全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(10): 1771−1778 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX001-003, 2009ZX08009-007B)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 傅彬英, E-mail: fuby@caas.net.cn, Tel: 010-82106698
第一作者联系方式: E-mail: wuhuimin86@126.com, Tel: 010-82105855
Received(收稿日期): 2011-03-14; Accepted(接受日期): 2011-06-25; Published online(网络出版日期): 2011-07-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110728.1000.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01771
水稻基因 OsASIE1抗逆功能分析
吴慧敏 黄立钰 潘雅娇 靳 鹏 傅彬英*
中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源和遗传改良国家重大科学工程, 北京 100081
摘 要: 作为重要的植物转录因子家族, AP2/EREBP 转录因子在植物发育、激素、病原反应及非生物胁迫如干旱、
高盐、低温应答方面起重要作用。本研究发现水稻 AP2/EREBP 转录因子家族 EREBP 亚家族成员 OsASIE1 (abiotic
stress induced EREBP gene)在水稻受到高盐、干旱胁迫时表达量迅速提高, 并且在水稻中超表达 OsASIE1能够改善水
稻抵抗盐胁迫的能力。凝胶迁移率检测(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)表明, 该转录因子的 AP2结构域能
够结合干旱应答顺式作用元件 DRE (dehydration-responsive element)和乙烯应答元件 GCC box (ethylene response ele-
ment), 推测 OsASIE1可能通过结合 DRE和 GCC box 作用元件调控下游相关基因的表达, 进而调控相关抗逆反应。
关键词: 水稻; AP2/EREBP转录因子; EMSA; 耐盐; 超表达
Function Analysis of Gene OsASIE1 Responding to Abiotic Stresses in Rice
WU Hui-Min, HUANG Li-Yu, PAN Ya-Jiao, JIN Peng, and FU Bin-Ying*
Institute of Crop Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100081, China
Abstract: AP2/EREBP transcription factors play an important role in plant development, hormone response, biotic and abiotic
stress responses. We identified that OsASIE1, a member of EREBP subfamily of AP2/EREBP transcription factor family in rice,
was involved in abiotic stress response. The expression of OsASIE1 was induced by drought and salt stresses, and over-expression
of OsASIE1 in the transgenic rice plant could improve its tolerance to salt stress. Further electrophoresis mobility shift assay
(EMSA) revealed that the AP2 domain of OsASIE1 protein could bind both DRE (dehydration-responsive element) and GCC box
(ethylene response element, ERE) in vitro. All these results implicated that OsASIE1 might be involved in abiotic stress response
by regulating the expression of downstream genes with DRE and GCC box binding.
Keywords: Rice; AP2/EREBP transcription factor; EMSA; Salt tolerance; Over-expression
各种生物和非生物胁迫是影响水稻生长和产量
的重要因素, 发掘能够改善水稻抵抗逆境胁迫能力
