全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(2): 202−210 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家科技支撑计划(2007BAD30B02)，现代农业产业技术体系建设专项资金(nycytx-024-01-03), 国家科技基础条件平台工作项目子专
题(2007DKA21002-11)和农业部农林动植物育种工程(2006BAD01A06-4-1)项目资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 吴才文, E-mail: gksky_wcw@163.com
第一作者联系方式: E-mail: lxlgood868@163.com
Received(收稿日期): 2009-07-03; Accepted(接受日期): 2009-09-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00202
云南甘蔗自育品种 DNA指纹身份证构建
刘新龙 1,2 马 丽 1,2 陈学宽 1,2 应雄美 1,2 蔡 青 1,3 刘家勇 1,2
吴才文 1,2,*
1 云南省甘蔗遗传改良重点实验室, 云南开远 661600; 2 云南省农业科学院甘蔗研究所, 云南开远 661600; 3 云南省农业科学院生物技
术与种质资源研究所, 云南昆明 650223
摘 要: 以云南 27份甘蔗自育品种为材料, 从国际微卫星协会提供的 120对 SSR引物中筛选出 8对多态性丰富、品
种聚类区分率高、易统计的引物组成核心引物。8 对 SSR 引物共产生 129 条带, 123个为多态带, 多态条带比例为
95.35%, 多态信息量平均为 0.9445, 品种相似性系数在 0.269~0.767之间, 其中引物 SMC1047HA, MSSCIR21不仅多
态性丰富 , 而且单个引物就可区分所有品种 , 是最有效的核心引物。8 对核心引物两两组合的效率分析表明 ,
MSSCIR36/MSSCIR2、MSSCIR16/MSSCIR36 和 MSSCIR36/SMC336BS 是高效引物组合, 可以完全有效区分所有
品种 , 且品种相似性系数较低 ; 同时使用蔗区种植面积较大的 10 个主栽品种验证 3 个高效引物组合 , 结果表明 ,
MSSCIR16/MSSCIR36 是最佳引物组合, 不仅能有效区分所有云南甘蔗自育品种, 而且能将云南甘蔗自育品种与 10
个主栽品种最有效地区分开。使用品种的国圃号、国家地区代码、育种单位英文缩写、核心引物名称和分子数据组
成云南甘蔗自育品种的 DNA指纹身份证, 不仅包含了品种的重要信息, 而且其中的分子数据可用于品种的真伪鉴定
和遗传关系分析, 为品种的知识产权保护提供有效的科学依据。
关键词: 云南甘蔗品种; SSR; DNA; 指纹; 身份证
Establishment of DNA Fingerprint ID in Sugarcane Cultivars in Yunnan,
China
LIU Xin-Long1,2, MA Li1,2, CHEN Xue-Kuan1,2, YING Xiong-Mei1,2, CAI Qing1,3, LIU Jia-Yong1,2, and WU
Cai-Wen1,2,*
1 Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan 661600, China; 2 Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of
Agricultural Sciences, Kaiyuan 661600, China; 3 Biotechnology & Genetic Resources Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming
650223, China
Abstract: To well evaluate and use the cultivars, we should identify them scientifically and accurately by DNA molecular markers.
In this paper, 27 cultivars developed by two breeding institutes in Yunnan province were analyzed with SSR marker. Eight pairs of
core SSR primers selected from about 120 pairs of SSR primers offered by the International Sugarcane Microsatellite Consortium
made up the core primers for DNA fingerprint. A total of 129 bands were acquired by PAGE with the core primers, 123 of which
were polymorphic bands, accounting for percentage of polymorphic band (PPB) was 95.35%, and the mean value of polymor-
phism information content (PIC) reached 0.9445; the genetic similarity coefficient of the cultivars was 0.269–0.767. SMC1047HA
and MSSCIR21 with high PIC value could be used to distinguish all cultivars, which were the most efficient single primers. The
result of evaluating different primer combinations from eight core primers indicated that MSSCIR36/MSSCIR21, MSSCIR16/
MSSCIR36, and MSSCIR36/SMC336BS were very efficient in identifying these Yunnan cultivars, and their similar coefficients
were lower than those of other primer combinations. At the same time, three primer combinations were validated with ten main
released cultivars. The result showed MSSCIR16/MSSCIR36 was the optimum primer combination, which can be used in con-
structing DNA fingerprint ID of cultivars. The DNA fingerprint ID was set up, including serial number of National Nursery of
Sugarcane Germplasm Resources (NNSGR), country & region code, breeding institute, core primer name and SSR marker data,
第 2期 刘新龙等: 云南甘蔗自育品种 DNA指纹身份证构建 203


which not only consists of the important information of cultivars, but also helps researchers to identify cultivars efficiently. At the
same time, it can provide reliable scientific evidence for the protection of intellectual property right for these cultivars.
