质粒和未转化的农杆菌为模板的对照
PCR。
图 4 pKA-F-R酶切分析
Fig. 4 Restriction analysis of pKA-F-R
M: DNA marker, 1 kb plus DNA ladder; 1: Not I消化;
2: Xho I/Kpn I消化; 3: Cla I/Xba I消化。
M: DNA marker, 1kb plus DNA ladder; 1: digested by Not I;
2: digested by Xho I/Kpn I; 3: digested by Cla I/Xba I.
图 5 pKA-F-R质粒 PCR检测
Fig. 5 PCR detection of pKA-F-R
M: DNA marker, DL2000; 1: pKA-F-R质粒 PCR产物。
M: DNA marker, DL2000; 1: pKA-F-R plasmid PCR products.
若农杆菌菌落中含有 RNAi 表达载体, 在 PCR
检测时, 能够得到 304 bp 电泳条带。以电泳检测
PCR扩增产物, 除 3号没有扩增出条带外, 其余的均
得到与预期大小一致的条带(图 7)。证明表达载体已
转入农杆菌 LBA4404。
2.3 再生植株获得及鉴定
2.3.1 PCR 检测 以再生植株基因组 DNA 为模
板, 以 pdk1和 pdk2为引物进行 PCR, 琼脂糖电泳显
示 4株再生植株中有 3个能够扩增出约 300 bp特异
的目的片段(图 8), 与目标大小吻合, 而未转基因的苜
蓿植株则不能扩增出该条带。说明 4个再生植株中有
3株已经成功转入干扰基因片段。
2.3.2 RT-PCR 检测 以紫花苜蓿 cDNA 为模板,
ZFNf 和 ZFNr为引物进行 PCR检测, 琼脂糖电泳显
示四株再生植株中均能够扩增出约 1 300 bp特异的
目的片段(图 9), 与目标大小吻合, 而转基因的苜蓿植
株则由于 RNAi 干扰存在, 电泳条带亮度明显弱于
图 6 pKA-F-R酶切分析
Fig. 6 Restriction analysis of pKA-F-R
M: DNA marker, DNA kb ladder: 1: Not I消化。
M: DNA marker, DNA kb ladder; 1: digested by Not I.
图 7 农杆菌 PCR检测
Fig. 7 PCR detection of Agrobacterium tumefuciens
M: DNA marker, DL2000; 1~6: 农杆菌; CK–: 阴性对照; CK+:
阳性对照。
M: DNA marker, DL2000; 1–6: Agrobacterium tumefuciens; CK–:
negative control; CK+: positive control.
600 作 物 学 报 第 36卷
图 8 PCR检测苜蓿再生植株
Fig. 8 PCR products of alfalfa regeneration plants
M: DNA marker, DL2000 plus; 1~4: 再生植株; CK+: pART-F-R;
CK–: 野生型苜蓿。
M: DNA marker, DL2000 plus; 1–4: regeneration plants; CK+:
pART-F-R; CK–: wild alfalfa.
图 9 RT-PCR检测苜蓿再生植株
Fig. 9 RT-PCR detection of alfalfa regeneration plants
M: DNA marker, DL2000 plus; 1~4: 苜蓿再生植株; CK+: 阳性对
照, 野生型苜蓿。
M: DNA marker, DL2000 plus; 1–4: alfalfa regeneration plants;
CK+: positive control, wild alfalfa.
未转化成功的植株。表明构建的 RNAi 表达载体能
够成功干扰植物转录。
3 讨论
本实验构建了具有“35S 启动子-MsZFN 基因正
向片段-pdk内含子-MsZFN基因反向片段-OCS终止
子”的结构, 故转基因植物中外源基因经转录就形成
了具有“MsZFN基因正向片段-pdk内含子-MsZFN基
因反向片段”结构的 mRNA, 然后 MsZFN 基因正、
反向片段通过链内退火, 形成 dsRNA, 激发 RNAi
机制, 形成小 siRNA, 能够与 MsZFN 基因发生特异
性作用, 使 MsZFN基因在转录后水平沉默。
在 RNAi 表达载体的构建过程中, 需要对目的
基因进行两次 PCR 扩增, 所以设计了引物 ZFNf1/
ZFNf2和 ZFNr1/ZFNr2, 分别含有 Xho I/Kpn I和 Cla
I/Xba I酶切位点。ZFNf1/ZFNf2用于获得 MsZFN基
因正向片段 , Xho I/Kpn I 酶切位点使其插入
pKANNIBAL载体中 35S启动子和 pdk内含子之间;
ZFNr1/ZFNr2用于获得 MsZFN基因反向片段, Cla I/
Xba I 酶切位点使其插入 pKANNIBAL 载体中 pdk
内含子和 OCS终止子之间。正、反向片段插入方向
的正确, 使其能够形成“35S 启动子-MsZFN 基因正
向片段-pdk内含子-MsZFN基因反向片段-OCS终止
子”的结构。在 pKANNIBAL载体中, 35S 启动子至
OCS终止子片段两端含有两个 Not I酶切位点, 可以
通过酶切和连接反应将“35S 启动子-MsZFN 基因正
向片段-pdk内含子-MsZFN基因反向片段-OCS终止
子”片段插入到植物表达载体 pART27 中 Not I 酶切
位点处。由于在酶切片段中含有 35S 启动子, 所以
不需要担心插入片段的方向性问题, 无论正反, 都
能保证在植物体内形成具有发夹结构的 mRNA。本
文采用农杆菌介导的方法来转化紫花苜蓿 , 通过
PCR 反应检测 pdk 内含子的方法, 来检测目的片段
是否已经成功插入紫花苜蓿基因组中 , 实验表明 ,
获得的 4株再生植株中有 3株能够扩增出目的片段;
通过 RT-PCR的方法检测 MsZFN基因的表达量及转
基因植株中MsZFN基因是否发生沉默, 表明MsZFN
基因转录水平比野生型植株有了明显降低。初步证
明 RNAi表达载体构建成功, 以及以构建双链 RNAi
表达载体来沉默 MsZFN基因是可行的。
利用 RNAi 技术在 RNA 水平抑制基因的表达,
成为一种高效的基因功能研究方法。RNAi为基因组
研究进入后基因组时代提供了一种有力的工具[10]。
已有大量研究[11-15]证实 RNAi 可以特异性抑制特定
基因的表达, 获得功能性丧失, 从而成为研究基因
功能的良好工具。本研究通过构建 RNAi 表达载体,
并将其导入紫花苜蓿, 得到 MsZFN基因表达沉默的
转基因植株, 对促进该基因功能的研究具有一定的