的基因将为基因工程改良水稻新品种打下基础。在
长期进化过程中, 植物在分子、细胞、生理和生物
化学水平上发展出多种机制应对逆境胁迫, 转录因
子作为上游调控基因在植物的胁迫应答途径中扮演
重要的角色[1]。植物中参与胁迫应答反应的主要有
AP2/EREBP、bZIP、NAC、MYB和 WRKY转录因
子家族[2]。其中 AP2/EREBP转录因子家族基因广泛
参与植物的发育、激素信号转导、病原反应与干旱、
高盐及低温等胁迫应答反应。该家族转录因子的共
同特点是含有一个 60 个氨基酸左右的 AP2 结构域,
它在与 DNA 结合中具有重要的作用。根据 AP2 结
构域的特点 , AP2/EREBP 转录因子家族被分为 :
AP2、EREBP、RAV 和其他共 4 个亚类。AP2 成员
含有 2 个重复的 AP2 结构域, 而 RAV 成员含一个
AP2结构域和一个类似 B3结构域; EREBP亚家族成
员含有一个AP2结构域, 且有 ERF和DREB/CBF[3-4]
2个分支。
研究表明, EREBPs转录因子广泛参与植物的生
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物和非生物胁迫应答反应。ERFs类转录因子主要参
与植物的生物胁迫应答反应, 如病原反应、伤害反应、
乙烯信号途径[1,5]。最早发现的 ERF转录因子是从烟草中
分离得到的4个乙烯诱导病程相关(pathe- genesis-related,
PR)蛋白 EREBP1-4, 它们通过结合下游基因启动子
区域的乙烯应答元件 GCC box 调控下游基因的表
达。GCC box 广泛存在于烟草和其他植物 PR 蛋白
基因的 5′UTR区域, 核心序列是 AGCCGCC[6]。1997
年, Zhou等在番茄中发现 3个 ERF蛋白(Pti-4、Pti-5
和 Pti-6)能够和疾病防御蛋白 Pto相互作用[7-8], 进一
步验证了 ERFs 转录因子在植物的病原反应中具有
重要作用。在植物中超表达一些 ERFs基因亦能够提
高植物的抗病能力, 如 ERF1、Pti4、ATERF1基因[5]。
最近的研究表明水稻中的 ERF 转录因子在乙烯应
答[9]、淹水胁迫应答[10-11]、干旱胁迫应答[12]等多种
生物途径中起正向调节作用。
DREBs转录因子在植物的冷、干旱、高盐、过
氧化物等胁迫应答途径中具有重要的作用, 参与不
依赖于 ABA 的胁迫应答反应。DREBs 转录因子通
过结合下游基因启动子区的干旱应答顺式作用元件
DRE/CRT而调控下游基因的表达。干旱应答顺式作
用元件 DRE (dehydration-responsive element)最早在
逆境胁迫诱导基因 rd29A 的启动子区域被发现, 核
心序列为 A/GCCGAC[13]。与 DRE 相似的顺式作用
元件 CRT (C-repeat)则是在一个冷诱导基因 cor15a
的启动子区被发现, 其核心序列是 TGGCCGA[14-15]。
DRE/CRT 被发现存在于多个受干旱和低温诱导的
基因的启动子区域[16]。在拟南芥、水稻等植物中超
表达 DREB 家族的基因大多能提高植株应对非生物
胁迫的能力[13,17-18]。迄今为止, 越来越多的 DREBs
基因从不同植物中被克隆[19]。在水稻中发现的 DREB
基因有 OsDREB1A-G、OsDREB2A、OsDREB2B, 其中
OsDREB1A、OsDREB1E、OsDREB1G、OsDRE B2A、
OsDREB2B能够特异性地结合 DRE[17-18]。研究发现在
拟南芥中超表达OsDREB1A能够提高拟南芥植株耐受
低温、高盐和干旱的能力[17]; 在水稻中超表达 OsDRE-
B1G和OsDREB2B也能够明显地提高转基因水稻的抗
旱性, 而超表达 OsDREB1E 仅仅能够轻微地提高水
稻抵抗干旱的能力[18]。
ERFs 和 DREBs 转录因子功能的差异主要体现
在它们能够结合的顺式作用元件和调节的下游基因
不同。有些 EREBPs 转录因子既能结合 DRE, 也能
结合 GCCbox, 如 TINY[20]、TINY2[21]、BnDREB
III[22]、AtERF1、AtERF4、AtEBP 和 CBF1[23]; 而部分
只能结合 DRE, 如 CBF2/DREB1C 和 CBF3/DREB1A
等。ERFs转录因子倾向于结合 GCC box, DREBs转录
因子则倾向于结合 DRE。为了发掘影响两类转录因子
结合的关键氨基酸, Sakuma等[3]通过多序列比对分析发
现拟南芥中的 DREBs转录因子的 AP2结构域第 15和
第 20个氨基酸分别是缬氨酸(Val, V)和谷氨酸(Glu, E),
而 ERFs转录因子的 AP2结构域第 15和 20个氨基酸
是丙氨酸(Ala, A)和天冬氨酸(Asp, D), 进一步研究表
明, Val-15和Glu-20特别是Val-15对于结合DRE有重
要的作用, 但不影响对 GCC box 的结合, 这可能是
造成 ERFs和 DREBs转录因子功能不同的原因。为
了发掘影响 GCC box结合的关键氨基酸, 孙山等[20]
比较能够结合 2 种顺式作用元件的蛋白序列和只能
结合 DRE 的蛋白序列发现 2 类蛋白的 AP2 保守区
的第 16个氨基酸不同, 进一步研究表明 Ser-16对于
拟南芥中的DREB转录因子 TINY结合GCC box是必
