全 文 ：第 30 卷 第 8 期
2004 年 8 月 　739～744 页
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
Vol. 30 , No. 8
pp. 739 - 744 　Aug. , 2004
opaque 2 基因微卫星标记与玉米籽粒赖氨酸含量的关系
姜　伟　李新海　李明顺　田清震　张世煌 3 Ξ
(中国农业科学院作物育种栽培研究所 ,农业部作物遗传育种重点实验室 ,AMBIONET中国实验室 ,北京 100081)
摘　要 　利用 opaque 2 ( o2)基因序列内的微卫星标记 phi057、phi112 和 umc1066 检测优质蛋白和普通玉米自交系 CA335
及黄早四 ,发现 phi057 是共显性标记 ,且具有明显的多态性。利用标记 phi057 对 BC1F1 回交群体 [ (CA335 ×黄早四) ×
CA335]的 224 个单株进行检测 ,两种基因型 o2o2 和 o2O2 的分离比为 1∶1124 ,符合孟德尔遗传分离比例。进一步将群体
内同一基因型 o2O2 或 o2o2 植株上的籽粒混合测定赖氨酸含量 ,发现 o2o2 基因型玉米籽粒的赖氨酸含量 (01428 %) 显著
大于 o2O2 基因型 (01334 %) 。研究表明利用微卫星标记 phi057 辅助选择玉米 o2o2 基因型 ,可以提高优质蛋白玉米的选
择效率。
关键词 　优质蛋白玉米 ; opaque 2 基因 ;微卫星标记 ;分子标记辅助选择
中图分类号 : S513
Microsatellite Marker of opaque 2 Gene Related to the Lysine Content of Maize
J IANG Wei ,LI Xin2Hai ,LI Ming2Shun ,TIAN Qing2Zhen ,ZHANG Shi2Huang3
( Institute of Crop Breeding and Cultivation , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding , Ministry of Agriculture , AM2
BIONET2China Laboratory , Beijing 100081 , China)
Abstract 　The polymorphism at microsatllite marker loci , phi057 , phi112 and umc1066 , developed in opaque 2 gene was
investigated between the line of quality protein maize CA335 and normal line Huangzao 41 The PCR and electrophoresis re2
sults indicated that phi057 was co2dominant marker and showed high polymorphism1 By using phi057 , the segeragation ratio
of two genotypes , o2o2 and o2O2 , detected among 224 individuls of [ (CA335 ×Huangzao4) ×CA335 ] BC1F1 population
was 1∶1124 , which accorded with Mendelian ratio1 The kernels of o2o2 and o2O2 derived from the backcross population
were harvested and bulked to measure the lysine content1 The average lysine content (01428 %) of o2o2 genotypes was sig2
nificantly higher than that of o2O2 genotyoes (01344 %) 1 It was suggested that the maize materials with high lysine content
would be effectively obtained by marker2assisted selection approrach with microsatellite marker phi0571
Key words 　Quality protein maize ; opaque 2 gene ; Microsatellite marker ; Marker2assisted selection
