全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(9): 1583−1591 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30971849)和重庆市自然科学基金重点项目(cstc2012jjB80010)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 朱利泉, E-mail: zhuliquan@swu.edu.cn, Tel: 023-68250794
第一作者联系方式: E-mail: lyxue1986@sina.com, Tel: 13996244010 ** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2011-12-16; Accepted(接受日期): 2012-04-20; Published online(网络出版日期): 2012-07-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120703.0858.201209.0_016.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01583
甘蓝 SCR 识别与结合 SRK 胞外域核心编码区 DNA 序列的酵母双杂
交检测
薛丽琰 1,** 罗 兵 1,3,** 朱利泉 1,* 杨永军 1 张贺翠 1 常登龙 1 陈 松 1
彭一波 1 杨 红 1 曾 静 1 杨 昆 1 高启国 2 李成琼 2 任雪松 2
王小佳 2
1西南大学植物生理生化实验室, 重庆 400716; 2重庆市蔬菜学重点实验室, 重庆 400716; 3常熟理工学院生物与食品工程学院, 江苏
常熟 215500
摘 要: SCR是芸薹属自交不亲和性的雄性决定因子。为研究 SCR与 SRK之间相互作用的核心区段, 通过构建结球
甘蓝的包含系列不同长度的 SCR的 cDNA序列的 pGBKT7融合载体, 利用酵母双杂交系统检测 SCR与 SRK之间的
相互作用。结果显示, 构建的载体均未出现自激活现象, 所获得 SCR全长与其相对应 SRK胞外域具有相互作用, 且
相互作用核心编码区位于 SCR编码基因的第 97~186 bp处。实验结果还显示, 此单倍型的 SCR信号肽剪切位点及相
邻的几个氨基酸残基对相互作用实验结果有干扰作用。以上结论为包括甘蓝在内的芸薹属自交不亲和机制的研究提
供了新的实验依据。
关键词: 甘蓝; 自交不亲和; S位点富含半胱氨酸蛋白(SCR); 酵母双杂交
Identifications of DNA Sequences Encoding Key Region of SCR Interacting
with SRK Extracellular Domain by Using Yeast Two-Hybrid System
XUE Li-Yan1,**, LUO Bing1,3,**, ZHU Li-Quan1,*, YANG Yong-Jun1, ZHANG He-Cui1, CHANG Deng-Long1,
CHEN Song1, PENG Yi-Bo1, YANG Hong1, ZENG Jing1, YANG Kun1, GAO Qi-Guo2, LI Cheng-Qiong2,
REN Xue-Song2, and WANG Xiao-Jia2
1 Plant Physiology and Biochemistry Laboratory of Southwest University, Chongqing 400716, China; 2 Chongqing Key Laboratory of Olericulture,
Chongqing 400716, China; 3 College of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China
Abstract: The S-locus cystein-rich protein (SCR) is the male-determining factor of self-incompatibility in Brassica. In this study,
the SCR fragments with different lengths amplified from Brassica oleracea L. were ligated with pGBKT7 to construct recombi-
nant bait plasmids, which were then transformed into yeast Y2HGold cells for detecting their interaction with the S-locus receptor
kinase extracellular domain (eSRK) in Brassica oleracea by using the yeast two-hybrid system. The results showed that recombi-
nant vectors were not activated autonomously. The full length SCR could interact with eSRK, and the core region in the SCR was
located between 97 and 186 bp. Moreover, the result also indicated that the splicing site of signal peptides of this haplotype SCR
and its several adjacent amino acid residues could affect the interaction. These conclusions add some novel insights into the
mechanism research of self- incompatibility in Brassica.
Keywords: Brassica oleracea; Self-incompatibility; SCR; Yeast two-hybrid system
甘蓝、油菜和芥菜等芸薹属植物的自交不亲和
性是由具有复等位基因的单一位点——S位点控制。
近年来研究表明, 在芸薹属植物授粉后的早期阶段,
花粉释放的特异性配体 S 位点富半胱氨酸蛋白
(S-locus cysteine-rich protein, SCR)与柱头乳突细胞
表达的 S位点受体激酶(S-locus receptor kinase, SRK)
1584 作 物 学 报 第 38卷

