全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(7): 1128−1136 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2006AA100101); 国家科技支撑计划项目(2006BAD01A01-4); 广东省科技攻关计划项目
(2006A20202001, 0711124900076); 广东省自然科学基金项目(04101156)
作者简介: 柳武革(1974–), 男, 山西运城人, 硕士, E-mail: liuwuge@21cn.com
*
通讯作者(Corresponding author): 王丰(1963–), 男, 江西安福人, 博士, 研究员, 主要从事水稻杂种优势利用与分子育种研究。Tel：
020-87596584, E-mail: fwang1631@163.com
Received(收稿日期): 2007-09-25; Accepted(接受日期): 2007-12-05.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01128
利用分子标记辅助选择聚合 Pi-1和 Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病
抗性
柳武革 1 王 丰 1,* 金素娟 1,2 朱小源 3 李金华 1 刘振荣 1 廖亦龙 1
朱满山 1 黄慧君 1 符福鸿 1 刘宜柏 2
(1 广东省农业科学院水稻研究所, 广东广州 510640; 2 江西农业大学, 江西南昌 330045; 3 广东省农业科学院植物保护研究所, 广东
广州 510640)
摘 要: 以含广谱稻瘟病抗性基因 Pi-1和 Pi-2的 BL122为供体, 温敏核不育系 GD-7S为受体, 通过杂交、回交和自
交并结合分子标记辅助选择, 将 Pi-1、Pi-2 基因导入温敏核不育系 GD-7S 中, 获得 5 个携带两个抗性基因的纯合改
良不育株系。利用 34个广东代表性稻瘟病菌株接种鉴定, 5个改良株系的抗性频率为 94.12%~97.06%, 而对照 GD-7S
抗性频率仅为 17.65%; 自然病圃诱发鉴定 5 个改良株系的叶瘟和穗颈瘟均为 0 级, 表现高抗。经自然条件和人工气
候箱育性鉴定, 改良株系与对照均为无或少花粉败育类型, 自交结实率为 0, 说明不育起点温度与对照基本一致。统
计分析表明, 除剑叶长和每株穗数外, 改良株系与对照在其他农艺性状方面均无显著差异。与恢复系 L38杂交, 改良
株系的杂种 F1与对照的 F1大多农艺性状无显著差异, 说明改良株系基本保持了 GD-7S的农艺性状和配合力。
关键词: 分子标记辅助选择; 基因聚合; Pi-1; Pi-2; 两系不育系; 稻瘟病抗性
Improvement of Rice Blast Resistance in TGMS Line by Pyramiding of
Pi-1 and Pi-2 through Molecular Marker-Assisted Selection
LIU Wu-Ge1, WANG Feng1,*, JIN Su-Juan1,2, ZHU Xiao-Yuan3, LI Jin-Hua1, LIU Zhen-Rong1, LIAO Yi-Long1,
ZHU Man-Shan1, HUANG Hui-Jun1, FU Fu-Hong1, and LIU Yi-Bai2
(1 Rice Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, Guangdong; 2 Jiangxi Agricultural University,
Nanchang 330045, Jiangxi; 3 Plant Protection Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, Guangdong, China)
Abstract: Blast is one of the most serious diseases of rice worldwide, which usually leads to a sharp decline in rice production
and even results in no yield. Breeding blast-resistant varieties is one of the most effective and economical ways to control the dis-
ease. In this study, the BL122 contained two blast resistance genes Pi-1 and Pi-2 was used as gene donor to be crossed and then
backcrossed with the TGMS line GD-7S. Five improved TGMS lines with Pi-1 and Pi-2 homozygous genotype were successfully
developed through molecular marker-assisted selection. The resistance frequency of the improved TGMS lines ranged from
94.12% to 97.06%, much higher than that of the check GD-7S, which was only 17.65%, by artificially inoculating 34 representa-
tive blast isolates collected in Guangdong Province. The improved TGMS lines also displayed high resistance to leaf and neck
blast in the epidemic areas. The critical temperature of fertility transformation for the improved TGMS lines from fertile to sterile
was preliminarily identified in the phytotron with the regime of 12.5 h/23℃ and natural conditions. The results showed that the
critical temperature point for the improved TGMS lines was likely consistent with that of the check GD-7S. The statistical analysis
showed there was no significant difference in the agronomic traits between improved TGMS lines and GD-7S except the flag leaf
length and number of panicles per plant. Moreover, there was also no significant difference in most of the agronomic traits be-
tween the F1s derived from the crosses of the same restorer line L38 with both the check GD-7S and the improved TGMS lines,
respectively. All these indicated that the improved TGMS lines retained almost the same agronomic traits and combining ability as
第 7期 柳武革等: 利用分子标记辅助选择聚合 Pi-1和 Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病抗性 1129