Keywords: Yunnan sugarcane cultivar; SSR; DNA; Fingerprint; ID
我国甘蔗品种选育始于 20世纪 50年代, 至“十
五”期间 , 已育成近 200 个甘蔗新品种 , 其中以“九
五”和“十五”期间发展最快, 通过省级以上审定的品
种就有 50个[1-2]。随着新育品种的不断增加, 骨干亲
本的重复使用, 新基因资源的缺乏, 新育成品种的
鉴定难度逐渐加大; 加之蔗区间引种缺乏有效科学
的管理和途径, 一些单位受商业利益的驱动掩盖或
篡改品种名称, 导致一些品种名称出现混乱, 仅靠
表型性状已难于准确区分, 因此建立一套客观、可
靠、易操作的鉴别技术对品种的鉴定和知识产权保
护具有重要意义。DNA标记技术的发展和检测技术
的日趋完善, 使从 DNA层次上对品种进行快速、准
确、不受环境条件影响的鉴定成为可能[3]。目前, 国
际植物新品种保护联盟(UPOV)已将 DNA 标记的鉴
定纳入农作物品种 DUS 测试内容, 我国也将 DNA
水平鉴定作为品种质量监控的重要措施, 为品种保
护提供理论基础和法律依据[4]。在众多 DNA标记技
术中, 前人的研究表明, SSR指纹技术是目前用于种
子纯度和品种真实性鉴定的最适宜技术, 其优点是
简便快速、稳定性高、重复性好、费用相对低廉及
多态性丰富[5-6]。目前水稻[7-9]、玉米[10,11-13]、小麦[4,14]、
大豆[3]、油菜[15-16]等农作物部分品种的 SSR 指纹图
谱已相继完成, 为品种的鉴定和知识产权保护提供
了有力的保障。在甘蔗品种方面, 2003 年美国农业
部 Pan 等[17]使用 3 个 SSR 引物构建了 Florida 甘蔗
育种场 25个甘蔗商业品种的分子指纹图谱, 通过与
RAPD 标记的比较, 认为 SSR 标记比 RAPD 标记更
准确, 多态性信息量更大, 更能准确鉴定不同商业
品种 , 并于 2007 年使用 21 对 SSR 引物建立了
Louisiana 116个商业品种的分子指纹数据[18]。2004
年澳大利亚BSES育种公司利用 SSR标记建立了 180
个甘蔗品种的分子指纹图谱数据, 为澳大利亚甘蔗
品种提供了有效的鉴定方法[19]。国内游建华等[20]、
劳方业等[21]、庄南生等[22]和李鸣等[23] 虽使用 AFLP
和 SSR标记对广西主栽甘蔗品种、崖城系列甘蔗亲
本品系及甘蔗种质开展了遗传多样性研究, 探讨了
上述种质之间的遗传关系, 但对于甘蔗品种的分子
身份证研究还未真正开展起来。本研究拟选用云南
甘蔗育种单位自育的 27份甘蔗品种, 建立其 SSR分
子指纹身份证, 为品种在分子水平上的鉴定和知识
产权保护提供可靠科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
27份甘蔗良种(表 1)中 19个品种通过国家、省
级审定, 8 个品种进入国家或云南省甘蔗品种区试,
有希望在“十一五”期间通过省级以上审定。同时选
取 10 个中国蔗区主栽品种(不包括云南甘蔗自育品
种)来检验核心引物组合效率。所有品种叶片组织由国
家甘蔗种质资源开远圃(National Nursery of Sugarcane
Germplasm Resources, NNSGR)和云南省农科院甘蔗
研究所(Yunnan Sugarcane Research Institute, YSRI)
提供。
1.2 叶片基因组 DNA提取与 SSR分析
参照蔡青等[24]方法并略加改进提取品种叶片基
因组 DNA, 对每个品种采集 10 个无性系单株新叶,
混合后并迅速剪碎并在−20℃冰箱中冷冻 , 于次日
加入预冷的 CTAB 抽提液在 RECH Mix Mills301
DNA 研磨机上研磨成浆 , 其他步骤同常规 CTAB
法。参照Karen等[25]方法进行 SSR反应及 PCR扩增。
扩增产物经 95℃变性后在 5%的变性聚丙烯酰胺凝
胶上电泳分离。采用刘新龙等[26]建立的快速银染法
染色。
1.3 数据统计分析
采用人工读带的方式, 每对 SSR 引物检测 1 个
位点, 在相同迁移位置上, 有带记为 1, 无带记为 0,
每条带相当 1 个等位基因建立 0-1 矩阵。使用标记
位点的多态性条带比率(percentage of polymorphic
bands, PPB), Jaccard (1908)遗传相似性 (genetic
similarity, GS)、多态信息量(polymorphism informa-
tion content, PIC)、品种聚类区分率(rate of distin-
guishing cultivars by cluster, RDCC)鉴别引物, 其中
PPB = a/(a+b), Gsij=a/(a+b+c), a为两个个体的共享
片段数, b 和 c 为 i 个体和 j 个体各自拥有的多态片
段数; PIC = 1–ΣPi2, Pi为第 i个位点的基因型频率[27],
RDVC = (N–Ni)/N, Ni为无法区分品种数, N为品种总
数。遗传相似性与 UPGMA (unweighted pair group
method analysis)聚类分析通过 NTSYSpc2.1软件实现。
204 作 物 学 报 第 36卷

表 1 品种名称及来源
Table 1 Name and origin of cultivars
