全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(9): 1484−1489 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家科技支撑计划(2008BADB3B05)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 杨青川, E-mail: qchyang66@yahoo.com.cn
第一作者联系方式: E-mail: baiyongq-03@163.com, Tel: 010-62816357
Received(收稿日期): 2010-01-08; Accepted(接受日期): 2010-04-20.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01484
紫花苜蓿 LEA蛋白基因 ihpRNA表达载体构建及烟草转化
白永琴 1 康俊梅 1 孙 彦 2 杨青川 1,* 李 燕 1
1 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193; 2 中国农业大学动物科技学院草地研究所, 北京 100094
摘 要: 根据紫花苜蓿 LEA蛋白 MsLEA3-1基因(GenBank登录号为 EU665182)序列, 设计两对含有酶切位点的特异
性引物 LEAf1/ LEAf2和 LEAr1/ LEAr2, 以构建好的 PMD-LEA质粒为模板, 分别合成用于构建干扰载体的正反义片
段 pMD-F 和 pMD-R, 将正反义片段分别插入表达载体 pART27 的相应位置, 构建成含有发夹结构的 RNAi 载体
pART-F-R, 经过 Not I酶切鉴定, 证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法, 以干扰表达载体 pART-F-R转化烟草,
经过 PCR检测, 得到 16株阳性转基因植株, 为 MsLEA3-1基因的功能研究奠定基础。
关键词: 紫花苜蓿; MsLEA3-1基因; RNA干扰; ihpRNA表达载体; 烟草转化
Construction of ihpRNA Expression Vector of MsLEA3-1 Gene from Medicago
sativa L. and Genetic Transformation in Tobacco
BAI Yong-Qin1, KANG Jun-Mei1, SUN Yan2, YANG Qing-Chuan1,*, and LI Yan1
1 Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2 College Animal Science & Technology, China
Agricultural University, Beijing 100094, China
Abstract: During long-term evolution, plant has developed various physiological functions and bio-chemical mechanisms to re-
spond the diverse stresses in different environments. Plant cell accumulates a series of proteins to reduce cell dehydration in the
period of water shortage, of all proteins, late embriogenesis abundant LEA protein has been paid attention, which is one of the hot
topics in plant stress physiology. In the paper, an RNAi expression vector harboring MsLEA3-1 gene fragment from Medicago
sativa L. was constructed. On the basis of the sequence of Medicago sativa LEA protein (MsLEA3-1) gene (GenBank accession
number: EU665182), two pairs of specific primers containing different enzyme sites were designed. With the template of
PMD-LEA plasmid constructed, positive-sense strand and antisense strand were obtained, which were separately inserted into the
expression vector pART27. The RNAi vector pART-F-R containing a hairpin structure was confirmed by the digestion of restric-
tion enzymes. pART-F-R was transformed into tobacco by Agrobacterium-mediated transformation system. PCR testing showed
that 16 transgenic plants were obtained.
Keywords: Medicago sativa L.; MsLEA3-1 gene; RNA interference; ihpRNA expression vector; Tobacco transformation
RNA 干扰 (RNA interference)是一些小的双链
RNA (double-stranded RNA dsRNA)高效、特异地阻
断体内特定基因表达, 促使 mRNA 降解, 使细胞表
现出特定基因缺陷表型的过程 [1], 是近年来生物技
术领域新兴的研究热点之一。RNA干扰被认为在作
物品质改良、基因功能研究中具有重要的应用价值,
并已在水稻、小麦、玉米等作物中得到成功应用[2-4]。
Gal 等[5]通过抑制秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis ele-
gans)中 LEA(Ce-lea-1)基因表达, 发现在干旱、热激
和渗透胁迫下线虫的存活率显著下降。RNAi技术可
可以在转录水平上抑制基因表达, 成为一种广泛用
于研究基因功能的技术。说明干扰技术具有非常重
要的应用价值。1981年 Dure等[6]在胚胎发育后期的
棉花子叶中首先发现LEA蛋白, 后来, 在包括大麦、
小麦、水稻、玉米、葡萄种子和大豆在内的 20种高
等植物中也发现 LEA蛋白。LEA蛋白在如干旱、低
温、盐胁迫、ABA、紫外辐射和 NaHCO3 等环境胁
迫条件下会大量累积, 被认为是在胁迫过程中对植
物起保护作用的物质之一[7]。因此, 对 LEA 蛋白的
研究也大量展开。
第 9期 白永琴等: 紫花苜蓿 LEA蛋白基因 ihpRNA表达载体构建及烟草转化 1485