之间相互识别并结合, 启动一系列相关蛋白如臂重
复蛋白(arm repeat containing l, ARC1)、M位点蛋白
激酶(M-locus protein kinase, MLPK)等的相互作用,
并引发自交不亲和反应的信号传导, 导致自交不亲
和反应的发生[1-4]。因此, 自交不亲和反应的关键因
子是花粉粒上表达的 SCR和柱头上表达的 SRK。花
粉携带的决定自交不亲和的雄性因子 SCR 是 1999
年由 Schopfer 等[5]发现并命名, 研究表明 SCR 为单
拷贝、序列比较短、且高度不保守的基因, 其氨基
酸序列由一个信号肽区域和一个成熟肽区域组成 ,
序列主要特点表现在不同 S 单倍型中成熟肽区域呈
现高度多态性, 仅信号肽和半胱氨酸残基在不同单
倍型序列间相对保守[6-7]。SCR基因编码一个相对分
子质量在 8 kD左右、富含半胱氨酸的分泌蛋白, 它
的翻译产物不含蛋白质信号肽序列, 其成熟肽中含
有 3 个或 4 个二硫键, 蛋白质折叠方式与植物防御
素相似, SCR 蛋白只在花药中的花粉发育期间表达,
加工成熟后存在于花粉胞被中[7-10]。Takayama 等[9]
利用人工合成的 SCR蛋白、Kachroo等[10]利用在大
肠杆菌表达产生的 SCR蛋白分别进行授粉实验, 结
果显示这些来自植物体外的 SCR蛋白都表现出应有
的生物活性, 证明 SCR蛋白在植物体内没有明显的
进一步加工和修饰或加工后对其生物活性影响不明
显。
SCR 与 SRK 之间的相互作用是自交不亲和的
起始扳机反应, 两者之间相互识别和结合的关键核
心区段位置及氨基酸残基组成尚不完全清楚, 是目
前的研究热点之一。罗兵等[11]利用酵母双杂交系统
证明单倍型 S3的 SCR 可以与之相对应的 SRK 胞外
域(以下简称 eSRK)相互作用, 与其他的 eSRK 不发
生相互作用, 从而证明 SCR与其相同单倍型的 SRK
的胞外域发生相互作用。杨红等[12]和彭一波等[13]利
用巢式 PCR 获得不含信号肽的 SCR28, 证明信号肽
在利用酵母双杂交系统证明相互作用时, 对实验结
果有影响。本文在这些工作的基础上 , 利用巢式
PCR技术获得 SCR编码区及其他相关区域基因的不
同 DNA 片段, 构建相应载体并检测其自激活与毒性,
以期通过酵母双杂交分析寻找与 SRK 之间相互识
别的 SCR 核心 DNA 区段, 为芸薹属自交不亲和性
分子机制的深入研究及其在农业生产上的利用提供
新内容。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蓝品种为西南大学园艺园林学院十字花科研
究所选育的高度自交不亲和材料 D3。融合表达载体
pGADT7-SRK3 由本实验室提供。酵母双杂交系统
(matchmaker gold yeast two-hybrid system)、同源重
组酶(in-fusion advantage PCR cloning kit)、X-α-Gal、
aureobasidin A (以下简称 AbA)及缺陷性培养基购自
Clontech 公司。DMSO 购自 Sigma 公司; 限制性内
切酶、EASy Taq酶、mRNA提取试剂盒、反转录酶
于全式金公司购置。
1.2 引物设计
试验所用的 SCR模板是以西南大学园艺园林学
院的结球甘蓝 D3 花药提取的 mRNA, 通过逆转录
获得 cDNA[11], 然后 PCR扩增获得 SCR整个基因序
列(表 1), 利用巢式 PCR技术将其分成 14段(表 2)。

表 1 扩增 SCR 不同片段的引物
Table 1 Primers used for amplification of the different fragments of SCR
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
SCRd1 5′-CATGGAGGCCGAATTCAATTGTCCCATTCAATTC-3′
SCRd2 5′-CATGGAGGCCGAATTCCAATGTGGCAACTCAGGG-3′
SCRd3 5′-CATGGAGGCCGAATTCGCCTGCGTTGAAGAATAC-3′
SCRd4 5′-GCCGCTGCAGGTCGACGCCACATTGTCCACCCAA-3′
SCRd5 5′-GCCGCTGCAGGTCGACAACGCAGGCGTCCCCCCC-3′
SCRd6 5′-GCCGCTGCAGGTCGACTGAGCAAAATATCTTCTT-3′
SCRd7 5′-GCCGCTGCAGGTCGACTCCACATGAGCAAAATAT-3′
SCR-F 5′-CATGGAGGCCGAATTCCAAGAAGTGGAAGCTAAT-3′
SCR-R 5′-GCCGCTGCAGGTCGACACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAAT-3′
下画线为同源重组序列。Homologous recombination sequences are underlined.
第 9期 薛丽琰等: 甘蓝 SCR识别与结合 SRK胞外域核心编码区 DNA序列的酵母双杂交检测 1585