No. 品种名称
Cultivar name
国圃号
Serial No. of NNSGR
品种审定级别
Level of cultivar certi-
fication
育成单位
Breeding institute
1 云蔗 64-24 Yunzhe 64-24 CH1257 省级 Province level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
2 云蔗 65-55 Yunzhe 65-55 CH0553 省级 Province level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
3 云蔗 5-225 Yunzhe 65-225 CH0569 省级 Province level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
4 云蔗 68-154 Yunzhe 68-154 CHO542 省级 Province level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
5 云蔗 71-95 Yunzhe 71-95 CHO577 省级 Province level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
6 云蔗 71-545 Yunzhe 71-95 CH0556 省级 Province level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
7 云蔗 71-388 Yunzhe 71-388 CH0570 省级 Province level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
8 云蔗 71-998 Yunzhe 71-998 CH0564 省级 Province level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
9 云蔗 81-173 Yunzhe 81-173 CH0571 省级 Province level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
10 云辐 82-682 Yunzhe 82-682 CH0539 省级 Province level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
11 云辐 84-Fb5 Yunzhe 84-Fb5 CH0535 国家级 State level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
12 云蔗 89-7 Yunzhe 89-7 CH0816 国家级 State level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
13 云蔗 89-151 Yunzhe 89-151 CH0811 国家级 State level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
14 云蔗 89-351 Yunzhe 89-351 CH0814 国家级 State level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
15 云蔗 92-19 Yunzhe 92-19 CH1119 省级 Province level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
16 德蔗 93-88 Dezhe 93-88 CH1206 省级 Province level 云南省德宏州甘蔗科学研究所 DHSRI
17 云蔗 94-375 Yunzhe 92-19 CH1123 国家级 State level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
18 云蔗 98-46 Yunzhe 98-46 待编 No number 省级 Province level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
19 云蔗 99-91 Yunzhe 99-91 待编 No number 未审定 No certification 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
20 云蔗 99-155 Yunzhe 99-155 CH1200 省级 Province level 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
21 云蔗 99-596 Yunzhe 99-596 待编 No number 未审定 No certification 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