价值。
4 结论
含有MsZFN基因正反向互补片段, 能够在植物
体内转录形成具有发夹结构 dsRNA 的 RNAi 载体
pART-F-R, 能够有效抑制 MsZFN基因的表达, 是一
个有效的 RNAi载体。
References
[1] Arenz C, Schepers U. RNA interference: From an ancient
mechanism to a state of the art therapeutic application?
Naturwissenschaften, 2003, 90: 345–359
[2] Lai W S, Kennington E A, Blackshear P J. Tristetraprolin and its
family members can promote the cell-free deadenylation of
AU-rich element-containing mRNAs by poly(A) ribonuclease.
Mol Cell Biol, 2003, 23: 3798–3812
[3] Li J J, Jia D X, Chen X M. HUA1, a regulator of stamen and car-
第 4期 秦智慧等: 紫花苜蓿锌指蛋白基因 RNAi表达载体的构建及在苜蓿的转化 601
pel identities in Arabidopsis, codes for a nuclear RNA binding
protein. Plant Cell, 2001, 13: 2269–2281
[4] Delaney K J, Xu R Q, Zhang J X, Li Q Q, Yun K Y, Falcone D L,
Hunt A G. Calmodulin interacts with and regulates the RNA-
binding activity of an Arabidopsis polyadenylation factor subunit.
Plant Physiol, 2006, 140: 1507–1521
[5] Kong Z S, Li M N, Yang W Q, Xu W Y, Xue Y B. A novel nu-
clearlocalized CCCH-type zinc finger protein, OsDOS, is in-
volved in delaying leaf senescence in rice. Plant Physiol, 2006,
141: 1376–1388
[6] Dong H K, Shinjiro Y, Soohwan L, Eunkyoo O, Jeongmu P,
Atsushi H, Yuji K, Giltsu C. SOMNUS, a CCCH-Type zinc finger
protein in Arabidopsis, negatively regulates light-dependent seed
germination downstream of PIL5. Plant Cell, 2008, 20:
1260–1277
[7] Li Z S, Thomas T L. PEI1, an embryo-specific zinc finger protein
gene required for heart-stage embryo formation in Arabidopsis.
Plant Cell, 1998, 10: 383–398
[8] Sun J Q, Jiang H L, Xu Y X, Li H M, Wu X Y, Xie Q, Li C. The
CCCH-type zinc finger proteins AtSZF1 and AtSZF2 regulate salt
stress responses in Arabidopsis. Plant Cell Physiol, 2007, 48:
1148–1158
[9] Chao Y H, Kang J M, Sun Y, Yang Q C, Wang P Q, Wu M S, Li Y,
Long R C, Qin Z H. Molecular cloning and characterization of a
novel gene encoding zinc finger protein from Medicago sativa L.
Mol Biol Rep, 2009, 36: 2315–2321
[10] Peng H-B(彭辉兵), Quan Z-H(全智华). RNAi: a powerful tool
for gene silencing. Med Recapitulate (医学综述), 2007, 13(3):
177–180 (in Chinese)
[11] Kamath R S, Fraser A G, Dong Y, Poulin G, Durbin R, Gotta M,
Kanapin A, Le Bot N, Moreno S, Sohrmann M, Welchman D P,
Zipperlen P, Ahringer J. Systematic functional analysis Caenor-
haditis elegans genome using RNAi. Nature, 2003, 421: 231–237
[12] Ashrafi K, Chang F Y, Watts J L, Fraser A G, Kamath R S,
Ahringer J, Ruvkun G. Genome-wide RNAi analysis of Caenor-
haditis elegans fat regulatory genes. Nature, 2003, 421: 268–272
[13] Frankish H. Consortium uses RNAi to uncover genes’ function.
Lancet, 2003, 361: 584
[14] Chuang C F, Meyerowitz E M. Specific and heritable genetic in-
terference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana. Proc
Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 4985–4990
[15] Prasanth S G, Prasanth K V, Stillman B. Orc6 involved in DNA
replication, chromosome segregation, and cytokinesis. Science,
2002, 297: 1026–1031