不可少的。TINY既参与生物胁迫反应途径, 也参与非
生物胁迫途径, 说明DRE介导的调控途径和GCC box
介导的调控途径存在一定的重叠。
水稻中有些 AP2/EREBP 转录因子基因在受到
非生物胁迫时表达量明显升高[24], 其中大部分基因
为 DREBs 和 ERFs, 这些基因很有可能与水稻的非
生物胁迫应答反应相关。虽然近年来对于 EREBPs
转录因子参与非生物胁迫应答反应的机制有了较全
面的研究, 但是水稻中还有很多的 EREBPs 基因的
功能未知。为了发掘与水稻非生物胁迫应答反应相
关的 EREBPs 基因, 本研究选择本课题组前期芯片
分析发现的受非生物胁迫诱导表达的 EREBPs 基因
OsASIE1 (Os08g0408500)进行研究。通过干旱、高盐、
低温胁迫下上述基因在不同水稻品种中的表达差异,
结合凝胶阻滞实验中其对顺式元件GCC box和DRE
的结合情况, 以及超表达水稻植株的表型变化, 分
析候选基因与水稻非生物胁迫应答的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
日本晴(Nipponbare, Oryza sativa ssp. japonica)
及典型耐旱旱稻品种 IRAT109、耐盐水稻品种
FL478、耐冷水稻云南地方品种丽江新团黑谷(LTH)。
1.2 胁迫处理
1.2.1 水稻品种日本晴的低温、高盐和干旱胁迫
水稻日本晴种子经消毒处理, 37℃催芽 3 d, 萌
第 10期 吴慧敏等: 水稻基因 OsASIE1抗逆功能分析 1773


发后选发芽一致的种子播于塑料盒泡沫架上, 每孔
2粒, 二叶前水培, 二叶后用 Yoshida营养液培养。于
五叶期开始低温(4℃)、高盐(150 mmol L−1 NaCl)和渗
透胁迫(20% PEG)处理, 并于胁迫处理 0 h、0.5 h、3 h、
6 h、12 h、24 h 后取叶片, 液氮速冻, −70℃低温保存。
1.2.2 抗逆水稻品种的低温、高盐和干旱胁迫
种子经消毒处理和催芽后, 旱处理材料(IRAT109)移
入装土的盆中种植 , 冷处理(LTH)和盐处理(FL478)
材料播种于塑料盒泡沫架上。五叶期分别进行干旱(断
水至叶片全卷)、高盐(150 mmol L−1 NaCl, 48 h)和低温
处理(4℃, 48 h)处理, 并分别于处理前和处理后取叶
片和根, 液氮速冻, −70℃低温保存。
1.3 实时定量 PCR分析
采用 TRIZOL试剂提取实验样品总 RNA。参照文
献[24]进行定量 PCR实验, 所用OsASIE1的 PCR引物
为 F: 5′-TGGTCTGATTTGGTAGCC-3′; R: 5′-TCCAA
GAACTGGCAGACGA-3′; 内参基因 Actin1 引物序列
为 F: 5′-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3′; R: 5′-GG
CTGGAAGAGGACCTCAGG-3′。
1.4 凝胶迁移率实验(EMSA)
1.4.1 原核表达蛋白的制备 以 PCR 扩增出
OsASIE1的 AP2保守域(67~193 aa)的基因编码序列并
构建到质粒 pET-32a (Novagen, USA, 69015-3)中, 在
大肠杆菌 BL21 (DE3) pLysS (TransGen Biotech, China,
Cat. No: DR101)中进行蛋白表达, 产物经 His-trap 柱
子纯化(GE), Miliproe 超滤管浓缩和脱盐后 , 采用
Bradford法[31]测定蛋白浓度。
1.4.2 目的 DNA 序列及突变序列的制备 将顺
式作用元件 GCC box (CATAAGAGCCGCCACT)和突
变序列(CATAAGATCCTCCACT), DRE 序列(ATACT
ACCGACATGAG)和突变序列 (ATACTACTGATATG
AG)串联重复 3次。以化学合成法分别合成双链后, 将
其等量混合(单链浓度 100 nmol L−1), 95℃温育 10 min
后慢慢冷却, 复性为双链。
1.4.3 EMSA 实验 采用 Invitrogen 的 EMSA 试
剂盒标准操作步骤。
1.5 多序列比对和系统发育树分析
利用 BioEdit7.0 软件对 OsASIE1 和所选的
EREBP转录因子进行多序列比对。用 MEGA4软件
构建 OsASIE1 和所选的 EREBP 转录因子的系统发
育树 , 采用邻接法 (Neighbor-Joining Method)[25]的
Complete Deletion模式建树, 用 Bootstrap检验。
1.6 OsASIE1超表达水稻植株获得及表型鉴定
1.6.1 载体构建和遗传转化 根据日本晴序列全
长设计引物 , 通过反转录从 IRAT109 中扩增获得
OsASIE1 的基因全长 cDNA, 同时在 5′和 3′端加上
Pst I、BamH I酶切位点, 扩增引物为 F: 5′-GCACTG
CAGATGGCAGCTGCTATAGAAGG-3′; R:5′-TAAG
GATCCTTATTGTTGTTGAGCAGC-3′, 扩增产物经
酶切纯化后连接到超表达载体 pCUbi1390 (含有 UbI
quitin 1 启动子)中。参照陈惠等[26]建立的高效基因
转化系统 , 用农杆菌 (EHA105)介导的遗传转化法 ,
