全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(1): 17−27 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由 2003 Theme 1 Budget of the Challenge Program for Water and Food和国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10Z158)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 李自超, E-mail: lizichao@cau.edu.cn
Received(收稿日期): 2009-07-14; Accepted(接受日期): 2009-09-07.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00017
水稻(Oryza sativa L.) α-淀粉酶基因的进化及组织表达模式
廖登群 1,2 张洪亮 1 李自超 1,* John BENNETT 2,3
1中国农业大学 / 农业部作物基因组学与遗传改良重点实验室 / 北京市作物遗传改良重点实验室, 北京 100193; 2 Plant Breeding,
Genetics and Biotechnology Division, International Rice Research Institute, DAPO Box 7777, Metro Manila, Philippines; 3 School of Bio-
logical Sciences, University of Sydney, NSW 2006, Australia
摘 要: α-淀粉酶在植物特别是谷类萌发种子淀粉降解中具有重要作用。水稻 α-淀粉酶基因的结构、进化和表达研
究已有报道, 但多集中于 OsAmy1和 OsAmy3这两个亚族内基因间以及发芽种子中。不同亚族间的基因结构、进化及
更多组织和时期的表达特点尚缺乏细致研究。本研究通过 TblastN 同源性比对及保守结构域分析揭示水稻基因组含
有 11个α-淀粉酶基因。生物信息学分析、系统进化树构建及半定量 RT-PCR分析表明, 该家族基因在结构上发生了
明显的分化, 具有清晰的进化层次, OsAmy5A 和 OsAmy4A 是家族中较原始状态的基因; 在表达和功能上也发生了明
显分化, 进化水平较高的基因发生了明显的时空表达特异性分化。OsAmy1A、OsAmy3A及 OsAmy3D 和 OsAmy3E 分
别在保证种子植物世代传递、维持种子休眠过程中胚的微弱生命活动及保证种子萌发过程中能量的稳定持续供应上
具有重要作用。
关键词: 水稻; α-淀粉酶; 基因结构; 进化; 表达
Characterization of Evolution and Tissue-Expression of Rice (Oryza sativa L.)
α-Amylase Genes
LIAO Deng-Qun1,2, ZHANG Hong-Liang1, LI Zi-Chao1,*, and John BENNETT 2,3
1 China Agricultural University / Key Laboratory of Crop Genomics & Genetic Improvement of Ministry of Agriculture / Beijing Key Laboratory of
Crop Genetic Improvement, Beijing 100193, China; 2 Plant Breeding, Genetics and Biotechnology Division, International Rice Research Institute,
DAPO Box 7777, Metro Manila, Philippines; 3 School of Biological Sciences, University of Sydney, NSW 2006, Australia
Abstract: α-amylases play an important role in starch degradation in plants, especially in cereal germinating seeds. Existing re-
ports on structural organization and evolution of rice α-amylase family mainly focus on members of subfamilies OsAmy1 and
OsAmy3 and their expression in germinating seeds, however, it is not known whether the putative α-amylase genes else exist in
rice genome and what their structural organization, evolution and expression profiling look like especially among subfamilies. Via
TblastN search and conservative domain analysis, we revealed that there were 11 putative α-amylase genes in rice genome.
Through tools of bioinformatics, phylogenetic reconstruction and semi-quantitative RT-PCR, we studied the structural evolution
among these 11 α-amylase genes and their spatial-temporal expression profiling. The results showed that there was a distinctly
divergent and ranked gene structure among members of this family. OsAmy5A and OsAmy4A were the most primitive genes, and
other ones were evolved from them mainly through loss of introns and fixed more conserved domains and sequences. These genes
were also divergent in expression and function. The more primitive the genes are the less spatial-temporal specificity in gene ex-
pression they have. OsAmy5A, OsAmy4A, and OsAmy2A were expressed in all tissues, however, the rest were expressed spatially
and temporally. OsAmy1A, which was expressed at the beginning of seed germination but not all during the grain filling stage,
should serve to control energy supply between generations. OsAmy3A, both expressed dramatically at the end of grain filling and
the initiation of seed germination, should be related to sustaining life activities in embryos of dormancy seeds. OsAmy3D and
OsAmy3E were regulated at the gene expression level by sugar concentration during seed germination, and may play an important
role in stable and continuous energy supply during seed germination.
Keywords: Rice; α-Amylase; Gene structure; Evolution; Expression profiling
18 作 物 学 报 第 36卷