表 2 SCR 系列片段所对应的引物组合
Table 2 Primers pairs used for amplification of SCR different fragments
引物名称
Primer name
引物组合
Primers used for PCR
参考文献
Reference
引物名称
Primer name
引物组合
Primers used for PCR
参考文献
Reference
SCR SCRF+SCRR Luo B et al. 2011[11] SCR8 SCRd1+SCRd7 This study
SCR1 SCRd1+SCRR This study SCR9 SCRd3+SCRd7 This study
SCR2 SCRd2+SCRR This study SCR10 SCRd1+SCRd6 This study
SCR3 SCRd3+SCRR This study SCR11 SCRd2+SCRd6 This study
SCR4 SCRF+SCRd4 This study SCR12 SCRd3+SCRd6 This study
SCR5 SCRF+SCRd5 This study SCR13 SCRd1+SCRd5 This study
SCR6 SCRF+SCRd6 This study SCR14 SCRd2+SCRd5 This study
SCR7 SCRF+SCRd7 This study

图 1中 SCRd1位于甲硫氨酸和赖氨酸残基之后,
SCRd2、SCRd3、SCRd4、SCRd5、SCRd6和 SCRd7
起始于开放阅读框中的各个半胱氨酸前或后一个氨
基酸残基, 主要针对开放阅读框中的重复的赖氨酸
序列。其中, SCRF与 SCRR引物对的 PCR产物最长,
SCRd2 与 SCRd5 的 PCR 产物最短。由于本实验主
要是研究 SCR 的截短片段与 eSRK 相互作用情况,
根据 Schopfer 等[5]对 SCR 氨基酸序列的研究, 预测
其相互作用位点位于开放阅读框中, 而且 SCR中所
含有的半胱氨酸残基较其他氨基酸残基保守性高 ,
原因可能半胱氨酸可以形成二硫键, 对 SCR三级结
构的形成有很大影响。根据 SCR开放阅读框中半胱
氨酸残基位置和利用 Swiss-model (http://swissmodel.
expasy.org/)对 SCR3 进行三级结构预测结果设计引
物 SCRd2-SCRd7。这些引物主要位于开放阅读框中
(图 1), 从而改变 DNA片段的长短。此外, 因为有信
号肽的分泌蛋白在利用酵母表达系统表达时, 信号
肽对蛋白表达有影响, 为研究信号肽剪切位点对实
验结果的影响, 主要用 SignalP 4.0 Server预测该剪
切位点, 知其位于甘氨酸残基与谷氨酰胺残基之间,
研究表明在酵母表达系统中如果外源蛋白信号肽存在
Glu-Ala, 会避免错误切割的发生[14], 为了研究信号肽
对实验结果的影响, 故设计引物 SCRd1, 将信号肽剪
切位点与之接近的几个氨基酸去除作为实验组。

图 1 扩增 SCR 的引物在核苷酸序列上的位点
Fig. 1 Sites of nucleotide sequences used as primers for SCR
箭头代表引物。Arrows indicate the primers.