以日本晴为受体材料, 进行遗传转化。
1.6.2 转基因植株表型鉴定 选用 T1 代转基因
超量表达植株各家系的种子在加潮霉素(100 mg L−1)
的 1/2 MS培养基上发芽, 去除阴性种子。将发芽的
种子播到 96孔 PCR板中, 以 Yoshida营养液水培, 4
周后用 150 mmol L−1 NaCl处理。设 3次重复试验, 以
野生型日本晴作为对照。
2 结果与分析
2.1 对 OsASIE1水稻植株受到低温、高盐和干旱胁
迫时的表达分析
2.1.1 日本晴中 OsASIE1在低温、高盐和 PEG胁迫
下的表达量变化谱 为精确了解 OsASIE1在各种
非生物胁迫下的表达模式, 采用实时定量 PCR 分析
该基因在水稻幼苗持续受到低温、高盐和干旱胁迫
后的表达变化趋势。结果表明在 3种胁迫下 OsASIE1
表达量均有增高, 但是表达模式存在差异(图 1)。在
低温和 PEG 胁迫下, OsASIE1 表达量均呈逐渐上升
趋势, 并在胁迫处理 3 h达最高水平。然而相比于低
温胁迫, 在 PEG胁迫下 OsASIE1表达量增加幅度较
大, 并且在胁迫后期仍能保持较高水平。在盐胁迫
下OsASIE1呈逐步升高的趋势, 并且表达量变化幅度较
大, 最高点到达 20倍以上。以上结果表明OsASIE1参与
水稻对低温、盐和干旱胁迫的早期应答, 并在应答模
式上存在差别。
转录因子在植物的非生物胁迫应答中有很重要
的作用 , 并且通常在胁迫的早期表达量迅速升高 ,
进而调控下游相关基因的表达。研究表明, 水稻幼
苗经干旱和盐处理后, OsASIE1 的表达量明显升高,
但在低温处理后表达量只是略有增高[12], 这与本文
的研究结果一致。
2.1.2 OsASIE1 在典型抗逆水稻品种中胁迫前后的
表达差异 为了进一步明确 OsASIE1与水稻抗逆
性的关系, 分析了各种胁迫条件下 OsASIE1 在典型
抗逆水稻品种和日本晴中的表达情况。结果表明无
论是在叶片中还是在根系中, OsASIE1 在典型抗逆
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水稻品种中的表达模式与日本晴基本相同, 而且在
胁迫前后的表达量和日本晴相比差异也不太显著
(图 2)。然而, 在胁迫前后 OsASIE1在叶和根中的表
达量变化稍有差异, 在低温和干旱胁迫下, OsASIE1
在根中的表达量增幅高于叶片 ; 在盐胁迫下 ,
OsASIE1在叶片中的表达量增幅高于根系。
2.2 OsASIE1的 AP2结构域对GCC box和 DRE
的结合分析
EREBPs 转录因子通过与下游基因启动子区
GCC box和 DRE顺式元件结合, 调控下游基因的表
达, 参与相关生物及非生物胁迫应答反应[6,13]。本研
究采用凝胶迁移率实验(EMSA)分析了 OsASIE1 的
AP2 结构域与 GCC box 和 DRE 的结合情况。结果
表明, OsASIE1 蛋白的 AP2 结构域能够结合 GCC
box和 DRE序列, 但是无法结合其突变序列(图 3)。
推测 OsASIE1通过特异结合 GCC box和 DRE顺式
元件以调节下游基因的表达, 参与相关生物胁迫和
非生物胁迫反应。
2.3 水稻和拟南芥中OsASIE1同源EREBP转录
因子的系统比较分析
为了分析 OsASIE1 的 AP2 结构域能结合 GCC
box 和 DRE 的原因, 选择水稻和拟南芥中已知的
EREBP 转录因子与 OsASIE1 进行多序列比对和系
统发育树分析(图 4)。结果表明, OsASIE1与 DREBs
转录因子的亲缘关系较近。OsASIE1的第 15个氨基
酸是缬氨酸(Val), 这与 DREB转录因子相同, 而第 20
个氨基酸不是谷氨酸 (Glu)而是亮氨酸 (Leu), Os-
DREB1A和 OsDREB1B的 20位氨基酸也都不是谷氨
酸(Glu)而是缬氨酸(Val), OsASIE1 与其他既能结合
GCC box又能结合 DRE的 AtERF1、AtERF4、AtEBP
的第 16个氨基酸也不是丝氨酸(Ser, S), 这说明不同
植物中 AP2/EREBP 转录因子结合机制和所需要的
关键氨基酸具有差异性。
2.4 OsASIE1超表达对水稻耐盐胁迫能力的改善
为进一步分析 OsASIE1在水稻胁迫应答反应中



图 1 以实时定量 PCR分析 OsASIE1在非生物胁迫下的表达量差异
Fig. 1 Real-time PCR analysis of relative expression of OsASIE1 under abiotic stresses
低温胁迫: 4℃处理; 盐胁迫: 150 mmol L−1 NaCl处理; 渗透胁迫: 20% PEG处理。分别于胁迫处理的 0、0.5、1、3、6、12、24 h取叶
片样品进行定量 PCR分析。
Cold stress is treated at 4℃, salt stress is treated under 150 mmol L−1 NaCl, osmotic stress is treated in 20% PEG. Leaf samples were col-
lected at 0, 0.5, 1, 3, 6, 12, and 24 h of treatment for RT-PCR analysis, respectively.