the check.
Keywords: Molecular marker-assisted selection; Gene pyramiding; Pi-1; Pi-2; TGMS line; Blast resistance
稻瘟病是由子囊菌 Magnaporthe grisea (其无性
世代为 Pyricularia grisea) 引起的真菌性病害, 在世
界各个水稻生产国家或地区均有发生。在流行年份,
稻瘟病造成的产量损失一般为 10%~20%, 严重的可
达 50%以上, 局部田块甚至颗粒无收, 而且导致稻
米品质下降[1]。我国稻瘟病年发生面积 400 万公顷
左右, 严重年份 800 万公顷左右, 每年因稻瘟病危
害损失稻谷 2~10 亿千克[2]。实践证明, 培育与种植
抗病品种是最经济有效的防治稻瘟病措施。然而 ,
大多抗病品种推广数年后抗性会逐步丧失, 其主要
原因是大面积种植的品种往往抗病基因相对单一 ,
使得稻瘟病菌群体中的毒性小种逐渐成为优势小种,
造成病害流行。因此选育持久抗病品种是育种工作
者一贯追求的目标。研究表明, 持久抗性与多个抗
病基因协同作用密切相关。许多具有持久抗性的种
质如 Moroberekan、Tetep、IR64、三黄占等都具有
多个抗病基因[3-4]。因此聚合多个抗性基因对于培育
持久抗性品种具有非常重要的意义。
随着DNA分子标记技术的出现与迅猛发展, 利
用经典的稻瘟病遗传分析方法与分子标记技术相结
合 , 目前至少已经标记定位 50 个稻瘟病抗性基
因[4-6], 其中来源于西非粳稻品种 LAC23 的 Pi-1 和
哥伦比亚籼稻品种 5173的Pi-2基因是两个显性广谱
高抗稻瘟病基因[7-8]。Pi-1 定位在第 11 染色体长臂
末端, 位于 RFLP标记 G181和 RZ536之间[7], 刘士
平等[9]在此基础上发展了与 Pi-1 连锁的 SSR 标记
RM144, 并利用分子标记辅助选择将 Pi-1 基因导入
珍汕 97B。Pi-2 定位在第 6 染色体 RG64 和 RG612
标记之间, 遗传距离分别为 2.1 cM和 7.2 cM[8], 吴
金红等[10]和 Jiang 等[11]进一步开发了与 Pi-2 紧密连
锁的 SSR标记 AP22和 SSR140。这些以 PCR为基础、
操作简便、多态性丰富的 SSR 标记的开发, 为 Pi-1
和 Pi-2基因的分子标记辅助选择提供了理想的条件。
近年来, 我国两系杂交稻育种取得了长足的进
展, 先后育成了以两优培九、培两优 288、丰两优 1
号和扬两优 6 号为代表的两系杂交稻先锋组合在生
产上大面积推广应用。然而, 除培矮 64S外, 大多数
两系不育系的稻瘟病抗性仍然较差, 所组配出的杂
种 F1抗性也不够理想。因此改良这类两系不育系的
稻瘟病抗性具有重要意义。GD-7S 是广东省农业科
学院水稻研究所育成的优质温敏核不育系, 该不育
系粒型细长, 米质优, 分蘖力强, 株型矮直, 配合力
好, 但不抗稻瘟病。为此, 本研究期望通过杂交、回
交和分子标记辅助选择育种技术, 将抗瘟基因 Pi-1
和 Pi-2聚合到 GD-7S中, 获得具有持久稳定的稻瘟
病抗性的两系不育系, 为高产、优质、抗病两系杂
交稻的发展提供亲本材料。
1 材料与方法
1.1 水稻材料
含稻瘟病抗性基因 Pi-1 和 Pi-2 的供体亲本
BL122 是由国际水稻研究所育成的多基因累加系 ,
其遗传背景为籼稻品系 CO39, 在广东多年鉴定表
现持久高抗稻瘟病特性, 种子由广东省农业科学院
植物保护研究所提供, 受体亲本两系不育系 GD-7S
由广东省农业科学院水稻研究所育成提供。
1.2 抗性基因连锁标记
与稻瘟病抗性基因 Pi-1和 Pi-2紧密连锁的标记
分别是 RM144和AP22[9-10], 引物序列由上海生工生
物工程技术服务有限公司合成(表 1)。
1.3 分子标记检测
采用简易 SDS抽提法提取水稻幼嫩叶片 DNA。
参照 Panaud 等[12]的方法稍加修改进行 PCR。20 μL
的反应体系含 0.2 μmol L−1的正、反向引物各 1.5 μL,
200 μmol L−1 dNTP 2 μL, 10×PCR buffer (50 mmol L−1
KCl, 10 mmol L−1 Tris-HCl pH 8.3, 1.5 mmol L−1 MgCl2,