淀粉是地球生物能量供应的重要来源, 是许多
植物特别是禾本科植物的一种主要能量和碳骨架的
存在形式, 广泛分布于植物的根、茎、叶和种子中[1]。
储藏在这些器官中的淀粉需要通过降解才能最终被
植物本身或异养生物利用来维持各项生命活动。淀
粉的降解是一个复杂的过程, 需要一系列酶的催化
与调控, 包括 α-淀粉酶、葡聚糖水解激酶、β-淀粉酶、
α-葡萄糖苷酶等[2]。作为一种限制性内切酶, α-淀粉
酶(EC 3.2.1.1)在这一过程中具有重要作用, 水解直
链淀粉和支链淀粉的 α (1→4)糖苷键产生线性麦芽
单糖和分枝葡萄糖苷, 从而便于其他酶类参与该过
程最终将淀粉降解为生物可利用的单糖[3]。研究表
明, 该酶的活性与很多重要农艺性状(如发芽率、幼
苗活力、产量、耐冷性、耐低氧胁迫等)显著正相关
[4-7]。尽管 α-淀粉酶在淀粉降解及其参与的生命活动
中具有重要作用, 但对其研究却多数仅限于谷物类
的萌发种子(尤其大麦[8-11]和水稻[12-17])、水稻愈伤[18],
而对于其在其他器官中的表达研究较少[1,19-20]。
α-淀粉酶在绝大多数物种中含有多个基因成员,
而且存在多种同功酶。比如, 经基因克隆或注释发
现, 该家族成员在拟南芥有 3个[21]、苹果有 11个[21]、
大麦有 11个[22]、小麦至少有 22个[22]。Huang等[12-13]
通过 Southern杂交技术证明水稻基因组含有 10个 α-
淀粉酶基因。又据杂交结果及与小麦、大麦等 α-淀
粉酶基因 DNA 序列的同源性结果将这 10 个基因分
为 5 组聚为 3 类, 分别命名为 RAmy1、RAmy2 和
RAmy3, 每组基因据此被命名为 RAmy1A-1C、
RAmy2A、RAmy3A-3F。Ranjhan 等[14]通过三倍体和
限制性酶切分析及低温(65 )℃ Southern 杂交条件同
样发现了这 10 个基因, 并将其定位在 5 个染色体
上。其中, 只有 3个基因的全长 cDNA (表 1)和 7个
基因的全长基因组(RAmy1A、RAmy2A、RAmy3A-3E)
在当时被克隆测序, 而 RAmy1B只有 5端 537 bp的
序列被克隆。直到 1992 年, RAmy1C 的 5端和 3端
cDNA序列被分离[15], 全长序列却直到 2007年才由
Yoon等人克隆(NCBI核酸及蛋白数据库登录号分别
为 EU267975.1及ACA50497.1)。除 RAmy3F以外, 其
他基因的全长 cDNA 序列随着基因组测序和全基因
组的 FL-cDNA/EST 的克隆测序的大规模开展而相
继被获得(表 1), 而 RAmy3F到现在仍然无法确定。
水稻基因组测序及组装完毕使我们得以快速鉴定水
稻基因组中所有 α-淀粉酶基因 , 而大规模的全长
cDNA 和 EST 的克隆及测序, 使我们能准确预测和
分析基因的外显子和内含子的分布情况。
随着水稻 α-淀粉酶基因陆续被分离出来, 其结
构特征、进化、表达和功能分析逐渐被报道。Sutliff
等[23]研究了 RAmy3A、RAmy3B和 RAmy3C等 3个基
因的内含子特征, 并分析了其在发芽种子不同时期
以及胚愈伤中的表达 , 发现发芽后 4 d 的种子中
RAmy3B和 RAmy3C大量表达, 而 RAmy3A不表达。
Abe等[24]通过分别构建 RAmy1A 和 RAmy3E的细菌
表达系统鉴定了水稻 RAmy3E 基因适应低温的的区
段(Phe179-Trp205: α-helix-4, β-sheet-5, α-helix-5)。
Karrer 等[25]比较了 8 个水稻和 2 个大麦 α-淀粉酶基
因在发芽种子胚和糊粉层的表达情况, 发现水稻基
因在两个组织中都具有表达特异性, 其中, RAmy3A
和 RAmy2A 在两个组织中均不表达; 而大麦高等电
点和低等电点的基因具有不同的时序表达模式。
Hwang等[7]通过比较 9个水稻基因指出, Amy3亚族
的基因在缺氧条件下受糖饥饿或能量缺乏所诱导 ,
其表达可能是水稻幼苗能够在缺氧胁迫下成活和生
长的一个重要因素。Umemura等[26]和 Yu 等[15]也发
现该亚族的 RAmy3D 基因的表达受糖类似物抑制。
通过研究幼苗活力与 RAmy1A 基因表达的关系[27]、
缺氧对 RAmy1A 在发芽种子及幼苗中表达的影响[7,28]
及 RAmy1A 表达与赤霉素的关系 [29-31], 认为以
RAmy1A为代表的水稻 Amy1和 Amy2亚族的基因表
达受赤霉素诱导并受糖含量的调控。迄今, 对 RAmy1A
和 Amy3 亚族的研究较多, 而对 RAmy1B、RAmy1C
和 RAmy3A 研究较少; 且基因表达研究多集中于萌
发种子、苗期的叶片和愈伤, 而对开花后产量形成
期发育种子(授粉后 10 d 的穗子)及根系的研究仅见
Huang等[13]的报道。
本文通过生物信息方法在水稻中发现了两个具
有α-淀粉酶基因特征的新基因; 分析了它们与已报
道的 9 个基因(RAmy1A-1C、RAmy2A、RAmy3A-3E)
的结构和进化关系, 及其在水稻不同组织与时序的
表达, 尤其是开花授粉后种子发育过程中的表达特
征, 为进一步研究水稻α-淀粉酶基因的功能与进化
和调控奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 水稻 α-淀粉酶家族基因的鉴定及注释
用大麦 α-淀粉酶基因 HvAmy1 全长蛋白序列
(P00693)作为查询序列, 经 TblastN粳稻日本晴基因
组数据库(NCBI)和籼稻 93-11 基因组数据库 (http://
rice.genomics.org.cn/rice/index2.jsp)以获得可能的 α-
淀粉酶家族基因。评判 hit是否为目标候选基因的标
第 1期 廖登群等: 水稻(Oryza sativa L.) α-淀粉酶基因的进化及组织表达模式 19


表 1 水稻 α-淀粉酶 TblastN结果及分子特征
Table 1 TblastN results on α-amylase genes in the rice genome and their molecular properties
基因
Gene
克隆编号
Ref No. a
染色体及位置
Chr (cM) b
全长 cDNA编号
FL-cDNA No. c
克隆年代
Year for
cloning d
内含子数
Introns
氨基酸数
No. of AA
等电点/分子量
pI/MW
查询得分/E值
Query score/
E-value e