图 2 以实时定量 PCR分析 OsASIE1在典型抗逆水稻品种中胁迫前后的表达量差异
Fig. 2 Real-time PCR analysis of the expression of OsASIE1 under stress in rice varieties with different abiotic stress tolerances
A: 冷胁迫下 OsASIE1在日本晴和丽江新团黑谷中的表达量差异; B: 盐胁迫下 OsASIE1在日本晴和 FL478中的表达量差异; C: 干旱
胁迫下 OsASIE1在日本晴和 IRAT109中的表达量差异。N: 日本晴; L: 丽江新团黑谷; F: FL478; I: IRAT109。
A: Expression changes of OsASIE1 under cold stress in LTH and Nipponbare; B: Expression changes of OsASIE1 under salt stress in FL478
and Nipponbare; C: Expression changes of OsASIE1 under drought stress in IRAT109 and Nipponbare. N, L, I, and F indicate Nipp, LTH,
IRAT109 and FL478, respectively.
第 10期 吴慧敏等: 水稻基因 OsASIE1抗逆功能分析 1775




图 3 OsASIE1的 AP2结构域结合 GCC box和 DRE元件的 EMSA分析图谱
Fig. 3 EMSA analysis of the bindings between the AP2 domain of OsASIE1 and GCC box and DRE elements
A: OsASIE1的 AP2结构域结合 GCC box。Lane 1为自由 DNA; lane 2~5为 80 ng GCC box加入 0.25、0.5、1.0、1.5 µg目的蛋白; lane
6为 mGCC Box加入 1.5 µg目的蛋白。B: OsASIE1的 AP2结构域结合 DRE。Lane 1为自由 DNA; lane 2~4为 80 ng DRE加入 0.5、
1.0、1.5 µg目的蛋白; lane 5为 mDRE加入 1.5 µg目的蛋白。C: GCC box和 DRE野生型及突变序列信息。
A: EMSA of AP2 domain of OsASIE1 binding on GCC box. Lane 1: free DNA; lanes 2–5 indicate 80 ng GCC box incubated with 0.25, 0.5,
1.0, and 1.5 µg target protein, respectively; lane 6 indicates 80 ng mGCC box incubated with 1.5 µg target protein. B: EMSA of AP2 domain
of OsASIE1 binding on DRE. Lane 1: free DNA, lanes 2–4 indicate 80 ng GCC box incubated with 0.5, 1.0, and 1.5 µg target protein, respec-
tively; lane 5 indicates 80 ng mDRE incubated with 1.5 µg target protein. C: Sequence information of GCC box and DRE in wild and mutant types.



图 4 OsASIE1的 AP2结构域与 EREBP转录因子的 AP2结构域多序列比对及 OsASIE1与 AP2/EREBP转录因子的系统发育树分析
Fig. 4 Multiple alignment and phylogenic analysis of AP2 domains of OsASIE1 and EREBP transcription factors

箭头所指分别为 AP2结构域的第 15、第 16和第 20个氨基酸。
Arrows indicate the 15th, 16th, and 20th amino acid of AP2 domain, respectively.