　　1964 年 ,Mertz[1 ]等首次报道 o2 隐性突变纯合
体籽粒胚乳中的赖氨酸含量比普通玉米 ( Zea mays
L1)提高近一倍 ,从此 o2 基因的利用成为玉米蛋白
质品质改良的重要方向。然而 o2 型玉米籽粒不透
明、粉质、容重低 ,收获时含水量高 ,易感穗腐病 ,阻
碍了其推广应用。Paez 等[2 ]发现胚乳修饰基因可以
把 o2 玉米籽粒的软质胚乳变成不同程度的硬质胚
乳 ,赖氨酸含量几乎不降低。含有 o2 及胚乳修饰
基因的玉米 ,被称为优质蛋白玉米 (Quality Protein
Maize ,QPM) 。自此利用胚乳修饰基因就成为改善
QPM胚乳物理性状 ,提高籽粒产量的主要手段。为
进一步提高 QPM的杂种优势和产量潜力 ,增强抗病
虫害的能力和适应性 ,育种者通常利用普通玉米种
质扩增 QPM的遗传基础 ,例如用已知的 o2 种质与
硬质胚乳的普通玉米杂交 ,再通过回交和分离 ,选育
QPM自交系 ,其关键环节是如何监测育种材料的赖
氨酸含量。采用物理或生化技术测定赖氨酸含量 ,
要在籽粒收获以后取样分析 ,技术繁杂且费用昂贵 ,
无疑增加了 QPM的育种难度。近年来 ,随着分子生
物学技术的发展 ,分子标记辅助育种成为可能。包
劲松[3 ]利用引物 484/ 485 对龙特甫 A ×371 群体的
36 个 F2 单株进行 Wx 微卫星 (CT) n 检测 ,发现淀粉Ξ基金项目 :亚洲开发银行玉米生物技术协作网 (AMBIONET)和国家 863 计划 (2003AA207070)项目资助。
作者简介 :姜伟 (1978 - ) ,女 ,内蒙古人 ,硕士 ,研究方向 :玉米分子生物学　3通讯作者 (Author for correspondence) :张世煌。
Received(收稿日期) :2003205207 ,Accepted (接受日期) :20032102201

品质与 Wx 基因有关 ;利用该微卫星标记进行标记
辅助选择 ,可以改良稻米的淀粉品质。梁荣奇[4 ]利
用 Wx 基因分子标记辅助选择糯性小麦 ,加速了糯
性小麦的育种进程。而 o2 基因的分离与克隆 ,为
采用分子标记辅助选择 ,进而选育 QPM 材料提供了
条件。Schmidt [5 ]和 Motto [6 ] 利用转座子 SPM 和 AC
调出了 o2 基因 ;Maddaloni [7 ]克隆了 o2 基因的全序
列。Kata [8 ]建立了 o2 基因的 RFLP 标记辅助选择系
统 ,能够准确地鉴定 o2o2、o2O2 和 O2O2 基因型个
体 ,从而提高了选择效率。Pioneer 公司在 o2 基因
序列内开发出两对微卫星标记 phi057 和 phi112[9 ] ,
Missouri 大学开发出微卫星标记 umc1066[10 ] ,并将其
扩增片段定位在第 7 条染色体的短臂上。然而 ,利
用微卫星标记辅助选择 o2 基因 ,进而分析赖氨酸
含量的研究尚未见报道。本研究利用 o2 基因序列
内的微卫星标记 phi057 检测 BC1F1 回交群体
[ (CA335 ×黄早四) ×CA335 ]的 224 个单株基因型 ,
比较分析群体内 o2O2 杂合基因型和 o2o2 纯合基因
型个体籽粒赖氨酸含量的差异 ,进而探讨用该标记
对 o2o2 基因型进行选择 ,改良玉米籽粒赖氨酸含量
的可行性。　　　　
1 　材料和方法
111 　材料
　　选用 QPM 自交系 CA335 和普通玉米自交系黄
早四 ,配制 BC1F1 回交群体 [ ( CA335 ×黄早四) ×
CA335 ]。2002 年春 ,将回交群体种植于北京中国农
科院试验农场 ,群体为 600 株。随机选取群体内的
224 个单株 (编号为 1～224) ,于 4～5 叶期提取单株
叶片 DNA ,并用 o2 基因的微卫星标记进行检测。
单株自交后 ,选取杂合 o2O2 基因型和纯合 o2o2 基
因型个体各 30 个果穗 ,每穗取 100 粒 ,籽粒混合后
测定赖氨酸含量。
112 　赖氨酸含量测定
籽粒磨碎后过 80 目的细筛。采用 GB 5497285
粮食、油料检验水分测定法测定水分。利用
Biochrom 20 氨基酸自动分析仪测定赖氨酸含量 ,每
份样品测定 2 次 ,求平均值。
113 　微卫星标记分析
11311 　微卫星引物　　phi057 引物 :由 Pioneer 公司
开发 ,微卫星为 ( GCC) n ,序列为 :
phi0572F :5′2CTCATCAGTGCCGTCGTCCAT23′
phi0572R :5′2CAGTCGCAAGAAACCGTTGCC23′
phi112 引物 : 由 Pioneer 公司开发 , 微卫星为
(AG) n ,序列为 :