表 1 水稻稻瘟病抗性基因的连锁标记及引物序列
Table 1 Linked markers of rice blast resistance gene and their primer sequences
基因
Gene
标记
Marker
所在克隆
Clone
片段长度
Length (bp)
基序
Motif
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
Pi-1 RM144 AC134045 237 (ATT)11 F: TGCCCTGGCGCAAATTTGATCC
R: GCTAGAGGAGATCAGATGGTAGTGCATG

Pi-2 AP22 AP003522 143 (GCC)9 F: GTGCATGAGTCCAGCTCAAA
R: GTGTACTCCCATGGCTGCTC


1130 作 物 学 报 第 34卷

0.01%明胶) 2 μL, 50~100 ng的 DNA模板 2 μL, 1 U
μL−1的 Taq DNA聚合酶 0.3 μL, ddH2O 10.7 μL。反
应程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 1 min, 55℃复
性 1 min, 72℃延伸 2 min, 进行 35 个循环, 最后
72℃延伸 5 min。PCR扩增产物在 6%聚丙烯酰胺变
性测序胶上电泳分离, 银染后记录结果。其中, 受体
亲本GD-7S的纯合感病带型记为 1, BL122的纯合抗
病带型记为 3, 杂合带型记为 2。
1.4 杂交、回交与选择方案
GD-7S×BL122获得 F1, 然后以GD-7S为母本与
F1回交获得 BC1F1。由于轮回亲本 GD-7S 是两系不
育系, 其不育性受一对隐性基因控制, 在各回交世
代中会出现不育和可育株的分离。为加快改良进程,
在此后的回交过程中, 通过单株的表现和分子标记
检测结果, 在各回交世代中同时携带 Pi-1和 Pi-2两
个抗性基因且农艺性状与轮回亲本接近的可育单株
进行回交, 回交 3 代和 4 代后选择同时携带 2 个目
的基因的不育单株进行割蔸再生与冷灌 繁殖。整个
改良过程包括 1次杂交产生 F1, 4次回交和多次自交,
最后获得抗稻瘟病的 RGD-7S株系(图 1)。

2001年早季
Early season in 2001
GD-7S × BL122 杂交
Crossing
2001年晚季
Late season in 2001

GD-7S × F1 回交
Backcrossing
2002年早季
Early season in 2002

GD-7S × BC1F1 分子检测选择两个基因杂合的可育单株进行回交。
Fertile plants with two genes were backcrossed with GD-7S.
2002年晚季
Late season in 2002
GD-7S × BC2F1 结合农艺性状表现，选择两个基因杂合的可育单株继续回交。
Fertile plants with good agronomic traits and two genes were backcrossed with GD-7S.
2003年早季
Early season in 2003
GD-7S × BC3F1 选择两个基因杂合的可育单株继续回交，两个基因杂合的不育单株在广东乳源再生冷灌繁种
获得 BC3F2种子，进一步分子检测筛选纯合单株。
Backcrossed were continued. BC3F2 seeds were obtained by cold water irrigation of sterile plants with
heterozygous resistant genotype of two genes in Ruyuan, Guangdong province. Homozygous resistant
plants were screened through MAS in BC3F2 population.
2003年晚季
Late season in 2003
BC4F1 分子检测选择两个基因杂合的不育单株海南三亚再生繁种。
Sterile plants with two genes were multiplied in Sanya, Hainan province.
2004年早季
Early season in 2004
BC4F2 分子检测筛选两个基因纯合的不育单株晚季在广东乳源再生繁种。
Plants of homozygous genotype at the 2 resistant loci screened through MAS in BC4F2 population
were multiplied by cold water irrigation in Ruyuan, Guangdong province.
2005年早季
Early season in 2005
BC4F3 各株系广州种植育性检测，同时在海南三亚繁种，获得更多纯合株系种子。
Male sterility of the improved lines was identified in Guangzhou. At the same planting season, all
the improved lines were multiplied to produce more seeds in Sanya, Hainan province.