的作用, 构建了超表达载体进行转基因分析, 共获得
14 个转基因株系。与野生型植株相比, OsASIE1 超表
达转基因植株较矮小(图 5-A); 实时定量 PCR 检验结
果显示超表达植株中 OsASIE1的表达量明显高于野生
型(图 5-B)。进一步对 OsASIE1超表达植株的耐盐性进
行分析, 根据 T0代初步结果, 选择株系 1、2、5、10、
17生长4周的T1幼苗进行150 mmol L−1 NaCl处理, 野
生型作为对照。处理 2 d后野生型植株的叶片大部分
萎蔫, 而转基因植株的生长状态好于野生型(图 5-C),
并且恢复 3 d 后转基因植株大都生长出新叶, 而野生
型植株较少有新叶的生长(图 5-D, E)。
3 讨论
植物应答非生物胁迫反应是一个非常复杂的过
程, 有很多基因参与其中。近年来, 各种表达分析实
验检测到大量受胁迫诱导表达的基因, 而外源 ABA
1776 作 物 学 报 第 37卷




图 5 超表达 OsASIE1提高了水稻抵抗盐胁迫的能力
Fig. 5 Over-expression of OsASIE1 enhanced salt tolerance of rice
A: 转基因和野生型植株的表型。B: 超表达转基因植株中 OsASIE1的表达量明显提高。WT为野生型; line 1、2、3、5、10、17为转
基因株系。C: 150 mmol L−1 NaCl处理 2 d植株表型。D, E: 150 mmol L−1 NaCl处理后恢复 3 d植株表型。
A: phenotypes of transgenic lines and wild type, B: expression identification of OsASIE1 in transgenic plants. WT: wild type; lines 1, 2, 3, 5,
7, and 17 indicate transgenic lines. C: phenotypes of transgenic lines and wild types treated by 150 mmol L−1 NaCl for two days; D, E: phe-
notypes of transgenic lines and wild types in 3 d recovery after treatment.

能够诱导大量受干旱和低温胁迫诱导的基因, 但是
还有些受干旱和低温诱导的基因不受外源 ABA 的
诱导。这表明植物中存在 2 种胁迫应答信号传递途
径: 一类是依赖于 ABA 信号的, 另一类是不依赖
ABA 信号的。相应地, 参与胁迫应答反应的转录因
子也可以分为 2 类 , 一类是依赖于 ABA 的 , 以
ABRE 转录因子为代表, 另一类不依赖于 ABA 的,
以 DREB转录因子为代表[1]。已有研究发现 OsASIE1
不受 ABA的诱导, 本研究表明 OsASIE1受低温、高
盐、干旱诱导表达, 说明 OsASIE1 可能参与不依赖
于 ABA 的胁迫应答反应, 可能与 OsDREBs 基因的
作用机制相似。另外, OsASIE1在典型抗逆水稻品种
表达模式与日本晴基本相同, 说明 OsASIE1 可能在
植物的胁迫应答反应中起的是基础调控作用, 并不
是造成典型抗逆品种 IRAT109 (抗旱)、FL478 (耐盐)
和丽江新团黑谷(耐冷)抗性提高的主要原因。
DREBs类转录因子分为 EREB1和 DREB2转录
因子, 它们都参与植物的非生物胁迫应答反应, 但
其机制有所不同[30-31]。二者在受到不同非生物胁迫
时表达量变化模式也有差异, DREB1 基因受低温诱
导而 DREB2基因受干旱和高盐的诱导[13]。本研究表
明, 低温胁迫后 OsASIE1 表达量增加幅度较小, 而
在盐和干旱胁迫后表达量迅速升高且维持在较高水
平。系统发育树分析也表明 OsASIE1 和 DREB2 转
录因子的亲缘关系较近, 所以 OsASIE1 应该属于类
DREB2转录因子。
水稻和拟南芥中的 DREB 转录因子都能够结合
DRE, 但是在结合机制上具有一定的差异。如 DRE
的核心序列为A/GCCGAC, 拟南芥中的DREB1A能
够有效地结合 GCCGAC 和 ACCGAC; 而水稻中的
OsDREB1A优先结合 GCCGAC, 不能有效调控只含
有ACCGAC序列基因的表达[17]。本研究通过EREBP
转录因子的多序列比对表明能够同时结合 GCC box
和 DRE的转录因子的第 15、第 16和第 20位氨基酸
并不完全保守, 表明不同植物中的 EREBPs 转录因
子结合机制及所需关键氨基酸具有差异, 这也可能
是导致转录因子功能不同的原因, 是植物在长期进
化过程中建立起来的一种适应性机制。
本研究通过一系列的实验证明 OsASIE1 参与
水稻的高盐胁迫应答反应。在高盐胁迫的前期 ,
OsASIE1 的表达量迅速提高, 进而通过调节下游功
能基因的表达参与水稻的胁迫应答反应。OsASIE1
第 10期 吴慧敏等: 水稻基因 OsASIE1抗逆功能分析 1777


超表达转基因植株与野生型相比较矮小 , 与前人
OsDREB 基因超表达转基因植株的表型类似[17-18]。
在拟南芥中过表达 ERF1 和 OsERF1 都会增加乙烯
应答基因的表达, 并使转基因植株产生乙烯应答表
型, 生长和发育受到抑制, 植株矮小[9]。然而, 转基
因植株表型的变化是否由于 OsASIE1 超表达引起还
需进一步的分子验证。另外 OsASIE1 和其他很多
EREBP 转录因子一样既都结合 DRE, 又结合 GCC
box, 表明 ERF 转录因子和 DREB 转录因子的功能可
能存在重叠, 至于这两类转录因子在功能上的差异还
需进一步研究, 这有助于揭示 AP2/EREBP 转录因子
参与植物胁迫应答反应的机制。
如前所述, 虽然 EREBPs 转录因子在植物的生
物胁迫反应和非生物胁迫应答途径中起重要作用 ,
在植物中超表达 EREBPs 类基因也能提高植株的抗
逆性, 但是往往会使植物的生长发育受到抑制, 因
此 EREBPs 转录因子还不能直接用于基因工程改良
育种, 需要找到合适方法以消除超表达 EREBPs 基
因给植物带来的生长发育抑制影响。虽然胁迫诱导
型启动子的使用可以消除这种不利的影响, 但是目
前鉴定的胁迫诱导型启动子的调控能力和诱导表达
的产量或速率还不能满足植物应答逆境条件下的要
求, 因此还需要进一步发掘更高效的诱导型启动子
以满足育种的需要。
4 结论
OsASIE1 是水稻 AP/EREBP 转录因子家族中的
DREB2类转录因子。OsASIE1基因在受到高盐和干
旱胁迫时表达量迅速增加, 但受到低温胁迫时增加
幅度较小。OsASIE1 转录因子可以通过结合下游基
因启动子区域的 GCC box 和 DRE 来调控下游基因
的表达, 参与植物胁迫应答反应。在水稻中超表达
OsASIE1 基因能够在一定程度上改善水稻耐盐胁迫
的能力。
References
[1] Nakashima K, Ito Y, Yamaguchi-Shinozaki K. Transcriptional
regulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis
and grasses. Plant Physiol, 2009, 149: 88–95
[2] Hussain S S, Kayani M A, Amjad M. Transcription factors as