22 云蔗 99-601 Yunzhe 99-601 待编 No number 未审定 No certification 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
23 云蔗 02-2332 Yunzhe 02-2332 待编 No number 未审定 No certification 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
24 云蔗 03-194 Yunzhe 03-194 待编 No number 未审定 No certification 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
25 云蔗 03-103 Yunzhe 03-103 待编 No number 未审定 No certification 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
26 云蔗 03-332 Yunzhe 03-332 待编 No number 未审定 No certification 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
27 云蔗 03-258 Yunzhe 03-258 待编 No number 未审定 No certification 云南省农科院甘蔗研究所 YSRI
28 新台糖 16 ROC16 CH1001 国家级 State level 台湾糖业研究所 TSRI
29 新台糖 25 ROC25 CH1022 省级 Province level 台湾糖业研究所 TSRI
30 新台糖 10 ROC10 CH0473 省级 Province level 台湾糖业研究所 TSRI
31 新台糖 22 ROC22 CH1002 国家级 State level 台湾糖业研究所 TSRI
32 新台糖 20 ROC20 CH1005 省级 Province level 台湾糖业研究所 TSRI
33 桂糖 11 Guitang 11 CH0497 国家级 State level 广西甘蔗研究所 GSRI
34 桂糖 17 Guitang 17 CH1097 国家级 State level 广西甘蔗研究所 GSRI
35 粤糖 86-368 Yuetang 86-368 CH1113 国家级 State level 广州甘蔗糖业研究所 GSIRI
36 粤糖 93-159 Yuetang 93-159 CH1126 省级 Province level 广州甘蔗糖业研究所 GSIRI
37 闽糖 69-421 Mintang 69-421 待编 No number 未审定 No certification 福建甘蔗研究所 FSRI
NNSGR: National Nursery of Sugarcane Germplasm Resources; YSRI: Yunnan Sugarcane Research Institute; DHSRI: Dehong Sugar-
cane Research Institute; TSRI: Taiwan Sugar Research Institute; GSRI: Guangxi Sugarcane Research Institute; GSIRI: Guangzhou Sugarcane
Industry Research Institute; FSRI: Fujian Sugarcane Research Institute.

1.4 PCR产物片段大小估算
根据分子量Marker的片段大小的对数值与电泳
迁移距离绘制出DNA分子量标准曲线图, 然后用直
尺量出每个扩增片段在胶板上的迁移距离 , 依据
DNA分子量标准曲线图计算出每个片段的分子量, 同
时根据 0-1矩阵绘制胶板图的标准化图。
第 2期 刘新龙等: 云南甘蔗自育品种 DNA指纹身份证构建 205


2 结果与分析
2.1 核心引物区分效率分析
选择合适的引物是开展 DNA 指纹图谱研究的
关键因素之一[28]。DNA指纹图谱核心引物应具备等
位基因数量多、多态性丰富、品种区分率高、易统
计和扩增条带稳定等条件。本研究先从国际微卫星
协会提供的 120 对 SSR 引物中筛选出 27 对等位基
因数量多、多态性比较丰富、扩增条带稳定的 SSR
引物, 然后再从中选出整体表现比较优异的 8 对 SSR
引物(表 2 和表 3)组成构建甘蔗 DNA 指纹身份证的
核心引物, SSR引物扩增胶板见图 1, 胶板的标准化
图见图 2。8 对核心引物共获得 129 条带, 其中 123
个为多态带, 多态条带比例为 95.35%, 品种特异条
带 7个(某一品种独有条带), 品种最大相似性系数为
0.767, 可完全有效区分所有云南甘蔗自育品种。品
种最大相似性系数越高, 品种聚类区分率越低, 表
明引物区分效率越低。从单对引物来看, MSSCIR21
的品种最大相似性系数最低, 为 0.833, 聚类区分率
为 100%, 可以完全区分所有云南甘蔗自育品种, 是最
有效的核心引物, 其次为 SMC1047HA; 而 SMC21SA
的品种最大相似性系数为 1.000, 品种聚类区分率为
74%, 两项指标都最低, 为区分效率最差的核心引物。
2.2 核心引物组合效率分析
虽然部分单对核心引物能够完全区分所有云南
甘蔗自育品种, 但品种最大相似性系数达到了 0.833,