AP005287 447 OsAmy1A
AAAA02007456
2(138/147.9) M24286 1989 3 434 5.06/48456.54
6E–117
AP003312 202 OsAmy1B
AAAA02001616
1(71.7/181.8) AK063489* 2001 3 414 11.79/45334.19
7E–82
AP005287 447 OsAmy1C
AAAA02007456
2(138/147.9) EU267975 2007 3 428 5.07/47713.65
6E–117
AP004678 496 OsAmy2A
AAAA02020902
6(120.1/124.4) X64619 1992 3 445 5.25/48696.03
6E–139
AP005891 584 OsAmy3A
AAAA02027656
9(63/93.5) AK099330 2002 3 438 6.83/48714.38
1E–165
AP005891 584 OsAmy3B
AAAA02027656
9(63/93.5) M24941 1989 2 438 5.75/48591.54
1E–165
AP005891 584 OsAmy3C
AAAA02027656
9(63/93.5) AK101358 2002 2 437 5.83/48637.50
1E–165
AP004399 500 OsAmy3D
AAAA02025750
8(90.5/121.2) M24287 1989 2 435 5.95/47911.21
1E–165
AP004399 500 OsAmy3E
AAAA02025750
8(90.5/121.2) AK064300 2001 2 437 5.32/48707.65
1E–165
AP003408 82.8 OsAmy4A
AAAA02003743
1(123.2/181.8) AK065152 2001 12 876 5.72/98044.15
1E–14
AL607005 99.8 OsAmy5A
AAAA02013705
4(56.1/129.6) Os04g33040* EST 11 416 5.63/47339.00
1E–19
a 上表格表示粳稻 BAC/PAC克隆编号, 下表格表示籼稻重叠群编号; b 括号内/前后的数字分别表示基因所在 BAC/PAC号在染色
体的位置和染色体全长; c NCBI数据库的编号; d 全长 cDNA被克隆出的年代; e上表格表示查询得分, 下表格表示查询 E值。
a For a gene, the upper code indicates japonica BAC/PAC Acc. and the lower indicates the indica contig No.; b The number before and
after “/” means the position of BAC/PAC and the total length of the chromosome; c No. in the NCBI database; d Year for cloning FL-cDNA; e
For a gene, the upper number indicates the query score (bits), and the lower indicates the query E-value.

准为 Score>50、E值<10−4。对这些候选基因的蛋白
序列比对和 Interproscan分析发现, 在水稻基因组中
有 11个基因含有 α-淀粉酶的功能结构域特征, 即催
化 结 构 域 (PF00128) 和 Alpha-amyl_C2 结 构 域
(PF07821), 在 NCBI 数据库均被注释为和 α-淀粉酶
相关。这 11个基因中, 除前述已报道的 9个基因外,
有两个基因的功能和研究尚未报道。因此, 我们认
定这两个基因属于 α-淀粉酶家族的新成员。本文根
据目前对水稻基因的通用命名规则对这 11个基因进
行了系统命名, 对已知的 9 个基因继续采用原名称,
但用“Os”代替“R”。由于新认定的两个 α-淀粉酶基因
在用蛋白质聚类分析结果中都不归属于已知的 3组,
因此将其命名为 OsAmy4A 和 OsAmy5A。由 http://
www.expasy.org/tools/中的 Compute pI/MW软件预测
了其分子特性。水稻 α-淀粉酶基因的命名、染色体
位置及分子特性等信息见表 1。
1.2 α-淀粉酶家族基因进化分析
构建进化树时以蛋白质保守结构域序列为研究
数据 , 先用 ClustalX(1.83)比对 (http://www-igbmc.
u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/), 再用 Mega4.0构建。
在 Mega4.0 中分别选邻近距离法和 Jones-Taylor-
Thornton (JTT)模型, Bootstrap分析重复数为 1 000。
为分析水稻 α-淀粉酶基因的进化关系及历程,
选取了莱茵衣藻等低等植物基因在内的共 70 个α-淀
粉酶基因来构建进化树。通过 TblastN 或 BlastP 搜
索基因组数据库 TIGR、http://genome.jgi-psf.org/和
NCBI及 TIGR的转录子数据库获得其他植物基因的
序列。如果目标基因的基因组序列或转录子拼接体
还未翻译成蛋白序列, 则分别用在线基因预测软件
(http://www.softberry.com/berry.phtml)和 http://www.
20 作 物 学 报 第 36卷