图 1 分子标记辅助选择聚合两个稻瘟病抗性基因的育种程序
Fig. 1 Breeding procedure of pyramiding two blast resistance genes by molecular marker-assisted selection

1.5 稻瘟病抗性鉴定
2006年晚季进行人工接种鉴定, 所用的 34个稻
瘟病菌株为广东近年来具有代表性的菌株, 由广东
省农业科学院植物保护研究所保存, 包括 ZA 群 2
个、ZB群 20个、ZC群 11个和 ZF群 1个。将聚合
了两个抗性基因的改良株系和原始 GD-7S 同时浸
种、催芽后播种于塑料盘中, 每个材料 20~30苗, 待
幼苗长至三叶一心期, 采用高压喷雾的方法, 用浓
度为 2×105 mL−1 的孢子悬液 (含 0.05%的粘附剂
Tween-20)接种水稻叶片, 接种后于 25℃左右的温室
培养 5~7 d, 其间定时用喷雾器喷水保持水稻叶片的
湿度利于发病。按 0~5级标准调查病情, 0~3级为抗
病, 4~5级为感病, 同时计算株系的抗性频率[13]。选
择广东省粤东北稻作区的龙川县农科所稻瘟病鉴定
圃进行自然病圃鉴定, 按国际水稻所 0~9 级的分级
标准调查叶瘟和穗颈瘟。
1.6 育性鉴定
2006年晚季对抗性改良株系和原始GD-7S同时
在自然条件下和人工气候箱中进行育性初步鉴定。
人工气候箱用于幼穗分化Ⅲ期末至抽穗的处理, 光
第 7期 柳武革等: 利用分子标记辅助选择聚合 Pi-1和 Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病抗性 1131


照 12.5 h, 温度 23 (℃ 变幅为 19~27 )℃ 。用 1% I2-KI
溶液进行花粉染色, 在显微镜下检测花粉育性。同
时对每个株系在开花前随机套袋 10穗, 30 d后统计
每穗总粒数和实粒数, 计算自交结实率。
1.7 农艺性状
2006年早季, 利用导入了 Pi-1与 Pi-2基因的 5
个抗病 GD-7S株系与感病恢复系 L38杂交获得杂种
F1代种子, 晚季将各组合的杂种 F1及 5 个改良不育
株系种植于广东省农业科学院大丰基地, 按随机区
组设计, 3次重复。常规水肥管理, 成熟后取样考查
株高、剑叶长、穗数、穗长、每穗粒数、结实率、
千粒重、单株产量等农艺性状。采用 DPS数据处理
系统分析数据[14]。
2 结果与分析
2.1 分子标记辅助选择体系的建立
利用与 Pi-1、Pi-2紧密连锁的 SSR标记 RM144、
AP22 对抗性基因供体亲本 BL122 与受体亲本
GD-7S 进行多态性分析, 结果如图 2 所示。RM144
在供体亲本中扩增出的产物较大 , 在受体亲本
GD-7S 中所扩增出的产物较小, 供体和受体之间的
带型具有明显的多态性; AP22引物在供体 BL122和
受体GD-7S中的 PCR扩增产物电泳带型之间亦有明
显的差异。
由于标记 RM144与 Pi-1基因之间仍有 6.8 cM
的遗传距离, 为了确认标记的选择效率, 选用单个
特异鉴别菌株对 F2群体接种, 从中选择 100个表现
典型感病的单株进行标记检测, 发现有 95 株表现
感病亲本标记带型, 只有 5 株发生交换, 准确率高
达 95%。同样 AP22对 Pi-2基因的选择准确率高达
97%。说明利用 RM144和 AP22分别对 Pi-1和 Pi-2
基因进行分子标记辅助选择改良 GD-7S 是完全可
行的。
2.2 各世代的分子标记选择
利用与抗性基因紧密连锁的标记对不同回交世
代进行选择, 结果如表 2 所示。在 BC1F1、BC2F1、
BC3F1和 BC4F1各个回交世代中, 杂合带型(带型 2)
与感病带型(带型 1)的分离比例均符合 1 1∶ 。由于轮
回亲本 GD-7S 是两系不育系, 其不育基因的遗传受
一对隐性基因控制, 各个回交世代会出现不育株和
可育株的分离。育种过程中筛选含有两个抗性基因
标记、农艺性状更接近 GD-7S的可育单株继续进行
回交。为了确保 2 个抗性基因的存在, 必须保证一
定规模的回交选择群体, 通常选择 2~4 个可育单株
进行回交, 同时尽可能获得更多的杂交种子。
在 BC3F1和 BC4F1两个回交群体中, 根据分子
标记检测结果、农艺性状表现和花粉育性镜检结果
分别选择了 3株和 4株完全不育单株进行稻蔸繁殖,
分别获得 BC3F2和 BC4F2不育株系种子。继续种植 3
个 BC3F2和 4个 BC4F2群体, 对这些世代进行分子标
记检测, 各个分离世代均出现 3 种带型(图 2), 即与
供体亲本相同的纯合抗病带型、抗感杂合带型和与
受体亲本相同的纯合感病带型 , 分离比例符合
1 2 1(∶ ∶ 表 3)。通过育性镜检和农艺性状观察, 筛选
获得 RGD7S-1、RGD7S-2、RGD7S-3、RGD7S-4和
RGD7S-5 等 5 个纯合抗病带型不育单株, 进一步稻
蔸冷灌繁殖, 至 2006 年早季, 5 个改良不育株系的
BC4F3代在主要农艺性状上已基本稳定。