1.3 重组载体 pGBKT7SCRn 对酵母 Y2HGold
的自激活检测及毒性检测
根据酵母双杂交系统使用说明书, 利用醋酸锂
法制备感受态酵母菌 Y2HGold, 用 PEG/LiAc 法将
pGBKT7空载和重组诱饵载体 pGBKT7SCRn同时转
化 Y2HGold酵母感受态细胞, 取适量转化后的酵母
菌液涂布于 SD/–Trp 和 SD/–Trp/–X-α-Gal 固体培养
基上, 30℃倒置培养 3~5 d至酵母菌落出现, 记录实
验结果。
参照酵母双杂交系统使用说明书, 依据菌斑颜
色鉴定 SCR融合蛋白是否有自激活作用。将上述鉴
定好的含有重组载体的酵母 Y2HGold 分别涂在
SD/–Trp 和 SD/–Trp/–X-α-Gal 固体平板上。30℃培
养 3~4 d, 观察酵母生长情况以及菌落的颜色变化。
同时设立阳性对照 Y2HGold [pGBKT7-53]×Y187
[pGADT7-T], 以便于颜色的观察。
重组载体对酵母菌的毒性试验是将重组质粒
pGBKT7SCRn (n=1, 2, …, 14)和空载体 pGBKT7分
别转化酵母菌 Y2HGold, 涂板倒置 30℃培养 3~5 d,
然后将经菌落 PCR鉴定有相应目的条带的重组载体
pGBKT7SCRn与空载体 pGBKT7的转化酵母转到另
一张 SD/–Trp平板上, 倒置 30℃培养 3 d后, 通过观
察其所转化的酵母菌与未连接基因片段的空载体所
转化的酵母菌的菌落在相同的生长时间内情况是否
一致, 如果菌落大小、颜色相同, 则说明所构建载体
对酵母菌没有毒性, 如有其他情况, 则说明所构建
1586 作 物 学 报 第 38卷

载体不能用于酵母双杂交实验。
1.4 SCR片段与 eSRK相互作用检测
将鉴定过的含有相应载体的酵母菌 Y2HGold
和 Y187 挑到同一个装有 2×YPDA 液体培养基的无
菌离心管中, 200转 min–1培养 20 h左右后镜检, 观
察到视野中有三叶草形状的菌体出现, 说明融合菌
准备完成。按照上述方法设立阳性对照 Y2HGold
[pGBKT7-53]×Y187 [pGADT7-T]和 阴 性 对 照 组
Y2HGold [pGBKT7-lam]×Y187 [pGADT7-T]。然后
各取适量菌液平铺到 SD/–Leu/–Trp 平板上, 30℃培
养 3~5 d, 直到平板上长出菌斑。为减少假阳性对实
验结果的影响, 在检测报告基因前, 利用特异性引
物进行菌落 PCR鉴定融合菌中两个重组载体是否都
存在 , 将鉴定过的酵母融合菌用无菌去离水稀释 ,
然后在 SD/–Leu/–Trp/–Ade/–His/–X-α-Gal/–AbA 平
板上画线, 30℃培养 3~5 d后, 记录实验结果。
2 结果与分析
2.1 模板分析与目的片段获得
以罗兵等[11]所获得的 SCR基因为模板, 经测序
分析与 GenBank 公布的甘蓝 SCR3 (登录号为
AJ278643)序列相一致。利用 SignalP 4.0 Server预测
其信号肽剪切位点, 确定其开放阅读框的大概起始
位置, 而设计的引物 SCR-F 和 SCR-R 是分别位于
SCR信号肽剪切位点和 mRNA的 Ploy A位点。以引
物 SCR-F和 SCR-R扩增的产物应包含其长度为 319
bp, 包含 174 bp能编码 58个氨基酸残基的开放阅读
框编码区、127 bp 3′非翻译区(3′UTL)和 18 bp Poly
A。扩增产物经 2% (W/V)琼脂糖凝胶电泳结果显示
在 300 bp左右有一明显的特异条带(图 2), 而且测序
结果也与预期结果相符。
以前面所获得 SCR3模版, 利用表 1内的引物按
照表 2的设计进行 PCR扩增获得目的片段, 将 SCR
全长分成 14段, 各个片段分别包含编码 49、39、31、
22、30、45、47、38、20、36、26、18、21 和 11
个氨基酸残基的开放阅读框序列(表 2)。本实验操作
主要是在编码区进行, 由理论分析表明各个片段分
别是 292、256、239、66、90、135、141、144、60、
108、78、54、63和 33 bp (表 3)。因此, 其相应引
物按照表 2 设计, 各个片段再加上相对应引物中所
包含的同源重组序列, 从而导致其各相应 PCR电泳
产物总长度符合图 3 的相对电泳位置关系, 测序结
果也与前面的实验设计相符。

图 2 SCR 基因的 PCR 电泳鉴定
Fig. 2 PCR analysis of SCR
M: DL2000 marker; 1: SCR的 PCR产物。
M: DL2000 marker; 1: PCR products of SCR.