expasy.org/tools/dna.html)来获得全长蛋白序列 , 同
时用 InterProScan 软件 (http://www.ebi.ac.uk/Inter-
ProScan/)和已知的 EST/FlcDNA 确认新注释的正确
与否。所用物种及其基因名称(及 Acc. No.), 在低等
植物中为单细胞绿藻莱茵衣藻 (Chlamydomonas
reinhardtii)的 CreAmyA1-2 (XM_001694150, XM_
001695962); Ostreococcus lucimarinus 的 OlAmy1-4
(XM_001416331, XM_001418649, XM_001420025,
XM_001421519); 最简单的多细胞团藻(Volvox car-
teri)的 VcAmy1-2 (C_230010, C_420085); 非维管束
植物球蒴藓 (Physcomitrella patens)的 PpaAmy1-4
(XM_001777531, XM_001782778, XM_001752929,
XM_001785768); 江南卷柏(Selaginella moellendorffii)
的 SelmolAmy1-4 (3332149:3, C_scaffold_2000046,
gw1.96.86.1, 3329694: 2); 在裸子植物中为火炬松
(Pinus taeda)的 PtaAmy1-2 (TA11018, TA6895); 云
杉 (Picea sitchensis) 的 PsiAmy1-2 (EF085126,
EF084978); 恩氏云杉×加拿大杉(Picea engelmannii
× Picea glauca )的 PegAmy (TA149_373101); 在双子
叶植物中为拟南芥(Arabidopsis thaliana)的 AtAMY1-3
(AY084871, AY117294, At1g69830); 葡萄 (Vitis vi-
nifera)的 VvAmy1-5 (XM_002270013, XM_002285177,
XM_002282148, XM_002276836, XM_002284769);
杨树(Populus trichocarpa)的 PthAmy1-5 (3.00400291,
3.0033012902, 3.0003010601, 3.00170485, C_LG_
X0868); 苹果 (Malus × domestica)的 MdAmy1-4
(TA46797_3750, AY939872, AY939869, AF153828);
在单子叶植物中为水稻 (表 1), 玉米 (Zea mays)的
ZmAmy1-6 (BT067363, BT043419, BT041453, EU
940907, BT042214, BT067340); 高粱 (Sorghum bi-
color)的 SbAmy1-8 (gw1.2.15565.1, Sb02g026620,
Sb02g023790, Sb03g032830, Sb04g034150, Sb04g
034140, Sb06g015110, Sb07g023010); 小麦(Triticum
aestivum)的 TaAmy 1,3-4 (TA79244_4565, X05809,
AK335373); 大麦 (Hordeum vulgare)的 HvAmy1-2
(M17128, M17125); 燕麦(Avena fatua)的 AfaAmy2A
和 AfaAmy 2D (AJ010728, AJ010729)。
1.3 总 RNA的提取及半定量 RT-PCR
1.3.1 实验材料的培养 用于研究基因时空表达
特性的组织包括胚愈伤组织、萌发的种子和根、苗
期叶片、开花前后的花药、子房等。所用品种为热
带籼稻 IR64, 由菲律宾国际水稻研究所种子库提
供。除愈伤组织和萌发种子及根外, 提供其余组织
的 IR64都在温室进行培养。在秧盘中萌发种子, 幼
苗生长 21 d后移栽到装有 3 kg土壤的盆中, 每千克
土壤分别底施 N、P和 K 0.2 g、0.1 g和 0.2 g; 每天
浇水 2 次, 以维持土壤表面被水浸没; 在孕穗期追
肥一次, 用量为底肥的 1/4。
1.3.2 实验组织的取样方法 在 N6 再生培养基
上培养 1周后收获愈伤组织, 培养基含 2.7 g L−1脯
氨酸、300 mg L−1酷蛋白氨基酸、30 g L−1蔗糖、4 g
L−1凝固剂(Gelrite)和 2 mg L−1 2,4-D (所有药品来自
Sigma Chemical Company, St. Louis MO, USA)。种子
经 50% (V/V)的次氯酸钠溶液消毒 5 min后用灭菌的
去离子水漂洗干净, 再均匀排列在用灭菌水湿润的
过滤纸上, 在 30℃下暗培养 48 h后取样。把种子和
根分开并分别迅速放入液氮中冷冻保存以防 RNA
降解。研究 OsAmy 在萌发种子中表达 time-course
的种子培养与取样同此方法。移栽 3周后, 在日落时
取主分蘖上已伸展完毕的倒第二叶。开花前 17 h、4
h 和邻近开花前(分别简写为 17hBA、4hBA 和 BA)
取花药, 小穗的开花时间以温室种植下的水稻开花
高峰上午 9:30 为起始点。为了减少取样误差, 分别
在当天/前一天已开花的小穗附近取开花前 17 h和 4
h 的小穗及开花前的小穗。取样时选取花丝伸长、
花药达到颖壳顶部但还未散粉、颖壳饱满的小穗。
花药及后面颖壳和子房的取样策略是, 先取整小穗
迅速放入液氮中冷冻保存以防 RNA降解, 最后在实
验室冰上分离所需组织用于 RNA提取。颖壳样来自
采集花药时的小穗颖壳。子房的取样中, 为避免由
于标记小穗而人工诱导小穗开花, 在正式取样前先
对开花过程中花丝伸长、花丝弯曲度、花药散粉、
内外稃张合角度等进行观察, 记录这些器官在颖壳
打开后 0、5、10、15、30、60 min的相对空间位置
和发育特征, 以此判断开花后 30 min的小穗。在开
花结束后的下午用记号笔标记当天开花的小穗, 分
别在开花后的 1、3、5、10、15和 30 d的当天上午
9:00取子房样。
1.3.3 总 RNA 的提取 对淀粉含量较高的组织
(包括萌发种子、颖壳、授粉 3 d以后的子房), 采用
SDS-RNA 提取液 (STSEM)和 Trizol 提取液 (由
Invitrogen 生产)相结合的方法提取总 RNA (http://
www.ag.arizona.edu/research/larkinslab/protocols)。其
他组织的 RNA用 Trizol提取液提取。
1.3.4 RT-PCR第一链 cDNA的合成 总 RNA经
DNase I (Promega Corporation, Madison, WI, USA)纯
化、琼脂糖电泳检测质量和定量后, 根据 Invitrogen
公司 Superscript II reverse transcriptase的方法用 0.5
第 1期 廖登群等: 水稻(Oryza sativa L.) α-淀粉酶基因的进化及组织表达模式 21


µg oligo(dT)16引物把 5 µg总 RNA反转录成第一链
cDNA。反转录所需的主要试剂 Superscript II reverse
transcriptase 和 RNAase inhibitor 分 别 购 于
Invitrogen和 Progema。
1.3.5 RT-PCR 引物设计 遵循一般的引物设计
原则 , 反向引物主要设计在 3′端的 UTR 中 ; 除
OsAmy5A 外, 前导引物都跨了 1 个内含子, 设计在
倒数第 2 个外显子上。各基因相应引物的序列、在
基因组及 mRNA水平上的扩增大小等信息见表 2。
1.3.6 PCR 及电泳 RT-PCR 的反应总体积为 20
µL, 包括：2 µL (稀释 10 倍后)第一链反转录产物,
0.5 µL 10 mmol L−1 dNTPs混合物, 10 µmol L−1引物,
1.0 U Taq-Plus DNA 聚合酶 (天根 ), 3 mmol L−1
MgCl2。PCR程序为预变性(94 3℃ min), 35个反应
循环(变性 94 30℃ s, 退火 57 1℃ min, 延伸 72 1℃
min), 循环完成后 72℃延伸 5 min, 最后 10℃保存。
内参基因为水稻 OsGAPDH。取 10 µL PCR产物在
1.2%琼脂糖上电泳分离, EtBr染色, 用 ImageMaster
VDS (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ,
USA)凝胶成像系统扫描照相。
2 结果与分析
2.1 两个 α-淀粉酶新基因的确定
TblastN 结果表明水稻基因组共有 11 个具有 α-
淀粉酶保守结构域特征的基因(表 1), 除 OsAmy4A
和 OsAmy5A外, 其余 9个基因已由美国加州大学戴
维斯分校的 Rodriguez 课题组确定[12-14]。OsAmy4A
和OsAmy5A是随水稻基因组测序完成而发现具有 α-
淀粉酶催化结构域 (PF00128)和 (Alpha-amyl_C2)结
构域(PF07821)特征的两个新基因, 分别位于 1 号和
4号染色体上, 这样水稻 α-淀粉酶基因共分布于 6条
染色体上(表 1)。位于同一染色体的同源基因表现紧
密连锁, 基因间隔 5 kb左右。除位于 9号染色体的
OsAmy3A、OsAmy3B 和 OsAmy 3C 外, 其他位于同
一染色体的基因呈反式串联排列。
新确定的 OsAmy4A 和 OsAmy5A 除等电点外,
在很多方面与已克隆的 9 个 α-淀粉酶基因不一样。
OsAmy4A和OsAmy5A分别含有 12个和 11个内含子,
氨基酸数分别为 876和 416, pI为 5.72和 5.63, MW
为 98 044.15 Da和 47 339.0 Da。Interproscan分析表
明 OsAmy4A N端的 484个氨基酸残基为未知功能的
肽段, 485~874区段含有 α-淀粉酶基因的结构域。
2.2 水稻 α-淀粉酶基因的同源性与基因结构
对OsAmy基因编码框的核苷酸和蛋白质全长序
列分别进行的同源性分析(表 3)显示, 水稻 α-淀粉酶
许多基因表现出高度同源, 而新发现的 OsAmy4A和
OsAmy5A 与其他水稻 α-淀粉酶基因的同源性较低,
在 cDNA和蛋白质水平上分别只有 50%和 45%的同
源性。其中, 如 Huang等[7]杂交结果所示, OsAmy1A
和 OsAmy1C、OsAmy3B 和 OsAmy3C 在两个水平上
都高度同源, 序列一致性都在 95%左右。本研究结
果显示 OsAmy1B 与 OsAmy1A、OsAmy1C 的核苷酸
序列一致性在 88%左右, 表现出很高的同源性; 与
其他基因同源性也较高, 序列一致性 65%以上; 但
在蛋白质一级结构水平上与其他基因的同源性最低,