phi1122F :5′2TGCCCTGCAGGTTCACATTGAGT23′
phi1122R :5′2AGGAGTACGCTTGGATGCTCTTC23′
umc1066 引物 :由 Missouri 大学开发 ,微卫星为
( GCCAGA) n ,序列为 :
umc10662F :5′2ATGGAGCACGTCATCTCAATGG23′
umc10662R :5′2AGCAGCAGCAACGTCTATGACACT23′
11312 　DNA 提取、PCR 扩增及电泳检测 　　采用
CTAB 法提取 224 个单株叶片 DNA[11 ] 。PCR 反应液
10μL ,包括 60 ng DNA ,0115 mmol/ L dNTP ,215 mmol/
L MgCl2 ,1 ×buffer ,0125μmol/ L 引物 ,甘油 10 % ,015
U 的 Taq 聚合酶。将反应液混匀 ,加入 10μL 矿物
油覆盖 ,在 PCR 仪 (MJ PIC2200) 上扩增。反应热程
序为 :94 ℃变性 5 min ;94 ℃1 min ,60 ℃2 min 和 72 ℃
2 min ,反应 35 个循环 ;最后在 72 ℃下延伸 5 min ;
4 ℃下保存 ,备用。电泳和银染程序参照 CIMMYT应
用生物技术中心实验流程[11 ] 。
2 　结果与分析
211 　亲本多态性检测
　　利用 3 对微卫星引物对 CA335 和黄早四进行
PCR 扩增 ,电泳结果显示 phi057 和 phi112 引物的扩
增片段呈清晰的多态性 ,而 umc1066 未检出多态性
(图 1) 。其中 ,phi057 是共显性标记 ,phi112 是显性
标记 ;因此 ,选取 phi057 引物用于回交群体的单株
标记基因型分析。
图 1 利用 3 对微卫星引物检测 CA335 和
黄早四之间的遗传多态性
Fig11 The polymorphism at marker loci phi057 , umc1066 and
phi112 detected between CA335 and Huangzao 4
1 :黄早四 (Huangzao 4) ;2 :CA335。
212 　回交群体[ ( CA335 ×黄早四) ×CA335] BC1 F1
的单株微卫星标记检测
　　利用 phi057 引物对回交群体的 224 个单株进行
PCR 扩增 ,在变性聚丙烯酰胺凝胶上将扩增产物二
次点样 (两次间隔 10 min) ,图 2 为 60 个单株标记基
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因型检测结果。与 CA335 带型一致的应为纯合隐
性基因型 o2o2 ,与 F1 带型相同的为杂合基因型
o2O2 单株。60 个单株基因型统计结果见表 1。对
回交群体 224 个单株进行标记基因型分析 ,发现有
96 个单株的带型与 CA335 一致 ,为纯合 o2o2 基因
型个体 ; 119 个单株的带型与 F1 代一致 ,为杂合
o2O2 基因型个体 ;9 份材料未产生扩增带。两种基
因型 ( o2o2 和 o2O2) 的比例是 1∶1124 ;经卡平方检
验 ,符合 1∶1 的分离比例 ( P < 0105) ,表明该 BC1F1
群体的 o2o2 纯合基因型与 o2O2 杂合基因型的比例
符合孟德尔分离定律 (表 2) 。
图 2 回交群体[ ( CA335 ×黄早四) ×CA335]的 60 个单株两次点样的标记基因型谱带
Fig12 Profiles of 60 individuals from BC1F1 population [ ( CA335 ×Huangzao 4) ×CA335] amplified by phi057 ( Sample loaded two times)
H:黄早四 (Huangzao 4) ;F :CA335 ×黄早四 (Huangzao 4) ;C :CA335 ;1～60 :群体内单株编号 ( Individual No1) 。
表 1 回交群体[ ( CA335 ×黄早四) ×CA335]的 60 个单株基因型分析
Table 1 Genotype of 60 individuals from BC1F1 population [ ( CA335 ×Huangzao4) ×CA335]
单株编号
Individual No1 单株基因型Genotype 单株编号Individual No1 单株基因型Genotype 单株编号Individual No1 单株基因型Genotype
1 o2o2 21 o2O2 41 o2O2
2 o2o2 22 o2O2 42 o2o2
3 o2o2 23 o2o2 43 o2o2