图 3 SCR 基因片段 PCR 电泳图
Fig. 3 Electrophoretic pattern of PCR products of SCR
fragments
M: DL2000 marker; 1~14: SCRn (n=1, 2,…, 14)的 PCR产物。
M: DL2000 marker; 1–14: PCR products of SCRn (n=1, 2,…, 14).

2.2 诱饵载体 pGBKT7SCRn的构建与表达蛋白
的特征分析
通过同源重组酶将经纯化的目的片段 PCR产物
与诱饵载体 pGBKT7 构建成重组载体 (记为
pGBKT7SCRn, n=1, 2, …, 14), 经过菌落 PCR反应鉴
定, 取阳性克隆送华大基因公司测序表明, 结球甘蓝
扩增的 PCR 产物完全符合预期大小(表 3), 且插入位
点和方向皆正确, 表明酵母诱饵载体构建成功。
2.3 重组诱饵质粒转化酵母的自激活鉴定与毒
性检测
由图 4 可知 , 阳性对照酵母融合菌(Y2HGold
[pGBKT7-53]×Y187 [pGADT7-T])在 SD/–Leu/–Trp/
X-α-Gal 平板上有菌落生长 , 并且菌落明显呈蓝
色。而转化酵母 pGBKT7SCRn (n=1, 2, …, 14)在
SD/–Trp和 SD/–Trp/–X-α-Gal平板上都能长出菌落
且都没有变为蓝色, 这说明 SCR 融合蛋白不能自
第 9期 薛丽琰等: 甘蓝 SCR识别与结合 SRK胞外域核心编码区 DNA序列的酵母双杂交检测 1587


激活报告基因 , 自身没有转录激活活性 (图 4 和
表 4)。
图 5 的实验结果表明平板上的转化酵母 Y2H
Gold [pGBKSCRn] 菌 斑 与 转 化 酵 母 Y2HGold
[pGBKT7]菌斑的形态大小相当, 且菌落的颜色是白
色而无其他颜色出现 , 说明融合蛋白对酵母
Y2HGold生长没有毒害(图 5和表 4), 可以用于下面
的酵母双杂交实验。

表 3 各个片段序列简表
Table 3 Summary of the different fragments of SCR
名称
Name
长度
Fragment
length (bp)
氨基酸个数
No. of
amino acids
氨基酸组成
Essential amino acid residues of the fragment
SCR 319 58 QEVEANVMKNCPIQFNLGGQCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCSCGGVRVGQCCCIV
SCR1 292 49 ------------------NCPIQFNLGGQCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCSCGGVRVGQCCCIV
SCR2 256 39 -------------------------------------QCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCSCGGVRVGQCCCIV
SCR3 239 31 -----------------------------------------------------ACVEEYNRKK|KKKKIFCSCGGVRVGQCCCIV
SCR4 66 22 QEVEANVMKNCPIQFNLGGQCG----------------------------------------------------------------------
SCR5 90 30 QEVEANVMKNCPIQFNLGGQCGNSGGDACV----------------------------------------------------
SCR6 135 45 QEVEANVMKNCPIQFNLGGQCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCS-------------------------
SCR7 141 47 QEVEANVMKNCPIQFNLGGQCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCSCG--------------------
SCR8 144 38 ------------------NCPIQFNLGGQCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCSCG--------------------
SCR9 60 20 -------------------------------------QCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCSCG--------------------
SCR10 108 36 ------------------NCPIQFNLGGQCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCS-------------------------
SCR11 78 26 -------------------------------------QCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCS-------------------------
SCR12 54 18 -----------------------------------------------------ACVEEYNRKK|KKKKIFCS------------------------
SCR13 63 21 -------------------NCPIQFNLGGQCGNSGGDACV----------------------------------------------------
SCR14 33 11 -------------------------------------QCGNSGGDACV----------------------------------------------------

图 4 转质粒 pGBKT7SCR 酵母的自激活检测
Fig. 4 Testing recombinant plasmid pGBKT7SCR for Autoactivation
1: pGBKT7SCR1; 2: pGBKT7SCR2; 3: pGBKT7SCR3; 4: pGBKT7SCR4; 5: pGBKT7SCR5; 6: pGBKT7SCR6; 7: pGBKT7SCR7; 8:
pGBKT7SCR8; 9: pGBKT7SCR9; 10: pGBKT7SCR10; 11: pGBKT7SCR11; 12: pGBKT7SCR12; 13: pGBKT7SCR13; 14: pGBKT7SCR14;
15: pGBKT7-53×pGADT7-T (SD/–Leu/–Trp/–X-α-Gal).