利用转基因植物作为生物反应器生产有用蛋白,
具有比细菌、真菌和动物反应器系统更低耗能的优
点[8-10]。烟草作为基因工程的模式植物, 具有操作容
易、培养周期短、遗传转化效率高、生产成本低等
优点。并且与原核表达系统比较, 它的表达产物还
可进行正确的糖基化等转录后的修饰。紫花苜蓿是
世界上最重要的豆科牧草, 不仅营养价值高, 适口
性好, 而且具有很强的改土培肥、蓄水和保护生态
的能力, 是农牧业发展中不可缺少的牧草之一, 因
而被誉为“牧草之王”。但有限的抗性限制了其栽种
范围。因此, 本研究选择对烟草进行转基因, 并通过
RNA干扰技术研究紫花苜蓿MsLEA3-1蛋白的调控
机制, 以期为改良紫花苜蓿抗性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
中苜 1 号紫花苜蓿由中国农业科学院北京畜牧
兽医研究所育成, 本研究室保存。NC89烟草种子由
本研究室保存。先将烟草种子用 75%的酒精灭菌 10
min, 用灭菌滤纸吸干, 在 0.1%升汞(HgCl2)溶液中
灭菌 8 min, 再用无菌水洗脱 3~5次, 于灭菌滤纸上
吸干残余的水分, 接种于 1/2 MS培养基上, 于 28℃
培养箱培养。
克隆载体 pMD19-T vector 购自 TaKaRa 公司;
用于构建干扰载体的质粒 pHANNIBAL 和 pART27
为澳大利亚 CSIRO Plant Industry惠赠(构建质粒图
谱见图 1); 农杆菌菌株 LBA4404, 以及用于扩增的
克隆载体 pMD-LEA载体为本实验室保存。
实验使用的大肠杆菌菌株为E. coli DH5α和 Taq
DNA 聚合酶购自北京天根生物科技有限公司; 限制
性内切酶、T4 DNA连接酶和凝胶电泳 DNA回收试
剂盒等购自 TaKaRa公司; DNA Marker DL2000plus
购自北京全式金生物科技有限公司; 其他试剂为进
口分装或国产分析纯。
1.2 引物设计
根据 MsLEA3-1 (GenBank登录号为 EU665182)
基因的保守序列, 应用 Primer Premier 5.0设计引物
(表 1)。
其中, LEAf1和 LEAf2用于MsLEA3-1基因正向
片段扩增; LEAr1和 LEAr2用于MsLEA3-1基因反向
片段扩增; pdk1 和 pdk2 用于 pdk 内含子片段扩增;
NPTII1和 NPTII2用于卡那抗性基因的筛选。
1.3 MsLEA3-1基因片段的克隆和测序鉴定
以 LEAf1 和 LEAf2 为引物, 以含有紫花苜蓿
MsLEA3-1 基因完整开放性阅读框的 pMD-LEA(本
实验室以前构建)为模板, 扩增基因正义片段, PCR
程序为 94℃预变性 3 min; 94℃变性 30 s, 67.0~
64.5℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min, 25个循环; 72℃稳
定 1 min; 4℃保存; 以 LEAr1和 LEAr2为引物, 以
pMD-LEA为模板, 扩增基因反义片段, PCR程序为



图 1 紫花苜蓿 MsLEA3-1基因的 ihpRNA植物表达载体的结构图
Fig. 1 Construction chart of ihpRNA vector of MsLEA3-1 gene

表 1 引物序列及 PCR扩增基因片段
Table 1 Primer sequences and the amplified fragments
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequences (5′–3′)
扩增产物长度
Fragment size (bp)

LEAf1
LEAf2
F: CCGCTCGAGCCTCTAGTGTTGGTCACATTCCCTC
R: CGGGGTACCTCATCATCATCTGCATAGCTTTCGT 445

LEAr1
LEAr2
F: CCATCGATTCATCATCATCTGCATAGCTTTCGT
R: GCTCTAGACCTCTAGTGTTGGTCACATTCCCTC 445

pdk1
pdk2
F: GTGATGTGTAAGACGAAGAAGATAA
R: ATTACAAFCAGATTGGAATT 304

NPTII1
NPTII2
F: ATACCGTAAAGCACGAGGAAG
R: CTGAAGCGGGAAGGGACT 484
F表示上游引物, R表示下游引物。F and R stand for forward primer and reverse primer.
1486 作 物 学 报 第 36卷