表 2 用于分析水稻 α-淀粉酶基因表达特性的引物
Table 2 Primer list of rice α-amylase genes used for expression profiling analysis
基因
Gene
正向引物
Forward primer (5′–3′)
反向引物
Reverse primer (5′–3′)
扩增片段大小
Amplicon size a (bp)
OsAmy1A GCTACGCATACATCCTCACC GCTAAACTGAGAGTCTCGTCATC 322/406
OsAmy1B GCTGGTCAACTGGGTCAATC GTATCATGCCACGGTGTATATC 474/562
OsAmy1C GACCTTCATCGACAACCATG TCGCGTACATAGTTCAGATCAG 489/581
OsAmy2A GCTGTCACCTTCGTCGACAAC CGATCCCACATATCAGTGACG 532/1079
OsAmy3A CAAGGTCATTCTGGGCTACG AGCTTGCGAGCCGTTTCTAG 356/446
OsAmy3B CATCGACAACCATGACACTG CAGGCAGGTAGAATACATAG 540/640
OsAmy3C CATCGACAACCATGACACTG GTCCTGAAAGAAATATTTGGC 412/502
OsAmy3D GTCACGTTCGTCGACAACCAC GAGCATGACTATCCCGTTCAG 437/525
OsAmy3E CTTCCGACAAGGTCATGCAGG CTGCAGGATTAACAGGGTAC 538/623
OsAmy4A GCATTTACAGCCAGAGATTGC CAGGATAACCGGTGATTCTGC 472/573
OsAmy5A CGAGATCAGTCACATTTGTTG GTACTAGCATATACAGTTCG 457/957
a “/”前后分别指 cDNA /DNA 扩增片段大小。
a Number before and after “/” means length of amplicons in cDNA / genomic size.
22 作 物 学 报 第 36卷

表 3 水稻 α-淀粉酶基因的同源性
Table 3 Homology of rice α-amylase genes
基因
Gene a
OsAmy1A OsAmy1B OsAmy1C OsAmy2A OsAmy3A OsAmy3B OsAmy3C OsAmy3D OsAmy3E OsAmy4A OsAmy5A
OsAmy1A — 24.8 94.6 73.4 65.1 69.5 68.1 69.1 68.2 43.9 45.4
OsAmy1B 87.9 — 24.8 21.5 22.3 21.9 21.4 22.5 20.7 16.9 17.7
OsAmy1C 95.3 88.0 — 73.4 65.2 69.2 68.0 68.6 67.7 44.6 45.1
OsAmy2A 76.4 70.7 77.0 — 63.9 66.6 66.1 67.8 64.7 45.6 44.7
OsAmy3A 74.1 68.8 74.5 72.6 — 76.7 75.3 75.7 73.4 44.7 41.5
OsAmy3B 73.0 67.5 73.4 70.2 78.8 — 95.4 76.3 78.5 44.5 41.7
OsAmy3C 72.1 66.5 72.5 70.1 77.9 94.2 — 75.4 79.1 44.0 41.2
OsAmy3D 74.4 69.2 75.9 74.3 79.6 79.1 78.7 — 73.3 43.4 42.4
OsAmy3E 76.4 70.5 76.7 72.4 78.8 79.9 79.4 81.3 — 46.0 44.5
OsAmy4A 49.9 47.3 50.1 51.6 49.9 51.6 51.3 47.9 50.2 — 49.9
OsAmy5A 49.7 47.5 49.8 51.5 48.9 48.3 48.7 50.5 50.6 55.8 —
a 对角线上方为蛋白质, 对角线下方为 cDNA, 序列一致性(%)用 DNAMAN程序计算获得。
a the identities of protein sequences were listed above the diagonal, those of the corresponding cDNA sequences were listed below the
diagonal. The identity (%) was determined using DNAMAN program.