tools to engineer enhanced drought stress tolerance in plants.
Biotechnol Prog, 2011, 27: 297–306
[3] Sakuma Y, Liu Q, Joseph G. DNA-binding specificity of the
ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREB, transcription factors
involved in dehydration- and cold-inducible gene expression.
Biochem Biophy Res Commun, 2002, 290: 998–1009
[4] Nakano T, Suzuki K, Fujimura T, Shinshi H. Genome-wide
analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice. Plant
Physiol, 2006, 140: 411–432
[5] Gutterson N, Reuber T L. Regulation of disease resistance path-
ways by AP2/ERF transcription factors. Curr Opin Plant Biol,
2004, 7: 465–471
[6] Ohme-Takagi M, Shinshi H. Ethylene-inducible DNA binding
proteins, that interact with an ethylene-responsive element. Plant
Cell, 1995, 7: 173–182
[7] Gu Y Q, Wildermuth M C, Chakravarthy S. Tomato transcription
factors Pti4, Pti5 and Pti6 activate defense responses when ex-
pressed in Arabidopsis. Plant Cell, 2002, 14: 817–831
[8] Zhou J M, Tang X Y, Martin G B. The Pto kinase conferring re-
sistance to tomato bacterial speck disease interacts with proteins
that bind a cis-element of pathogenesis-related genes. EMBO J,
1997, 16: 3207–3218
[9] Hu Y B, Zhao L F, Chong K, Wang T. Overexpression of OsERF1,
a novel rice ERF gene, up-regulates ethylene-responsive genes
expression besides affects growth and development in Arabidop-
sis. Plant Physiol, 2008, 165: 1717–1725
[10] Xu K N, Xu X, Fukao T, Fukao P, Maghirang-Rodriguez R,
Heuer S, Ismail A M, Bailey-Serres J, Ronald1 P C, Mackill D J.
Sub1A is an ethylene response factor gene that confers submer-
gence tolerance to rice. Nature, 2006, 442: 705–708
[11] Hattori Y, Nagai K, Nagai S. The ethylene response factors
SNORKEL1 and SNORKEL2 allow rice to adapt to deep water.
Nature, 2009, 460: 1026–1031
[12] Oh S J, Kim Y S, Kwon C W, Park H K, Jeong J S, Kim J K.
Overexpression of the transcription factor AP37 in rice improves
grain yield under drought conditions. Plant Physiol, 2009, 150:
1368–1379
[13] Yamaguchi-Shinozakiaib K, Shinozaki K A. Novel cis-acting
element in an Arabidopsis genes involved in responsiveness to
drought, low temperature, or high-salt stress. Plant Cell, 1996, 6:
251–264
[14] Baker S S, Wilhelm K S, Thomashow M F. The 5-region of
Arabidopsis thaliana corl5a has cis-acting elements that confer
cold-, drought- and ABA-regulated gene expression. Plant Mol
Biol, 1994, 24: 701–713
[15] Stockinger E J, Gilmour S J, Thomashow M F. Arabidopsis
thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional
activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regu-
latory element that stimulates transcription in response to low
temperature and water deficit. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:
1035–1040
[16] Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Transcriptional regulatory
networks in cellular responses and tolerance to dehydration and
cold stresses. Annu Rev Plant Biol, 2006, 57: 781–803
[17] Dubouzet J G, Sakuma Y, Ito Y, Kasuga M, Dubouzet E G, Miura
S, Seki M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. OsDREB genes
1778 作 物 学 报 第 37卷


in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that func-
tion in drought-, high-salt- and cold-responsive gene expression.