图 2 抗性基因连锁标记在 BC4F2群体中的分离
Fig. 2 Segregation of the linkage marker for the resistance gene in BC4F2 population
P1：GD-7S; P2：BL122; 1：纯合感病基因型; 2：杂合基因型; 3：纯合抗病基因型。
P1: GD-7S; P2: BL122; 1: homozygous susceptible genotype; 2: heterozygous genotype; 3: homozygous resistant genotype.
1132 作 物 学 报 第 34卷

表 2 各回交世代群体分子标记检测分析结果
Table 2 Results of molecular marker analysis in different backcross populations
RM144 (Pi-1)

AP22 (Pi-2)

世代
Generation
编号
Code
株数
Number of plants 2a) 1a)
χ2 (1:1)
2a) 1a)
χ2 (1:1) 双基因杂合单株
Number of heterozygous plants
BC1F1 G35 104 60 44 2.46 50 54 0.15 28
BC2F1 D41 152 69 83 1.29 77 75 0.03 30
D42 189 98 91 0.26 104 85 1.91 43
BC3F1 G2 185 101 84 1.56 90 95 0.14 45
G3 208 102 106 0.08 98 110 0.69 48
BC4F1 D5 163 72 91 2.21 28+ 44+ — 28
D6 170 80 90 0.59 41+ 39+ — 41
D7 218 102 116 0.90 60+ 42+ — 60
D8 186 90 96 0.19 44+ 46+ — 44
a) 2: 表示带型 2, 杂合基因型; 1: 表示带型 1, 纯合感病基因型; +: 表示只对回交群体中 RM144 座位为杂合的单株进行标记
AP22检测的结果。
a) 2 means band type 2, heterozygous genotype; 1 means band type 1, homozygous susceptible genotype; + means the results of analysis
with marker AP22 for the plants only with the heterozygous genotypes at locus RM144 in the backcross population.

表 3 BC3F2和 BC4F2群体的分子标记检测分析结果
Table 3 Results of molecular marker analysis in BC3F2 and BC4F2 population
RM144 (Pi-1)

AP22 (Pi-2)

世代
Generation
编号
Code
株数
Number of plants 3a) 2a) 1a)
χ2 (1:2:1)
3a) 2a) 1a)
χ2 (1:2:1)
双基因纯合单株
Number of homozygous
plants
BC3F2 G17 152 33 74 45 2.00 44 80 28 3.79 8
G18 250 55 135 60 1.80 58 141 51 4.49 15
G19 201 45 98 58 1.81 61 95 45 3.15 10
BC4F2 G61 315 70 161 84 1.40 91 159 65 4.32 18
G62 210 50 99 61 1.84 63 103 44 3.51 12
G63 238 49 119 70 3.71 55 123 60 0.48 12
G64 204 56 100 48 0.71 62 101 41 4.34 10
a) 3：表示带型 3, 纯合抗病基因型; 2：表示带型 2, 杂合基因型; 1：表示带型 1, 纯合感病基因型。
a) 3 means band type 3, homozygous resistant genotype; 2 means band type 2, heterozygous genotype; 1 means band type 1, homozy-
gous susceptible genotype.