即使是保守序列区间的氨基酸序列(370 aa)与其他
基因的同源性也只有 20%~40%, 而其他基因间保守
序列区间的氨基酸序列同源性在 43%~98% (数据未
列出)。Huang 等[12-13]并未分析到 OsAmy1B 与其他
OsAmy在氨基酸组成上的低同源性。
对 OsAmy1B 和 OsAmy1A、OsAmy1C 编码框区
间的基因组和 mRNA 序列进行比对发现, 这 3 个基
因具有相同的基因结构, 剪切位点的核苷酸序列完
全一致, 但 OsAmy1B在编码框内发生了 3处插入突
变和 9 次缺失突变, 其中有 3 处的核苷酸缺失高达
17 bp以上(17、20和 29 bp)(图略), 使得阅读框发生
了移位, 从而蛋白质的氨基酸组成发生了很大的变
化, α-淀粉酶的保守结构域被隔断, α-amyl-C2缺失。
图 1所示为水稻 11个 α淀粉酶基因的外显子、
内含子、拼接点和某些保守结构域的情况。OsAmy4A
和 OsAmy5A的内含子远远多于其他 9个基因, 分别
有 12个和 11个, 其次为 Amy1亚家族的 3个基因以
及 OsAmy2A和 OsAmy3A, 有 3个内含子, Amy3亚家
族的其他 4 个基因全都具有 2 个内含子。对所有基
因拼接点两侧氨基酸和核酸序列的比对表明, 有 7
个拼接点在两个以上的基因中具有保守的序列和位
置, 但没有 1 个拼接点在所有基因中都保持有效。
除上述 7个以外的拼接点中, OsAmy4A和 OsAmy5A
中分别有 10 个和 5 个拼接点在其他基因中是无效
的。OsAmy4A中有 4个无效拼接点, 而 OsAmy5A中
仅拼接点 7表现为无效。由于如前所述的移码现象,
OsAmy1B在 7个拼接点两侧翼 3个氨基酸的序列发
生了变化, 但是仍可以在除拼接点 3 和 4 外的 5 个
拼接点找到高度保守的氨基酸序列和对应位置。其
中, OsAmy1B 在拼接点 1 两侧翼 3 个氨基酸残基由
LFQ/GFN变为 PVS/GFQ, 拼接点 2由 GEQ/GYM变
为 ASK/ATC, 拼接点 7 由 PCI/FYD 变为 THA/SST,
拼接点 5的氨基酸是保守的(STQ/HLW), 而拼接点 6
仅保留了对应位置。7个拼接点中, 拼接点 1、6、7
在不同基因的有效性上非常保守, 而拼接点 2 具有
有效和无效拼接点的基因比例几乎相同。OsAmy5A
上的两个有效拼接点 3和 4则分别只在 OsAmy4A、
OsAmy2A和 OsAmy3A、OsAmy3E保留着无效的拼接
点保守序列。该拼接点的结果与 Huang 等[12]分析
OsAmy3A、OsAmy3B 和 OsAmy3C 的结果一致。除
上述拼接点外, 我们检查了 3 个 α-淀粉酶基因的保
守结构域β3、β7 和 loop3[32], 其序列特征分别为
TF*DNHDT、D*V*NHR 和 LY*L(*)4–5G, 分别位于
水稻 α-淀粉酶基因拼接点 2下游 108 bp处、拼接点
5上游 15 bp处和拼接点 2下游 18 bp处。11个水稻
α-淀粉酶基因在 3 个重要保守结构域表现出了严格
的保守性。但是, 这 3 个保守结构域(尤其 loop3)在
不同物种间表现出一定的变异性, 发生变异的基因
包括 3 个苹果基因(MdAmy2、MdAmy4 和 MdAmy3)
和 3 个低等的藻类植物基因(OlAmy3、OlAmy2 和
OlAmy1)。另外, 我们通过比较 18个物种 70个植物
α-淀粉酶家族基因发现了一个保守序列。该序列的
特征为 G(*)6GG(*)4LDWGP, 该序列位置附近某些
低等植物上的序列特征为 G(*) 6 G(* ) 4 W。水稻
第 1期 廖登群等: 水稻(Oryza sativa L.) α-淀粉酶基因的进化及组织表达模式 23




图 1 水稻 α-淀粉酶基因家族的外显子、内含子、拼接点和某些保守结构域
Fig. 1 Exons, introns, splice points, and conserved sites of some domains in rice α-amylase family
每个基因上面所标数字为拼接点或无效拼接点前面片段的最后一个碱基在该基因中的位置。
The number above the gene shows the position of the last base of the fragment before splice point or noneffective splice point in the gene.

OsAmy5A缺失该序列, OsAmy4A则包含与低等植物
一样的序列。上述内含子分布、拼接点的保守性以
及保守结构域的保守性 , 表现出明显的进化关系 ,
即由低等到高等内含子趋向丢失、结构域保守性增
强(具体见讨论部分)。
2.3 植物 α-淀粉酶基因的进化分析
对水稻 α-淀粉酶基因进行的结构分析表明这些
基因间发生了明显的分化。为进一步研究各基因的
进化关系, 我们收集了 18 种植物共 70 个 α-淀粉酶
基因, 利用这些基因的保守结构域氨基酸序列构建
了植物 α-淀粉酶基因的系统进化树(图 2)。由图 2可
以看出, 植物 α-淀粉酶基因表现出明显的顺序分化
关系。类群 I 由 25 个基因组成, 全部为处于进化链
最高级的单子叶植物基因, 包括水稻除 OsAmy5A和
OsAmy4A 外的 9 个基因, 并将 9 个水稻基因的 3 个
亚族 Amy1、Amy2和 Amy3分别归类到 3个亚群中。
接下去的 5 个类群沿进化树顺序依次排列, 类群 II
包括 6 个基因, 全部为双子叶植物基因; 类群 III 包
括裸子植物的 5 个基因; 类群 IV 由 7 个基因组成,
包括了在进化时间上处于裸子植物和低等植物之间
的卷柏(Selaginella moellendorffii)的 3个基因和几个
来自其他低等植物的基因; 类群 V 和 VI 分别包括
13个和 14个基因, 既有来自低等植物的基因又有来
自高等植物的基因, 并分别包含水稻的 OsAmy4A和
OsAmy5A, 以及 1个和 3个单细胞植物的基因, 类群
VI 还包括一个据认为比拟南芥基因 AtAmy1 和
AtAmy3 原始一些的 AtAmy2[21]。很多研究认为生物
在进化过程中, 内含子的数量和某些保守结构和序
列会发生有规律的变化 [33 -34]。因此 , 我们检测了
所有 70 个基因的内含子以及保守结构域(β3、β7和
loop3)和保守序列 G(*)6GG(*)4LDWGP 的情况, 结
果表明类群 I 和 II 中的基因内含子数量较少, 均为
2~3 个; 而类群Ⅴ和 VI 中的基因内含子数量较多, 多
数为 10个左右, 但 OlAmy的基因除外, 均未发现有
内含子存在; 类群 IV中的基因内含子 6~10个(同样,
OlAmy 的基因无内含子); 因裸子植物所在类群(III)
的基因缺乏基因组数据, 无法确定其内含子数量。保
守结构域和保守序列的分析结果表明, 完全由来自
高等植物基因组成的 3个类群(I、II、III)在 3个结构
域和序列上完全保守; 类群 IV 的 7 个基因中, 卷柏
24 作 物 学 报 第 36卷