94℃预变性 3 min; 94℃变性 30 s, 62℃退火 30 s,
72℃延伸 1 min, 25个循环; 72℃稳定 1 min; 4℃保存。
PCR 产物经琼脂糖凝胶纯化后, 连接克隆载体
pMD19-T, 连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细
胞, 重组子经 PCR 及酶切鉴定后送北京华大基因生
物技术有限公司测序。正、反义基因片段重组子分
别被命名为 pMD-F和 pMD-R。
1.4 MsLEA3-1基因 ihpRNA表达载体构建及鉴定
对重组子 pMD-F和载体 pHANNIBAL用 Xho I
和 Kpn I 进行双酶切, 将目的条带切胶回收后, 在
T4 连接酶作用下, 16℃反应过夜, 连接产物转化大
肠杆菌 DH5α 感受态细胞 , 重组子以 LEAf1 和
LEAf2为引物进行 PCR鉴定及 Xho I和 Kpn I进行
双酶切鉴定后测序鉴定 , 重组子被命名为 pHA-F;
对重组子 pMD-R和 pHA-F用 Cal I / Xba I完全双酶
切, 将目的条带切胶回收后, 在 T4 连接酶作用下,
16℃反应过夜, 连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受
态细胞, 重组子以 Cal I / Xba I进行双酶切鉴定后测
序鉴定, 重组子被命名为 pHA-F-R; 对重组子 pHA-
F-R和载体 pART27用 Not I单酶切, 将目的条带切
胶回收后, 在 T4 连接酶作用下, 16℃反应过夜, 连
接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 重组子以
pdk1 和 pdk2 为引物进行 PCR 鉴定以及分别 Not I
单酶切鉴定, 重组子被命名为 pART-F-R。
1.5 农杆菌介导的烟草转化及其鉴定
用 CaCl2冻融法将含有目的基因的 pART-F-R重
组子导入农杆菌 LBA4404中, 用于转化。选取 30 d
苗龄的烟草无菌苗叶片通过叶盘法转化。
将制备好的叶盘在 MS+6-BA (2.0 mg L–1)+ IAA
(0.5 mg L–1)培养基上, 28℃暗处共培养 2~3 d后, 用
含有 500 mg L–1的头孢霉素灭菌水溶液洗涤 3 次,
再转入含有 400 mg L–1 Cef和 50 mg L–1 Kan MS+6-
BA (2.0 mg L–1)+IAA (0.5 mg L–1)分化培养基上, 28℃
见光培养, 约 10~15 d继代 1次, 当抗性芽长到 1.0~1.5
cm时, 将其切下换到含有 400 mg L–1 Cef和 75 mg
L–1 Kan的 MS(不加激素)培养基上生根, 约 15~20 d
后生根完全, 即可移栽温室。
1.6 转化植株的 PCR检测
采用 CTAB方法提取抗性苗叶片基因组 DNA。
依次用 3 对引物扩增目的基因片段。3 对引物分别
为 LEAf1与 LEAf2, pdk1与 pdk2, NPTII1与NPTII2。
PCR 扩增程序分别为 : ①94℃预变性 3 min;
94℃变性 30 s, 58℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min, 25个
循环; 72℃稳定 1 min; 4℃保存; ②94℃预变性 3 min;
94℃变性 30 s, 67.0~64.5℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min,
25个循环; 72℃稳定 1 min; 4℃保存; ③94℃预变性 3
min; 94℃变性 30 s, 52~47℃退火 30 s, 72℃延伸 1
min, 25个循环; 72℃稳定 1 min; 4℃保存。
2 结果与分析
2.1 MsLEA3-1 基因正、反义片段克隆及重组子
鉴定
以含有 MsLEA3-1 基因完整开放性阅读框的
pMD-LEA 为模板, 以引物 LEAf1 和 LEAf2 进行正
向片段扩增, 以引物 LEAr1和 LEAr2进行反向片段
扩增, 两个 PCR扩增结果均为 445 bp。凝胶琼脂糖
电泳检测扩增产物, 得到预期大小的条带。证明扩
增正确, 电泳结果如图 2所示。
重组质粒 pMD-F 和 pMD-R 的 Xho I/Kpn I 和
Cal I/Xba I双酶切结果显示, 均可切下 445 bp的目
的基因片段(图 3), 与预期结果一致, 且质粒测序结
果正确, 表明克隆表达载体 pMD-F 和 pMD-R 构建
成功。
2.2 pHA-F质粒重组子鉴定
以待检测的 pHA-F 质粒为模板, 以引物 LEAf1
和 LEAf2 进行 PCR 扩增, 扩增产物经电泳分析为
500 bp 左右电泳条带。与预期结果一致, 电泳结果
如图 4所示。重组质粒 pHA-F用 Xho I/Kpn I进行双
酶切, 在 445 bp 处得到一条电泳条带, 与预期大小
一致, 如图 5所示, 表明 pHA-F载体构建成功。
2.3 pHA-F-R质粒重组子鉴定
以待检测的 pHA-F-R质粒为模板, 以引物 pdk1