随着以后自育品种数量的增多, 单个引物的区分效
率将会明显下降, 因此有必要使用多对引物进行鉴
定。为了选出有效的引物组合, 将 8 对引物进行两
两组合, 从表 4可以看出, 28个组合中 26个组合可以
将品种完全区分开, 引物组合 MSSCIR26/SMC336BS,
SMC21SA/MSSCIR66品种最大相似性系数为 1.000,
品种聚类区分率为 93%, 有两个品种无法区分, 因
此属于低效的引物组合 ; 而引物组合 MSSCIR36/
MSSCIR21是最有效的, 品种最大相似性系数为 0.773,
最低, 品种聚类区分率为 100%; 其次为 MSSCIR16/
MSSCIR36, 第 3为 MSSCIR36/SMC336BS。整体来
看引物 MSSCIR36 是比较有效的组合引物, 与其他
引物组合具有很好的品种区分效果 , 其次为
MSSCIR21、SMC336BS、MSSCIR16。由于仅用两
对引物就可以将所有参试品种有效区分, 故选用双
引物组合产生的分子数据用于云南自育品种的
DNA指纹身份证构建。



图 1 云南甘蔗自育品种的 SSR扩增产物电泳图
Fig. 1 Gel map of SSR amplification of primer for Yunnan sugarcane cultivars
图中样品编号同表 1。The numbers for each lane correspond with the numbers for cultivar names listed in Table 1.
206 作 物 学 报 第 36卷



图 2 云南甘蔗自育品种的 SSR扩增产物标准化图
Fig. 2 Standard map of SSR amplification for Yunnan sugarcane cultivars
图中样品编号同表 1。The numbers for each lane correspond with the numbers for cultivar names listed in Table 1.

表 2 核心 SSR引物序列
Table 2 Core SSR primers sequences
引物名称
SSR primer
重复单位
Repeat unit
上游引物 (5′−3′)
Forward primer sequence
下游引物 (3′−5′)
Reverse primer sequence
退火温度
Annealing temp.(℃)
SMC1047HA (GA)26 TGAGCCTAAGCCAGAAAGAAG GGAACTAATTTCCTACGAGAACAC 50
MSSCIR21 (GA)2GG(GA)23 CGCCAGCCACATAAAAGG CGACCAGGAGTTCATCAA 54
MSSCIR16 (GA)18 TGGGGAGGGCTGACTAGA GGCGGTATATATGCTGTG 54
MSSCIR36 (GA)18GT(GA)4 CAACAATAACTTAACTGGTA CTGTCCTTTTTATTCTCTTT 54
SMC336BS (TG)23(AG)19 ATTCTAGTGCCAATCCATCTCA CATGCCAACTTCCAAACAGAC 50
MSSCIR26 (GA)17 AAAATCAGACAAACAGCAT AGAAGAAGCAGATACAGGT 54
MSSCIR66 (GT)43GC(GT)6 AGGTGATTTAGCAGCATA CACAAATAAACCCAATGA 54
SMC21SA (GA)19 CGTGAGCTTGGGTAGCTG AAACATTCCCCATTGCTATC 50

表 3 核心引物效率情况
Table 3 Efficiency of core primers
核心引物
Core primer
总带数
Total band
多态带
PB
多态条带比例
PPB
特异条带
Specific band
多态信息量
PIC
品种最大相似性系数
The biggest GS
between cultivars
品种聚类区分率
RDVC
(%)
SMC1047HA 20 19 95.00 2 0.9630 0.900 100
MSSCIR21 20 19 95.00 0 0.9630 0.833 100
MSSCIR16 17 15 88.24 0 0.9602 1.000 93
MSSCIR36 18 17 94.44 2 0.9602 1.000 93
SMC336BS 13 13 100.00 0 0.9465 1.000 85
MSSCIR26 13 12 92.31 2 0.9355 1.000 81
MSSCIR66 14 14 100.00 0 0.9218 1.000 78
SMC21SA 14 14 100.00 1 0.9054 1.000 74
合计 Total 129 123 95.35 7 0.9445 0.767 100
PB: polymorphic band; PPB: percentage of polymorphic bands; PIC: polymorphism information content; GS: genetic similarity; RDVC:
rate of distinguishing cultivars by cluster.