图 2 植物 α-淀粉酶基因的系统进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree of viridiplantae α-amylase genes
标了点的基因中不具有保守序列 G(*)6GG(*)4LDWGP, 标了三角号的基因中同时不具有上述保守序列和结构域 loop3, OsAmy1B所在
枝被裁切为原有长度的 1/8。
The dotted genes are changed in the conserved sequence G(*)6GG(*)4LDWGP; the genes with triangle are changed in the above conserved
sequence and loop3; branch length for OsAmy1B was shortened to 1/8 of the original length.

的 3 个基因完全保守, 而两个来自单细胞植物的基
因不具有保守序列 G(*)6GG(*)4LDWGP; 类群 V 和
VI 的基因, 除 VvAmy1、CreAmyA2 和 PpaAmy3 外,
其他不管是来自高等植物还是来自低等植物的基因
均不含保守序列 G(*)6GG(*)4LDWGP, MdAmy3、
OlAmy2、MdAmy4 和 MdAmy2 等 4 个基因的 loop3
结构域也是非保守的。从以上结果可以看出, 类群 V
和 VI中的基因可能是比较原始的类型, 并依次向类
群 IV、III、II、I进化, 在该过程中发生了内含子丢
失和保守结构域及序列固定的事件。因而, OsAmy4A
和OsAmy5A可能是水稻基因组中最古老的 α-淀粉酶
基因, 其他 9个基因是新近进化来的。
综合上述水稻 11个基因的同源性、基因结构和
进化树分析 , 水稻基因可能存在以下进化关系：
OsAmy5A最原始, 在进化成 OsAmy4A时丢失了 4个
拼接点, 在丢失了 5 个拼接点并产生 1 个新的有效
拼接点后分别进化成 OsAmy2A 和 OsAmy3A, 并由
OsAmy2A 进化成 OsAmy1A 和 OsAmy1C, 并由
OsAmy1C 或 OsAmy1A 通过移码进化为 OsAmy1B;
通过 OsAmy3A进化成 OsAmy3B-3E。
2.4 水稻 α-淀粉酶的时空表达特异性
α-淀粉酶作为淀粉代谢的重要酶体系之一, 其
表达活性对淀粉代谢尤其是降解具有重要影响。图
3 表明, 所有 α-淀粉酶基因都在愈伤组织、萌发(尤
第 1期 廖登群等: 水稻(Oryza sativa L.) α-淀粉酶基因的进化及组织表达模式 25




图 3 水稻 α-淀粉酶基因在水稻不同组织及吸胀后不同时间种子中的表达
Fig. 3 Expression of rice α-amylase genes in different organs and seeds with different time after imbibition

其 24 h后)的种子中大量表达。OsAmy2A、OsAmy4A
和 O s A m y 5 A 在所有的组织中都表达 , 但只有
OsAmy5A 为较稳定的组成型表达, 即在不同萌发时
间的种子(从吸胀到吸水后 72 h)、愈伤组织、萌发种
子、根、幼苗嫩叶、开花时不同时间点的花药、颖
壳和受粉后不同时期的子房中的转录水平几乎一样,
而其他基因在表达强度上则表现出一定的组织和时
间特异性。α-淀粉酶家族唯一具有叶绿体信号肽的
OsAmy4A在愈伤组织、嫩叶、颖壳和子房中表达量
一样, 呈较强的组成型表达。OsAmy4A 在生长旺盛
或需要较多能量供应的组织中表达较强, 比如快要
开花的成熟花药中表达量明显上调, 在授粉后子房
发育前期以及吸水 12 h后的种子中有较强表达; 但
在其他生命活动较弱的组织中则表达较弱, 如在萌
发种子早期、根和 15 DAA、30 DAA子房中表达量
明显较少。OsAmy2A 虽在所有组织都表达, 但主要
在开花后 0.5 h、1 DAA、10 DAA的子房中表达量
较高。除上述 3 个基因外, 其他 α-淀粉酶基因的表
达具有非常强的组织特异性。OsAmy1A、OsAmy3B
和 OsAmy3C具有类似的表达特点, 在愈伤组织、萌
发的种子和根中大量表达; 但在萌发的种子中三者
开始表达的时间不同, OsAmy1A 从萌发开始便有较
弱表达并逐渐增强, 而 OsAmy3B 和 OsAmy3C 则在
种子吸水 2 4 h 后才大量表达。核苷酸序列与
OsAmy1A、OsAmy1C 高度同源的 OsAmy1B 只在愈
伤组织、萌发的种子中大量表达, 在萌发种子中开
始表达的时间与 OsAmy3B 和 OsAmy3C 类似。
OsAmy1C 除了与 OsAmy1A 同样在愈伤组织、萌发
的种子和根中大量表达外, 还在花药中表达, 但表
达相对较弱。OsAmy3A和 OsAmy3E在种子发育后期
被诱导大量表达, 而 OsAmy3D 只有微弱表达; 在萌
发种子中 , OsAmy3A 在一开始便有高水平的表达 ,
并有减弱趋势, 这解释了为什么 Sutliff 等[23]在发芽
后 4 d 的种子中没有检测到该基因的表达, 这可能
与其取样时间较晚有关。
3 讨论
3.1 α-淀粉酶基因家族的结构进化
多基因家族这一现象普遍存在于真核生物中 ,
其进化规律和动力的研究对于我们理解生物的进化,
以及实现对基因的调控与改造具有重要意义。α-淀
粉酶基因家族在微生物、动物和植物中广泛存在[35],
可见是一个非常古老的多基因家族。近年来, 对该
家族基因的结构特征及进化分析一直没有间断过 ,
但是, 主要集中于对第一(Amy1)和第三(Amy3)亚族
内基因的分析[12-13], 而对包括新确立的 OsAmy4A和
OsAmy5A在内的各亚族 α-淀粉酶基因间的结构特点
和进化关系知之甚少。
本研究对来自 18 种植物共 70 个 α-淀粉酶基因
的系统分化分析结果表明, 该基因家族形成 6 个类群,
26 作 物 学 报 第 36卷