2.4 酵母双杂交检测
按照酵母双杂交系统使用说明书准备好融合菌,
为减少假阳性对实验结果的影响, 在检测报告基因
前, 利用特异性引物对融合菌进行菌落 PCR 鉴定,
确定融合菌中含有 2个所需的重组载体(图 6), 挑选
出符合实验要求的融合菌, 进行双杂交试验。
在 SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/–X-α-Gal/–AbA 平
板上, 有相互作用的阳性对照长出蓝斑而不相互作
1588 作 物 学 报 第 38卷


图 5 质粒 pGBKT7SCR 对酵母 Y2HGold 的毒性检测
Fig. 5 Testing the plasmid pGBKT7SCR for Toxicity on
SD/–Trp plate
1: pGBKT7SCR1; 2: pGBKT7SCR2; 3: pGBKT7SCR3;
4: pGBKT7SCR4; 5: pGBKT7SCR5; 6: pGBKT7SCR6;
7: pGBKT7SCR7; 8: pGBKT7SCR8; 9: pGBKT7SCR9;
10: pGBKT7SCR10; 11: pGBKT7SCR11; 12: pGBKT7SCR12;
13: pGBKT7SCR13; 14: pGBKT7SCR14; 15: pGBKT7.
用的阴性对照不长斑。在本实验的 14个实验组中(图
7 和表 5), 只有 Y187 [pGADT7eSRKD3]×Y2HGold
[pGBKT7SCR4]融合菌和 Y187 [pGADT7eSRKD3]×
Y2HGold [pGBKT7SCR5]融合菌即第 4组、第 5组
在平板上长出明显的蓝色菌落, 这表明第 4组、第 5
组有相互作用, 而根据表 2设计可知 SCR与 SRK有
相互作用识别位点, 且实验组 SCR5 位于 SCR 全长
第 97~186 bp 处, 也就是从序列开始到 Cys3之前的
序列。同时, 由这 2 个实验组的长势可知, 实验组
SCR5 比 SCR4 现象明显, 推测 SCR3与其相对应的
eSRK有相互作用的 DNA片段, 可能主要位于 SCR
主要位于 Cys2~Cys3之间。对于实验组 SCR4中所显
示的从序列开始到 Cys2之间序列是否也参与这一反
应, 以及由实验组 SCR6、SCR7, 序列中多了 Cys3~
Cys5 之间的序列而无法激活报告基因, 其还需进一
步研究。

表 4 质粒转化酵母的自激活检测与毒性检测
Table 4 Self-activation results and toxicity test of the transformed yeast strains
编号
No.
酵母菌种(质粒)
Mating strain (plasmid)
培养基
Yeast medium
菌斑
Colony
颜色
Color
自激活检测
Self-activation
毒性检测
Toxicity
SD/–Trp Yes White — No 1 Y2HGold(pGBKT7-SCR1)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
SD/–Trp Yes White — No 2 Y2HGold(pGBKT7-SCR2)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
SD/–Trp Yes White — No 3 Y2HGold(pGBKT7-SCR3)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
SD/–Trp Yes White — No 4 Y2HGold(pGBKT7-SCR4)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
SD/–Trp Yes White — No 5 Y2HGold(pGBKT7-SCR5)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
SD/–Trp Yes White — No 6 Y2HGold(pGBKT7-SCR6)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
SD/–Trp Yes White — No 7 Y2HGold(pGBKT7-SCR7)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
SD/–Trp Yes White — No 8 Y2HGold(pGBKT7-SCR8)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
SD/–Trp Yes White — No 9 Y2HGold(pGBKT7-SCR9)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
SD/–Trp Yes White — No 10 Y2HGold(pGBKT7-SCR10)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
SD/–Trp Yes White — No 11 Y2HGold(pGBKT7-SCR11)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
SD/–Trp Yes White — No 12 Y2HGold(pGBKT7-SCR12)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
SD/–Trp Yes White — No 13 Y2HGold(pGBKT7-SCR13)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
SD/–Trp Yes White — No 14 Y2HGold(pGBKT7-SCR14)
SD/–Trp/X-α-Gal Yes White No —
15 Y2HGold(pGBKT7) SD/–Trp Yes White — —
SD/–Trp/–Leu Yes White — — 16 Y2HGold(pGBKT7-SCR1)×Y
187(pGADT7) SD/–Trp/–Leu/X-α-Gal Yes Blue — —
第 9期 薛丽琰等: 甘蓝 SCR识别与结合 SRK胞外域核心编码区 DNA序列的酵母双杂交检测 1589