2.3 抗性鉴定
人工接种鉴定结果如表 4所示。对照 GD-7S仅
对 34 个菌株中的 6 个表现抗病 , 抗性频率仅为
17.65%; 而聚合了 Pi-1 与 Pi-2 的 5 个改良株系, 只
有 1~2 个菌系可以侵染, 其抗性频率高达 94.12%~
97.06%。其中, 菌株 01-8a对所有 5个改良株系和对
照均能侵染; 菌株 00-148a对其中 4个改良株系不侵
染, 只对 RGD7S-1和对照 GD-7S侵染。
此外 , 在龙川稻瘟病鉴定圃自然诱发鉴定中 ,
RGD7S-1、RGD7S-2、RGD7S-3、RGD7S-4和 RGD7S-
5等 5个改良株系的叶瘟和穗瘟为 0级, 而对照 GD-
7S则分别为 9级和 7级。
2.4 抗稻瘟病改良株系的育性与主要农艺性状
原始 GD-7S 属温敏核不育系, 在高温长日条件
下花粉败育类型表现为无或少花粉型。5 个改良株
系无论在人工气候箱处理条件下, 还是自然条件下,
花粉败育类型均表现为无或少花粉型, 多个视野偶
然可以看见几粒典败不育花粉, 自交结实率也全部
为 0。说明改良株系的雄性不育起点温度与原始不
育系 GD-7S 基本一致, 在华南稻区可以安全制种应
用。
对改良不育株系和对照 GD-7S 的农艺性状分
析表明(表 5), 除 RGD7S-1和 RGD7S-5剑叶变短、
RGD7S-4穗数增加, 表现与对照差异达显著水平外,
其余多数性状改良株系与对照无显著差异。
2.5 改良株系所配杂种 F1的主要农艺性状
原始不育系 GD-7S 及其聚合了 Pi-1 和 Pi-2 两
个基因的改良株系分别与恢复系 L38 杂交, 对 F1的
第 7期 柳武革等: 利用分子标记辅助选择聚合 Pi-1和 Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病抗性 1133


表 4 含 Pi-1和 Pi-2基因的改良株系及 GD-7S对广东 34个
菌株的抗性反应
Table 4 Disease reactions of improved lines with Pi-1, Pi-2,
and GD-7S to 34 blast isolates collected in Guangdong province
改良株系 Improved line
菌株
Isolate
GD-7S
(CK) RGD7
S-1
RGD7
S-2
RGD
7S-3
RGD
7S-4
RGD
7S-5
00-120a R a R R R R R
00-135a R R R R R R
00-148a S a S R R R R
00-164a S R R R R R
00-179a S R R R R R
00-309a S R R R R R
00-90a S R R R R R
01-111a S R R R R R
01-151a R R R R R R
01-165a S R R R R R
01-198a S R R R R R
01-216s S R R R R R
01-8a S S S S S S
02-52a S R R R R R
02-54a S R R R R R
04-135b S R R R R R
04-141a S R R R R R
04-145a R R R R R R
04-185a S R R R R R
04-218a R R R R R R
04-63a S R R R R R
04-77a S R R R R R
93-203a R R R R R R
93-284a S R R R R R
93-286a S R R R R R
95-59a S R R R R R
97-230a S R R R R R
97-235 S R R R R R
98-148a S R R R R R
98-1a S R R R R R
98-288a S R R R R R
98-37a S R R R R R
98-44a S R R R R R
Y-98-66a S R R R R R
可致病菌株数
No. of infected
isolates
28 2 1 1 1 1
抗性频率
Resistance
frequency (%)
17.65 94.12 97.06 97.06 97.06 97.06
a) R和 S分别表示抗病和感病。
a) R and S stand for a resistance reaction and a susceptible
reaction, respectively.
农艺性状考查结果表明(表 6), 在株高、剑叶长、穗
数、千粒重和单株产量等方面无显著差异, 只在穗
长、每穗粒数和结实率等 3 个性状方面, 部分改良
株系所配杂种与对照差异显著。如 RGD7S-2/L38的
穗长与对照 GD-7S/L38 差异达到显著水平, 表现为
穗长增长; RGD7S-1/L38 的结实率与对照 GD-7S/
L38 的差异达显著水平, 表现为结实率降低, 但单
株产量与对照无显著差异。改良 RGD7S-5/L38的每
穗实粒数比对照的每穗实粒数明显减少, 差异也达
显著水平。此外, 龙川稻瘟病鉴定圃田间抗性鉴定
表明, 5个改良株系所配杂种 F1的叶瘟和穗瘟为 0级,
而对照 GD-7S所配杂种 F1则分别为 9级和 7级。总
的来说, 导入 Pi-1、Pi-2 两个基因后对其杂种后代
主要农艺经济性状无显著影响。
3 讨论
3.1 Pi-1和 Pi-2基因的抗病特点及聚合效应
Pi-1 基因源自西非粳稻品种 LAC23, Pi-2 基因
则源自哥伦比亚籼稻品种 5173。研究表明 Pi-1 与
Pi-2 是两个显性广谱稻瘟病抗性基因。刘士平等[15]
利用来自中国、日本和国际水稻所 75个稻瘟病菌株,
发现 Pi-1和 Pi-2的抗谱分别高达 82.67%和 85.53%。
周江鸿等[16]用多个稻瘟病近等基因系和单基因系对
我国南、北方稻区 322个单孢菌株进行毒力测定, 对
Pi-2的毒力频率为 6.83%, 表现弱毒力, 而对 Pi-1的
毒力频率为 22.36%, 表现中等毒力。Chen等[17]利用
我国中南部 715 个菌株接种结果表明, Pi-1 和 Pi-2
的侵染率为 7.55%和 10.35%, 将两个基因聚合后的
侵染率仅为 1.96%。朱小源等[18]利用来自广东的 146
个稻瘟病菌株对 17 个抗稻瘟病的单基因系进行接
种鉴定, 结果携带 Pi-1 的品系 IRBL1-CL 抗性频率
为 80.1%, 而携带 Pi-2的品系 IRBLz5-CA抗病频率
为 48.6%, 但二者在对不同生理小种的抗性上具有
很好的互补效应, 并对华南稻区的抗性改良推荐选
用 Pi-1和 Pi-2基因。因此, Pi-1和 Pi-2基因在我国水
稻生产中具有重要的应用价值和较好的应用前景。
本研究利用分子标记辅助选择将 Pi-1和 Pi-2基
因聚合到感病不育系 GD-7S 中, 人工接种鉴定表明
5个改良株系抗病频率达 94.12%~97.06%, 自然病圃
叶瘟和穗瘟均为 0 级, 综合评价达高抗水平。有研
究表明, 多个抗性基因聚合后, 并不只是单个抗病