4 o2O2 24 o2o2 44 o2o2
5 o2O2 25 o2o2 45 o2o2
6 o2O2 26 o2O2 46 o2O2
7 o2o2 27 o2o2 47 o2O2
8 o2o2 28 o2O2 48 o2O2
9 o2o2 29 o2o2 49 o2O2
10 o2O2 30 o2O2 50 o2o2
11 o2o2 31 — 51 o2O2
12 o2o2 32 o2O2 52 o2o2
13 o2o2 33 o2O2 53 o2o2
14 o2o2 34 o2o2 54 o2O2
15 o2o2 35 o2O2 55 —
16 o2o2 36 o2o2 56 o2O2
17 o2O2 37 o2O2 57 o2o2
18 o2o2 38 o2O2 58 o2o2
19 o2O2 39 o2O2 59 o2O2
20 o2O2 40 o2O2 60 o2O2
　　注 :“—”:无扩增带型。Note :No amplification product1
表 2 [ ( CA335 ×黄早四) ×CA335]群体内两种基因型 ( o2O2 和 o2o2) 的分离比例分析
Table 2 Segregation of genotypes o2O2 and o2o2 in BC1F1 population [ ( CA335 ×Huangzao 4) ×CA335]
回交群体
BC1F1 population
基因型
Genotype
o2O2 o2o2
植株总数
Total individuals
观察比例
Observed ratio
理论比例
Expected ratio
卡平方测验
Chi2 test
(CA335 ×Huangzao 4) ×CA335 119 96 215 1∶1124 1∶1 P < 0105
213 　微卫星标记基因型个体与赖氨酸含量的关系
　　将用微卫星标记 phi057 在回交群体 [ (CA335 ×
黄早四) ×CA335 ]内检测出的杂合 o2O2 基因型和
纯合 o2o2 基因型个体自交。每种基因型各随机选
取 30 个果穗 ,每穗 100 粒 ,籽粒混合后 ,测定赖氨酸
含量 (表 3) ,并将其按升序排列作成折线图 (图 3) 。
由表 3 和图 3 可见 ,30 个 o2O2 杂合基因型全籽粒
957　8 期 姜 　伟等 : opaque 2 基因微卫星标记与玉米籽粒赖氨酸含量的关系 　　　

赖氨酸含量变幅为 0127 % ～ 01445 % ( 均值为
01334 %) ,30 个 o2o2 基因型全籽粒赖氨酸含量变幅
为 0138 %～0150 % (均值为 01428 %) 。两种基因型
的全籽粒赖氨酸含量存在极显著差异 (表 4) 。分析
还发现 ,含有 o2 基因的玉米 ( o2o2 和 o2O2) 籽粒赖
氨酸含量明显高于普通自交系黄早四 ( O2O2 )
(0128 %) 。
表 3 回交群体[ ( CA335 ×黄早四) ×CA335]内 30 个 o2o2
和 30 个 o2O2 单株全籽粒赖氨酸含量
Table 3 Lysine content of each of 30 individuals with
o2o2 and o2O2 genetypes from BC1F1population
[ ( CA335 ×Huangzao4) ×CA335]
o2o2 个体
o2o2 genotype
o2O2 个体
o2O2 genotype
赖氨酸含量
Lysine content
赖氨酸含量
Lysine content
赖氨酸含量
Lysine content
赖氨酸含量
Lysine content
0140 0145 0135 0136
0150 0138 0135 0137
0141 0142 0134 0139
0138 0142 0132 0142
0144 0139 0132 0141
0139 0144 0128 0136
0141 0149 0131 0138
0148 0145 0127 0144
0146 0145 0129 0136
0148 0148 0131 0132
0140 0145 0133 0131
0140 0143 0130 0128
0140 0138 0128 0130
0140 0143 0133 0130
0140 0143 0132 0132
图 3 回交群体[ ( CA335 ×黄早四) ×CA335]内 30 个 o2o2
和 30 个 o2O2 单株全籽粒赖氨酸含量的比较
Fig13 Comparison of lysine content of each of 30 individuals
with o2o2 and o2O2 genetypes from BC1F1 population