图 6 二倍体酵母的 PCR 鉴定
Fig. 6 PCR analysis of diploid yeasts
1: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR1; 2: pGADT7eSRKD3×
pGBKT7SCR2; 3: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR3; 4:
pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR4; 5: pGADT7eSRKD3×
pGBKT7SCR5; 6: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR6; 7:
pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR7; 8: pGADT7eSRKD3×
pGBKT7SCR8; 9: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR9; 10:
pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR10; 11: pGADT7eSRKD3×
pGBKT7SCR11; 12: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR12; 13:
pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR13; 14: pGADT7eSRKD3×
pGBKT7SCR14; M: DL2000 marker.
2.5 信号肽剪切位点对实验结果的影响
由表 5 数据所示 , 实验组 SCR4 和 SCR5 与
eSRK 在平板上长出明显的蓝色菌落 , 但信号肽
剪切位点及其邻近的几个氨基酸残基缺失的实
验组 SCR1 和 SCR13 在平板上无菌落长出 , 说明
信号肽剪切位点及其 SCR1 和 SCR13 与 eSRK 无
相互作用。由 ExPASy (http://www.expasy.org/)对
其理化性质预测显示 , SCR4 和 SCR5 在酵母中的
半衰期比 SCR1 和 SCR13 长。由此推测 , 信号肽
剪切位点及其邻近的几个氨基酸残基可能与其
编码的多肽在酵母中的稳定性有关 , 从而影响实
验结果。

表 5 酵母中 eSRK 和 SCR 之间相互作用分析
Table 5 Analysis of the interactions between eSRK and SCR in yeast
编号
No.
名称
Name
氨基酸序列
Sequences of amino acid
菌斑
Bacterial
lawn
颜色
Color
1 eSRK×SCR QEVEANVMKNCPIQFNLGGQCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCSCGGVRVGQCCCIV Yes Blue
2 eSRK×SCR1 ------------------NCPIQFNLGGQCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCSCGGVRVGQCCCIV No No
3 eSRK×SCR2 -------------------------------------QCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCSCGGVRVGQCCCIV No No
4 eSRK×SCR3 -----------------------------------------------------ACVEEYNRKK|KKKKIFCSCGGVRVGQCCCIV No No
5 eSRK×SCR4 QEVEANVMKNCPIQFNLGGQCG---------------------------------------------------------------------- Yes Blue
6 eSRK×SCR5 QEVEANVMKNCPIQFNLGGQCGNSGGDACV---------------------------------------------------- Yes Blue
7 eSRK×SCR6 QEVEANVMKNCPIQFNLGGQCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCS------------------------- No No
8 eSRK×SCR7 QEVEANVMKNCPIQFNLGGQCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCSCG-------------------- No No
9 eSRK×SCR8 ------------------NCPIQFNLGGQCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCSCG-------------------- No No
10 eSRK×SCR9 -------------------------------------QCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCSCG-------------------- No No
11 eSRK×SCR10 ------------------NCPIQFNLGGQCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCS------------------------- No No
12 eSRK×SCR11 -------------------------------------QCGNSGGDACVEEYNRKK|KKKKIFCS------------------------- No No
13 eSRK×SCR12 -----------------------------------------------------ACVEEYNRKK|KKKKIFCS------------------------ No No
14 eSRK×SCR13 -------------------NCPIQFNLGGQCGNSGGDACV---------------------------------------------------- No No
15 eSRK×SCR14 -------------------------------------QCGNSGGDACV---------------------------------------------------- No No
参考罗兵等[11]文献。See Luo B et al.[11]