1134 作 物 学 报 第 34卷

表 5 改良不育株系和原始 GD-7S农艺性状比较
Table 5 Comparison of agronomic characters between the improved lines and the check GD-7S
性状 Trait GD-7S RGD7S-1 RGD7S-2 RGD7S-3 RGD7S-4 RGD7S-5
株高 Plant height (cm) 77.0 a 68.4 a 72. 0 a 74.6 a 68.2 a 70.6 a
剑叶长 Flag leaf length (cm) 37.7 b 33.3 a 38.0 ab 35.7 ab 36.0 ab 34.7 a
穗数 No. of panicles 10.0 b 10.3 ab 11.0 ab 10.7 ab 12.0 a 11.3 ab
穗长 Panicle length (cm) 21.5 a 22.8 a 22.0 a 20.9 a 23.7 a 23.2 a
每穗粒数 Grains per panicle 128.4 a 130.2 a 128.5 a 118.5 a 122.9 a 123.8 a
数据后带不同小写字母者差异在 0.05水平显著。
Values followed by a different small letter are significantly different at 5% probability level.

表 6 改良不育株系与对照 GD-7S所配杂种 F1的农艺性状和田间抗性表现
Table 6 Performance of agronomic characters and field blast resistance for the hybrid F1 derived from the improved lines and GD-7S
性状 Trait GD-7S/L38 RGD7S-1/L38 RGD7S-2/L38 RGD7S-3/L38 RGD7S-4/L38 RGD7S-5/L38
株高 Plant height (cm) 107.2 a 106.3 a 108.7 a 109.9 a 107.6 a 107.1 a
剑叶长 Flag leaf length (cm) 36.8 a 36.1 a 38.5 a 38.3 a 39.2 a 37.9 a
穗长 Panicle length (cm) 23.8 b 23.4 b 24.9 a 24.1 b 23.9 ab 23.5 b
穗数 No. of panicles 8.9 a 9.6 a 9.0 a 9.2 a 9.6 a 9.3 a
每穗粒数 Grains per panicle 159.3 ab 146.0 bc 168.0 a 149.4 bc 159.1 bc 136.9 c
千粒重 1000-seed weight (g) 23.80 ab 23.64 b 24.33 a 24.23 ab 24.09 ab 24.05 ab
结实率 Seed set rate (%) 90.4 a 84.4 b 90.5 a 86.7 ab 88.4 ab 86.2 ab
单株产量 Yield/plant (g) 32.3 abc 31.7 bc 35.8 a 32.2 abc 35.5 ab 29.7 c
叶瘟 Leaf blast 9 0 0 0 0 0
穗瘟 Neck blast 7 0 0 0 0 0
数据后带不同小写字母者差异在 0.05水平显著。
Values followed by a different small letter are significantly different at 5% probability level.