图2 MsLEA3-1基因正、反义片段PCR产物
Fig. 2 PCR products of sense and anti-sense fragments of
MsLEA3-1 gene
M: DL2000 marker; 1: 正义片段PCR产物; 2: 反义片段PCR产物。
M: DL2000 marker; 1: PCR product of sense fragment; 2: PCR
product of anti-sense fragment.
第 9期 白永琴等: 紫花苜蓿 LEA蛋白基因 ihpRNA表达载体构建及烟草转化 1487




图3 pMD-F和pMD-R酶切鉴定
Fig. 3 Identification of recombinant vectors pMD-F and pMD-R
M: DL2000plus marker; 1: pMD-F Xho I/Kpn I双酶切;
2: pMD-R Cal I/ Xba I双酶切。
M: DL2000plus marker; 1: pMD-F digested by Xho I/ Kpn I;
2: pMD-R digested by Cal I /Xba I.



图 4 pHA-F质粒 PCR产物鉴定
Fig. 4 PCR products of pHA-F plasmid
M: DL2000plus marker; 1~4: pHA-F PCR产物。
M: DL2000plus marker; 1–4: PCR products of pHA-F.



图 5 pHA-F质粒的酶切鉴定
Fig. 5 Identification of recombinant vector pHA-F
M: DL2000 marker; 1: pHA-F Xho I/Kpn I双酶切; 2: pHA-F质粒。
M: DL2000 marker; 1: pHA-F digested by Xho I/Kpn I;
2: pHA-F plasmid.

和 pdk2进行 PCR扩增, 扩增产物大小为 304 bp。电
泳检测扩增产物, 得到预期大小的泳带, 结果如图 6
所示。重组质粒 pHA-F-R分别用 Xho I/Kpn I和 Cla
I/Xba I进行双酶切, 均在 500 bp左右得到一条电泳
条带, 与预期大小一致的条带, 如图 7所示。用 Not I
对质粒进行单酶切, 经电泳分析, 得到 3 000 bp 和
4 000 bp两条条带, 与预期大小一致的条带, 如图 8
所示。表明 pHA-F-R载体构建成功。
2.4 pART-F-R质粒重组子鉴定
以待检测的 pART-F-R 质粒为模板 , 以引物
pdk1和 pdk2进行 PCR扩增, 扩增产物大小为 304 bp,
电泳检测, 得到预期大小的泳带, 结果如图 9所示。
用 Not I对质粒进行单酶切, 在 4 000 bp左右得到条
带, 经电泳分析, 与预期大小一致, 如图 10所示。酶
切和 PCR鉴定结果表明, MsLEA3-1基因 RNAi表达
载体 pART-F-R构建成功。



图 6 pHA-F-R质粒 PCR产物电泳检测
Fig. 6 PCR products of pHA-F-R plasmid
M: DL2000 marker; 1: 正向 PCR产物; 2: 反向 PCR产物。
M: DL2000 marker; 1: PCR product of sense fragment;
2: PCR product of anti-sense fragment.



图 7 pHA-F-R酶切鉴定
Fig. 7 Identification of recombinant vector pHA-F-R
M: DL2000plus marker; 1: pHA-F-R Xho I/Kpn I双酶切;
2: pHA-F-R Cal I/Xba I双酶切。
M: DL2000plus marker; 1: pHA-F-R digested by Xho I/Kpn I;
2: pHA-F-R digested by Cal I/Xba I.
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图 8 pHA-F-R质粒经 Not I单酶切鉴定
Fig. 8 Detection of recombinant vectors pHA-F-R with Not I
M: DL2000plus marker; 1: pHA-F-R质粒; 2: pHA-F-R单酶切。
M: DL2000plus marker; 1: pHA-F-R plasmid; 2: pHA-F-R digested
by Not I.



图 9 pART-F-R质粒 PCR产物鉴定
Fig. 9 PCR products of pART-F-R plasmid
M: DL2000 marker; 1~2: pART-F-R PCR产物。
M: DL2000 marker; 1–2: PCR products of pART-F-R.