图 7 酵母中 SCRn 和 eSRK 之间相互作用分析
Fig. 7 Analysis of the interactions between eSRK and SCR in yeast
A, B: SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/–X-α-Gal/–AbA. A1: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR1; A2: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR2; A3:
pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR3; A4: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR4; A5: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR5; A6:
pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR6; A7: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR7; A8: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR8. B1:
pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR9; B2: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR10; B3: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR11; B4:
pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR12; B5: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR13; B6: pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR14; B7:
pGBKT7-Lam×pGADT7-T; B8: pGBKT7-53×pGADT7-T.
1590 作 物 学 报 第 38卷

3 讨论
研究表明包括甘蓝在内的芸薹属植物同一单倍
型的 SCR 与 SRK 之间相互识别, 能引起与 SRK 相
关的下游一系列酶联反应的发生, 从而引发自交不
亲和反应信号的传导, 最终导致自交不亲和[16-17]。
因此, SCR与 SRK相互识别并结合是自交不亲和反
应的起始步骤和启动扳机。Kachroo 等[18]通过研究
SRK6 胞外域与 SCR 整体序列的相互作用证明了
SRK胞外域能与之相对应的 SCR相互作用。Masaki
等[10]利用芜菁 SCR8基因(登录号为 AB035504)编码
的蛋白为材料, 对其三维结构进行详细的理论分析,
预测其编码蛋白 βαββ的三明治结构, 研究表明芜菁
SCR8 的等位基因有着相似的结构且具有高度保守
的 8个半胱氨酸残基, 而且序列中的个别氨基酸如
苏氨酸、亮氨酸、芳香族的酪氨酸等对其二级结构
的构成起着核心作用, 由于不同单倍型的 SCR在一
级结构上存在高度保守的氨基酸残基, 因此可以预
测这些单倍型有共同的核心区[10]。Sato等[15]依据甘
蓝的 SCR 上保守的半胱氨酸位置将 SCR 氨基酸序
列分成 6个区(region), 通过 SCR蛋白上氨基酸残基
的偏正分布和不同单倍型之间氨基酸残基缺失和插
入情况, 推测 region III (Cys2~Cys3)、region V (Cys5~
Cys6)、region VI (Cys6以后序列)的氨基酸序列可能
决定了 SCR单倍型特异性 , 即这 3个区域存在与
SRK相互识别的区域[15]。本实验是在前人理论研究
和罗兵等[11]、杨红等[12]和彭一波等[13]实验证明不同
单倍型 SCR 是与 eSRK 发生相互作用基础上, 进一
步对 SCR 的开放阅读框进行截短并克隆各个片段,
以期证明其相互作用位点在 DNA 序列中的具体位
置。实验结果表明与 SRK发生相互作用的识别位点
位于 SCR的成熟肽序列开始到 Cys3之间, 这从实验
上证明了 SCR 与 SRK 的相互识别位点确实在该区
域; 对于实验组 SCR6和 SCR7在酵母双杂交系统中
没有激活报告基因的现象, 其原因还需要进一步研
究。
本实验以甘蓝 SCR3 为材料, 利用新型 Match-
maker Gold酵母双杂交系统对 SCR不同氨基酸片段
与 eSRK 之间是否有相互作用进行检测, 该系统较
传统酵母双杂交系统有如下的特点 : (1)引入
AUR1-C基因作为新报告基因, 可以产生 AbA抗性,
从而使该系统的报告基因达到 4 个, 这样可有效降
低假阳性; (2)抗生素抗性筛选、营养缺陷型筛选、
和蓝白筛选配合使用, 使筛选更加严密。实验结果
表明 SCR3 与其相对应的 SRK 胞外域相互作用的
DNA片段位于 SCR的第 97~186 bp处, 即位于 SCR
开放阅读框的开始到第 3 个半胱氨酸残基之间, 同
时实验还证明与信号肽剪切位点相邻的几个氨基酸
残基的缺失对酵母双杂交实验有不利的影响。以上
实验结果为芸薹属自交不亲和分子机制理论的深入
研究增加了新的实验证明。
4 结论
本实验利用巢式 PCR获得大量的 SCR编码区及
其他相关区域的呈系列基因DNA片段, 通过酵母双
杂交检测法, 检测出与 eSRK 相互作用的 SCR 的关
键核心 DNA 区段为 Cys3之前的序列。这对深入研
究 SRK 与 SCR 相互作用和芸薹属自交不亲和的分
子机制和其实际应用的进一步探索都有着重要意
义。
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