基因抗谱之间的简单累加, 而表现出极显著的基因
互作, 使其能够抵抗单个抗病基因所不能抵抗的多
种生理小种[15]。因此聚合了 Pi-1和 Pi-2抗性基因的
改良新不育系, 可能会具有相对稳定的持久抗病特
性。
3.2 Pi-1和 Pi-2基因不同聚合株系的抗性差异
理论上, 在相同遗传背景下导入两个相同稻瘟
病抗性基因 Pi-1与 Pi-2的所有改良株系应该对供试
的稻瘟病菌株具有相同的抗性反应。但本研究发现,
同时携带 Pi-1与 Pi-2的 5个改良株系对于其中一个
菌株 00-148a 的抗性反应并不一致。改良株系
RGD7S-2、RGD7S-3、RGD7S-4和 RGD7S-5对该菌
株表现抗病, 而其中一个株系 RGD7S-1以及原始的
GD-7S 均表现感病。进一步利用该菌株对受体
GD-7S、供体 BL122以及供体的遗传背景材料 CO39
接种鉴定 , 结果发现 GD-7S 表现感病 , 有趣的是
BL122和 CO39均表现抗病, 这说明 CO39本身就含
有对菌株 00-148a 的抗性基因, 以其为背景育成的
BL122除含有 Pi-1和 Pi-2外, 还可能含有这些抗性
基因。通过回交结合分子标记辅助选择获得的改良
株系, 其遗传背景并未完全回复到受体亲本的遗传
背景, 仍残留了部分供体亲本的片段, 且不同株系
之间残留片段的大小与多少可能不同, 从而导致不
同株系之间的抗性表现存在一定差异。因此, 笔者
推测 4 个改良株系对 00-148a 的抗性不是导入 Pi-1
与 Pi-2 引起的, 而是供体遗传背景中其他稻瘟病抗
性位点的导入产生的。
3.3 分子标记辅助选择与抗病育种
分子标记辅助选择一个重要前提是分子标记必
须与目标基因紧密连锁, 它们之间的遗传距离决定
了分子标记辅助选择的准确率, 遗传距离越小准确
率越高。本研究采用的分子标记 RM144 与 Pi-1 距
离 6.8 cM, 距离相对较远。陈志伟等[19]发展了一个
距离 Pi-1仅 1.3 cM的 SSR标记 MGR4766, 并认为
利用 MGR4766 对 Pi-1 进行选择的准确率可达到
98%~100%。本研究选用单个特异鉴别菌株对分离群
体接种, 从中选择 100 个表现典型感病的单株进行
标记检测, RM144准确率高达 95%, 利用 MGR4766
进行检测, 结果与 RM144完全一致。尽管 MGR4766
和 RM144与 Pi-1之间所报道的遗传距离差异较大,
第 7期 柳武革等: 利用分子标记辅助选择聚合 Pi-1和 Pi-2基因改良两系不育系稻瘟病抗性 1135


但根据水稻基因组的物理图谱, 推测 MGR4766 和
RM144 与 Pi-1 之间物理距离分别仅为 57 kb 和 10
kb[19], 如此近的距离使两个分子标记与目标基因间
的重组率均非常低, 从而保证了分子标记辅助选择
的准确性。
目前利用分子标记辅助选择改良水稻白叶枯病
抗性已有大量的研究报道[20-21], 而改良稻瘟病的报
道很少。王忠华等[22]设计了基于 Pi-ta基因序列的功
能分子标记, 但是该基因对我国稻瘟病菌株不具备
广谱抗性[16]。陈学伟等[23]利用农艺性状优良的G46B
与地谷、BL-1、Pi4号 3个分别含抗病基因 Pi-d(t)1、
Pi-b、Pi-ta2 的稻瘟病材料进行聚合杂交, 并利用分
子标记辅助选择在 F2代及 BC1代群体获得了含抗病
基因的植株。Hittalmani等[24]以 RFLP标记为基础通
过 MAS 对水稻稻瘟病抗性基因 Pi-1、Piz-5和 Pi-ta
进行累积。这些研究主要是侧重于分子标记的开发
和抗性基因的累加。本研究通过 1 次杂交、4 次回
交和多次自交获得 5 个高抗稻瘟病改良不育株系,
在农艺性状与配合力方面与原始不育系基本相似 ,
使分子标记辅助选择真正与抗病育种相结合, 解决
了传统育种实践难以解决的问题。
4 结论
获得 5个带有抗性基因 Pi-1和 Pi-2的纯合改良
不育株系, 比原始 GD-7S 稻瘟病抗性大幅度提高,
所配杂种 F1的稻瘟病抗性也显著提高; 改良株系的
雄性不育起点温度与原始不育系基本一致, 农艺性
状和配合力方面也基本相似。

致谢：本研究部分实验是在农业部水稻遗传改良重
点开放实验室暨广东省水稻育种新技术重点实验室
完成的, 并得到实验室研究人员的帮助, 谨致谢意。
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