[ ( CA335 ×Huangzao4) ×CA335]
表 4 30 个 o2o2 和 30 个 o2O2 基因型个体
全籽粒赖氨酸含量的差异显著性测验
Table 4 Difference test of lysine content between
30 o2o2 and 30 o2O2 genetypes
基因型
Genotype
平均值
Average
( %)
差异显著性 3
Difference test
o2o2 01428 a 　　A
o2O2 01334 b 　　B
　　注 :a , b 和 A , B 分别表示在 0105 和 0101 水平上差异显著。
Note :Significant at 0105 and 0101 probability level , respectively1
3 　讨论
在 o2 基因序列内开发出的 3 对微卫星标记中 ,
phi057 和 phi112 在 QPM 自交系 CA335 和普通自交
系黄早四之间呈多态性 ,而 umc1066 未呈现多态性 ,
因此 phi057 和 phi112 能够区分 o2o2 和 o2O2 或
O2O2 基因型 ,可以作为连锁标记用于 o2 基因的辅
助选择。导致 umc1066 不能区分出 o2o2 和 o2O2 或
O2O2 基因型的原因可能与其引物的 PCR 扩增和电
泳条件或实验材料的遗传背景有关。这种现象有待
进一步研究。在本实验中 ,phi112 为显性标记 ,可以
在[ (CA335 ×黄早四) ×CA335 ]回交群体中区分出
o2O2 杂合与 o2o2 纯合基因型。但是 , o2o2 纯合基
因型个体产生的真实缺失带容易与实验操作差错导
致的无扩增带相混淆 ,因此最好使用共显性标记
phi057。该标记能明确地将 [ ( CA335 ×黄早四) ×
CA335 ]回交群体内 o2O2 和 o2o2 基因型区分开。进
一步在更多的 QPM 和普通玉米自交系及其杂种 F1
代中采用 phi057 引物扩增 ,均发现其扩增片段呈现
较好的遗传多态性 ,稳定地表现为共显性。因此 ,作
者认为在由 QPM 和普通玉米自交系组配的群体中
选育 o2o2 纯合基因型个体时 , phi057 应是首选
标记。
利用标记 phi057 检测 [ ( CA335 ×黄早四) ×
CA335] 群体的 224 个单株基因型 ,发现 o2o2 与
o2O2 基因型的分离符合孟德尔分离定律。尽管本
实验检测的是 BC1F1 代植株基因型 ,而用于赖氨酸
含量测定的是 BC1F2 代籽粒 (其中已含有 25 %的
o2o2 基因型个体籽粒 ,而这不能在 BC1F1 代分开) ,
但分析结果显示 o2o2 纯合基因型的平均籽粒赖氨
酸含量 ( 01428 %) 显著高于 o2O2 杂合基因型
(01334 %) 。由于标记 phi057 中的微卫星 ( GCC) n 是
o2 基因序列内的一部分 ,因此对标记的选择实际上
就是对 o2 基因本身的直接选择。因此 ,利用微卫
星标记 phi057 ,可以有效地辅助选择 o2o2 基因型个
体 ,进而提高籽粒赖氨酸含量。
AMBIONET2中国实验室利用标记 phi057 建立了
优质蛋白玉米 o2 基因的分子标记辅助选择技术。
一天内可以检测 200 个植株的标记基因型 ,用以在
苗期决选 o2o2 纯合基因型。此项技术相对简单、快
速、准确 ,不仅减少了后期的田间工作量 ,更重要的
是省去了测定赖氨酸含量的昂贵费用 ,为育种者在
早代或更大群体范围内选择目标基因型提供了技术
067 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

可行性。o2 基因分子标记辅助选择技术的建立将
明显促进优质蛋白玉米育种发展。
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会讯
第十五届国际植物营养大会会议通知
第十五届国际植物营养大会定于 2005 年 9 月 14 - 19 日在北京举行 ,本次大会主题是植物营养在食品安
全、人体健康和环境保护中的作用。大会设有肥料与作物生产、养分循环及其对生态系统的影响等 10 个专
题 ,详情请参看大会专题网站 :www. ipnc15. com。报名联系 E2mail : registration @ipnc15. com。报名截止时间 :
2004 年 9 月 30 日。通讯地址 : (100094) 北京圆明园西路中国农业大学西区资源与环境学院。联系人 :米国
华 ,吴华杰。电话 :010262893423。
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