第 2期 刘新龙等: 云南甘蔗自育品种 DNA指纹身份证构建 207


表 4 核心引物组合效率
Table 4 Efficiency of core primer combination
引物组合
Primer combination
总带数
Total band
多态带
PB
多态条
带比例
PPB
特异条带
Specific band
品种最大相似性系数
The biggest GS
between cultivars
品种聚类区分率
RDVC
(%)
MSSCIR36/MSSCIR21 38 36 94.74 2 0.773 100
MSSCIR16/MSSCIR36 35 32 91.43 2 0.778 100
MSSCIR36/SMC336BS 31 30 96.77 2 0.786 100
SMC1047HA/MSSCIR36 38 36 94.74 4 0.800 100
MSSCIR21/MSSCIR66 34 33 97.06 0 0.800 100
MSSCIR36/MSSCIR66 32 31 96.88 2 0.800 100
SMC21SA/SMC336BS 27 27 100.00 1 0.800 100
MSSCIR16/MSSCIR21 37 34 91.89 0 0.810 100
MSSCIR26/MSSCIR36 31 29 93.55 4 0.813 100
MSSCIR26/MSSCIR66 27 26 96.30 2 0.824 100
SMC21SA/MSSCIR21 34 33 97.06 1 0.833 100
SMC1047HA/MSSCIR66 34 33 97.06 2 0.842 100
MSSCIR16/SMC336BS 30 28 93.33 0 0.846 100
MSSCIR16/SMC21SA 31 29 93.55 1 0.850 100
SMC1047HA/MSSCIR21 40 38 95.00 2 0.864 100
MSSCIR26/SMC21SA 27 26 96.30 3 0.875 100
SMC21SA/MSSCIR36 32 31 96.88 3 0.875 100
SMC336BS/MSSCIR21 33 32 96.97 0 0.875 100
MSSCIR16/SMC1047HA 37 34 91.89 2 0.875 100
MSSCIR26/MSSCIR21 33 31 93.94 2 0.889 100
MSSCIR16/MSSCIR26 30 27 90.00 2 0.889 100
SMC336BS/MSSCIR66 27 27 100.00 0 0.909 100
MSSCIR16/MSSCIR66 31 29 93.55 0 0.923 100
SMC1047HA/SMC21SA 34 33 97.06 3 0.929 100
SMC1047HA/SMC336BS 33 32 96.97 2 0.929 100
MSSCIR26/SMC1047HA 33 31 93.94 4 0.938 100
MSSCIR26/SMC336BS 26 25 96.15 2 1.000 93
SMC21SA/MSSCIR66 28 28 100.00 1 1.000 93
PB: polymorphic band; PPB: percentage of polymorphic bands; PIC: polymorphism information content; GS: genetic similarity; RDVC:
rate of distinguishing cultivars by cluster.