从类群 I到类群 VI呈现出明显由高等到低等的分化
关系, 即从完全的单子叶植物, 到双子叶植物、裸子
植物、低等维管束植物。类群 V和 VI虽然从来源上
看包括了从单细胞植物到高等的单子叶植物, 但是,
这两个类群内有些基因不具有保守功能域 loop3 的
结构, 绝大多数基因不具有完全由高等植物组成的
类群中基因的保守序列 ; 而且 , 被认为较原始的
AtAmy2[21]也在类群 VI中。可见, 这两个类群的基因
是比较原始状态的基因。对不同类群的内含子数检
测表明, 在这两类原始基因中, 除单细胞藻类基因
(OlAmy)不具有内含子, 大多数基因都具有比高等植
物基因较多的内含子。原始类型的水稻 OsAmy4A和
OsAmy5A 就分别含有 12 个和 10 个内含子, 明显多
于其他 9 个水稻 α-淀粉酶基因。这一结果与 Huang
等[12]对水稻 α-淀粉酶基因 OsAmy3 亚族的研究结果
一致, 也支持 Doolittle 等[36]认为进化过程以内含子
丢失为主的观点。
保守结构域和保守序列是多基因家族的重要特
征之一, 也是家族内各成员行使类似功能的主要基
础。本研究表明, 进化水平较高的高等植物基因具
有较多的结构域和保守序列, 从而, 形成比较复杂
的表达体系, 以满足高等生物对复杂生命活动系统
调控的需要。11 个水稻 α-淀粉酶基因中, 越是原始
的基因, 其表达的时空特异性越弱, 比如 OsAmy4A
和 OsAmy5A 在各组织和时期的表达基本没有差异;
而进化水平较高的基因(如 OsAmy1A、1C、OsAmy3B、
3C、3D和 3E等)则表现出明显的组织特异性。由此,
我们认为复杂结构域和保守序列的形成和固定是高
等生物维持复杂生命活动的基础。
3.2 α-淀粉酶基因家族功能的分化
功能的分化与专化是多基因家族的重要特征之
一。本研究中, 11 个水稻 α-淀粉酶基因表现出了明
显的时空表达上的分化。主要表现为, 越是原始类
型的基因其表达的特异性越弱, 而进化水平较高的
基因特异性表达较强。其中, 最原始的 OsAmy5A在
所研究的不同组织和不同萌发时间的种子间几乎观
察不到表达上的差异; OsAmy4A和 OsAmy3A虽在所
有检测的组织中都表达, 但其表达的强度已经发生
了分化; 其他分化水平更高的基因, 则表现出了明
显的时空表达特异性。
OsAmy4A在生长旺盛或需要较多能量供应的组
织中表达较强, 比如快要开花的成熟花药表达量明
显上调, 在授粉后子房发育前期以及萌发种子 12 h
后有较强表达; 但在其他生命活动较弱的组织则表
达较弱, 如在萌发种子早期、根和 15 DAA、30 DAA
子房中表达量明显较少。OsAmy4A的这种组织表达
差异性模式说明, 该基因对于快速降解淀粉提供组
织所需能量具有重要作用。
Sugimoto等[31]研究认为, OsAmy1A受 GA3诱导
表达 , 萌发时 , 首先起始于种子内的鳞片组织 , 然
后在靠近胚的糊粉层表达。Hwang 等[7]的研究表明
OsAmy1A的表达会受到缺氧胁迫的抑制。本研究中
OsAmy1A 在种子形成过程中始终没有表达, 但在种
子萌发开始便有表达, 说明该基因具有在需要储藏
淀粉的组织中及逆境条件下受到抑制, 从而避免在
非适宜条件下淀粉降解造成能量损耗; 当种子接收
到水分信号等类似适宜萌发的信号后迅速启动淀粉
降解, 开始下一个世代的生长发育。因此, OsAmy1A
在保证种子植物世代传递上具有重要作用, 对其研
究很可能对控制禾谷类作物穗发芽具有重要意义。
OsAmy3A在种子发育后期和发芽开始便大量表
达, 很可能与种子休眠过程中维持胚的微弱生命活
动有关。OsAmy3D和 OsAmy3E在发芽种子前 3 d的
中期表达量达到高峰, 但后者比前者高峰来得晚且
持续时间更长。该现象与前人研究结果一致, 认为
二者在糖损耗时受到激发, 并在糖浓度达到一定水
平时受到抑制[7,15,26]。可见, 这两个基因均受到糖浓
度的调控, 在保证种子萌发过程中能量的稳定持续
供应上具有重要作用。不过 , 我们结果显示 ,
OsAmy3D的表达峰比OsAmy3E更靠前, 但持续时间
较短 , 说明 OsAmy3D 在对糖浓度的感应上比
OsAmy3E更敏感, 且可能在代谢链上比后者靠前。
4 结论
水稻 α-淀粉酶基因家族由 11个成员组成, 是一
个非常古老的家族。该家族在结构上发生了明显的
分化, 具有清晰的进化层次。从低等到高等, 内含子
以丢失为主, 形成了更多更稳定的结构域和保守序
列。该基因家族在表达和功能上也发生了明显分化,
OsAmy5A 和 OsAmy4A 是家族中较原始状态的基因,
在表达上时空特异性较弱; 而其他进化水平较高的
基因则发生了明显的表达时空特异性分化。
OsAmy1A在保证种子植物世代传递上可能具有重要
作用, OsAmy3A 很可能与种子休眠过程中维持胚的
微弱生命活动有关, OsAmy3D和 OsAmy3E在保证种
子萌发过程中能量的稳定持续供应上具有重要作用。
第 1期 廖登群等: 水稻(Oryza sativa L.) α-淀粉酶基因的进化及组织表达模式 27


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