图 10 pART-F-R 经 Not I单酶切鉴定
Fig. 10 Detection of recombinant vectors pART-F-R with Not I
M: DL2000plus marker; 1: pART-F-R质粒;
2: pART-F-R单酶切。
M: DL2000plus marker; 1: pART-F-R plasmid;
2: pART-F-R digested by Not I.

2.5 pART-F-R表达载体转化烟草的鉴定
应用 PCR扩增对获得的部分抗卡那霉素烟草植
株进行初步检测。首先以基因组 DNA 为模板 , 用
Npt II 基因的引物扩增 484 bp 片段, 结果显示所有
抗性幼苗均呈阳性(图 11)。进而分别用特异性引物
扩增表达框中的特定序列, 结果也显示阳性, 扩增
产物的大小约 500 bp (图 12)。以内含子序列的特异
性引物扩增表达载体中的一段序列, 大小约 300 bp
(图 13)。PCR扩增结果证明, pART-F-R干扰载体成
功转入烟草基因组中的同时也转入了 MsLEA3-1 基
因的反向重复序列表达框。最终得到 16株转基因再
生植株。



图 11 部分转基因植株中 NptII基因检测
Fig.11 PCR products of NptII gene in transgenic plants
M: DL2000 marker; CK–: 阴性对照; CK+: 阳性对照;
1~3:转基因株系。
M: DL2000 marker; CK–: negative control; CK+: positive control;
1–3: transgenic plants



图 12 部分转基因植株中 PMD-R 片段检测
Fig. 12 PCR products of PMD-R fragment in transgenic
plants
M: DL2000 marker; CK–: 阴性对照; CK+: 阳性对照;
1~8: 转基因株系。
M: DL2000 marker; CK–: negative control; CK+: positive control;
1–8: transgenic plants.



图 13 部分转基因植株中 pdk内含子序列检测
Fig. 13 PCR products of pdk intron fragment in transgenic
plants
M: DL2000 marker; CK+: 阳性对照; 1~6: 转基因株系。
M: DL2000 marker; CK+: positive control; 1–6: transgenic plants.
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3 讨论
近年来, RNAi技术在作物遗传改良中显示出了
巨大的应用潜力。Stoutjesdijk 等[11]等利用 RNA 干
扰技术成功地在拟南芥中实现了抑制 FAD2 基因表
达的目标, 且基因抑制效果可在自带稳定传递, 明
确了 RNA 干扰在作物种子品质性状改良方面的应
用潜力。
本研究根据 RNAi 技术原理, 成功构建了具有
ihpRNA 结构的紫花苜蓿 LEA 蛋白 MsLEA3-1 基因
的表达沉默载体。在构建载体过程中, 采用 PCR 扩
增目的基因的 cDNA 片段, 扩增片段一般都在几百
bp, 彭昊等[12]选择 452 bp 的 RNAi 片段, 成功构建
了 RNAi 载体, 本文选择 445 bp 的 RNAi 片段。扩
增的正反向片段在组成型强启动子 35S和 OCS终止
子的控制下, 可以高效表达, 而且不存在插入片段
的方向性问题, 无论正反, 都能保证在植物体内形
成具有发夹结构的 mRNA。已有研究表明, 如果在
靶基因的反向重复序列间加入一段内含子序列, 使
其在植物体内转录形成 ihpRNA 发夹结构 , 与
hpRNA 相比, 沉默效果可从 55%提高到 90%, 表明
增加可拼接的内含子序列能增加 hpRNA 诱导基因
沉默的效率[13-15]。因此, 本研究在构建的 RNAi表达
载体的正义和反义片段中间插入 pdk 序列作为功能
性内含子, 以期最大限度地抑制植物体中 MsLEA3-1
基因的表达。
本研究构建的 ihpRNA高效表达载体 pART-F-R,
已采用农杆菌介导方法转化烟草, 通过 PCR 法检测
NptII 基因、MsLEA3-1 基因反向干扰片段和 pdk 内
含子的方法, 实验表明, 有 16 株转基因再生植株。
初步证明 RNAi 表达载体构建成功, 至于该 RNAi
载体能否成功抑制 MsLEA3-1 基因的表达, 还有待
进一步研究。
4 结论
构建了含有 MsLEA3-1 基因正反向干扰片段的
RNAi载体 pART-F-R, 并获得了能够高效表达 RNAi
载体的烟草转基因植株。
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