Plant J, 2003, 33: 751–763
[18] Chen J Q, Meng X P, Zhang Y, Xia M, Wang X P. Over expres-
sion of OsDREB genes lead to enhanced drought tolerance in rice.
Biotechnol Lett, 2008, 30: 2191–2198
[19] Zhang M(张梅), Liu W(刘炜), Bi Y-P(毕玉平). Dehydration-
responsive element-binding (DREB) transcription factor in plants
and its role during abiotic stresses. Hereditas (Beijing)(遗传),
2009, 31(3): 236–244 (in Chinese)
[20] Sun S, Yu J P, Chen F, Zhao T J, Fang X H, Li Y Q, Sui S F.
TINY, a dehydration-responsive element (DRE)-binding pro-
tein-like transcription factor connecting the DRE- and ethyle-
ne-responsive element-mediated signaling pathways in Arabi-
dopsis. Biol Chem, 2006, 283: 6261–6271
[21] Wei G, Pan Y, Lei J, Zhu Y X. Molecular cloning, phylogenetic
analysis, expressional profiling and in vitro studies of TINY2
from Arabidopsis thaliana. Biochem Mol Biol, 2005, 38: 440–446
[22] Liu Y, Zhao T J, Liu J M, Liu W Q, Liu Q, Yan Y B, Zhou H M.
The conserved Ala37 in the ERF/AP2 domain is essential for
binding with the DRE element and the GCC box. FEBS Lett,
2006, 580: 1303–1308
[23] Yang S, Yang S C, Liu X, Liu Y, Liu L, Wang X, Hao D Y. Four
divergent Arabidopsis ethylene-responsive element-binding fac-
tor domains bind to a target DNA motif with a universal CG step
core recognition and different flanking bases preference. FEBS J,
2009, 276: 7177–7186
[24] Jin P(靳鹏), Huang L-Y(黄立钰), Wang D(王迪), Wu H-M(吴慧
敏), Zhu L-H(朱苓华), Fu B-Y(傅彬英). Expression profiling of
rice AP2/EREBP Genes responsive to abiotic stresses. Sci Agric
Sin (中国农业科学), 2009, 42(11): 3765–3773 (in Chinese with
English abstract)
[25] Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for
reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol, 1987, 4:
406–425
[26] Chen H(陈惠), Zhao Y(赵原), Chong K(种康). Improved high-
efficiency system for rice transformation using mature em-
bryo-derived calli. Chin Bull Bot (植物学通报), 2008, 25(3):
322–331 (in Chinese with English abstract)
[27] Liu Qi, Kasuga M, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki
K, Shinozaki K. Two transcription factors, DREB1 and
DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two
cellular signal transduction pathways in drought- and low-tem-pe-
rature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis.
Plant Cell, 1998, 10: 1391–1406
[28] Sharoni A M, Nuruzzaman M, Satoh K, Shimizu T, Kondoh1 H,
Sasaya T, Choi I R, Omura T, Kikuchi S. Gene structures, classi-
fication and expression models of the AP2/EREBP transcription
factor family in rice. Plant Cell Physiol, 2011, 52: 344–360
[29] Qin F, Sakuma Y, Tran L S P, Maruyama K, Kidokoro S, Fujita Y,
Fujita M, Umezawa T, Sawano Y, Miyazono K I, Tanokura M,
Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozakia K. Arabidopsis DREB2A
interacting proteins function as RING E3 ligases and negatively
regulate plant drought stress-responsive gene expression. Plant
Cell, 2008, 20: 1693–1707
[30] Kidokoro S, Maruyama K, Nakashima K, Imura Y, Narusaka Y,
Shinwari Z K, Osakabe Y, Fujita Y, Mizoi J, Shinozaki K, Yama-
guchi-Shinozak K. The phytochrome-interacting factor PIF7
negatively regulates DREB1 expression under circadian control
in Arabidopsis. Plant Physiol, 2009, 151: 2046–2057
[31] Zhu H-C(朱厚础). Experiment Guide of Protein Purification and
Identification (蛋白质纯化与鉴定实验指南). Beijing: Science
Press, 1999. pp 158–159 (in Chinese)