2.3 高效引物组合检验
为了增加所构建分子指纹身份证的实用性, 选
取中国蔗区种植面积较大的 10 个主栽品种(不包括
云南甘蔗自育品种)与 27 份云南甘蔗自育品种进行
相似性和聚类分析, 来检验排名前 3 的引物组合效
率(表 5)。评价结果表明, 3个引物组合对 37份品种
的聚类区分率都为 100%, 都能有效地区分所有参试
品种。从 37 份品种最大相似性系数来看, 引物组合
MSSCIR36/MSSCIR21 的最大, 为 0.882, 品种聚类
关系表现为云蔗 71-998与桂 11最为相似, 为 0.882,
其次为云蔗 65-225与云蔗 68-154, 为 0.773; 引物组
合 MSSCIR16/MSSCIR36、MSSCIR36/SMC336的品
种最大相似性系数都为 0.800, 从表面来看两个引物
组合效率相当, 但从不同引物组合得到的品种聚类
关系来看 MSSCIR16/MSSCIR36 的综合区分效率最
好, 可作为构建云南甘蔗自育品种分子指纹身份证
的最佳引物组合, 因为 MSSCIR16/MSSCIR36 表现
出的品种聚类关系中以主栽品种之间最为相似 ,
如桂 17 与粤糖 93-159 最为相似, 为 0.800, 其次为
ROC22 与 ROC10 为 0.789, 第 3 为云蔗 71-95 与云
蔗 03-103, 为 0.778, 与主栽品种最为相似的云南甘
蔗自育品种为云蔗 99-596, 为 0.667, 所以在保证能
有效区分云南甘蔗自育品种时, 还能十分有效地区
分云南甘蔗自育品种和主栽品种 ; 而 MSSCIR36/
208 作 物 学 报 第 36卷

SMC336 表现为云蔗 8-173 与桂 17 最为相似, 为
0.800, 其次为云蔗 65-225 与云蔗 68-154, 为 0.786,
效率不如 MSSCIR16×MSSCIR36。
2.4 DNA指纹数据库建立
为进一步提高 DNA 指纹身份证的实用性和参
考价值, 品种 DNA 指纹代码不仅包含分子数据, 还
应纳入品种的重要信息。故选用 5 组代码组成品种
DNA 指纹身份证, 第 1 组为国圃号, 即该品种全国
唯一代码, 参见国家甘蔗种质资源圃标准化数据库;
第 2 组为品种育成国家地区, 相应编号参照《现代
甘蔗育种的理论与实践》附录 II 品种系列名称对照
表[2]; 第 3组为品种育成单位, 为育种单位的英文缩
写; 第 4 组为核心引物名称; 第 5 组为 SSR 分子标
记数据。这里仅列举了 6 个品种的指纹数据作为示
范(表 6), 通过这些信息, 研究者可以十分方便地获取
品种的有关数据, 用于品种区分鉴定工作。
3 讨论
3.1 核心引物的选择和评价
核心引物的筛选和确定是 DNA 指纹图谱构建
的重要步骤[10], 其中标记引物的选择和核心引物的
确定是其中最关键的两个因素。SSR 标记由于其操
作简单快速、实验重复性高、多态信息丰富及费用
相对低廉, 目前已成为各大作物DNA指纹图谱构建
的首选标记, 并得到广泛应用[5-6]。对于确定核心引
物的参考标准, 二倍体作物由于其基因型相对简单
和等位基因频率容易计算, 因此选用多态信息量或
多样性指数、有效等位基因数、多态条带比例作为
确定核心引物的参考标准[11-16], 可以看出以上指标
的选择主要是从引物的多态性角度考虑, 对单对引
物或引物组合的实际鉴别效率考虑较少。鉴于此本
研究在选择多态信息量、多态条带比例的同时, 新
增品种最大相似性系数、品种聚类区分率两项指标
用于评价引物的鉴别效率。同时为了方便标记数据
的收集和准确度的把握 , 应尽量选择胶板清晰度
高、易于统计的 SSR 引物。核心引物确定后, 引物
的组合方式评价成为下一个关键问题, 本研究表明
简单地将多态性最高、区分率最强的引物组合在一
起, 并不是最有效的引物组合, 还应对引物的不同
组合进行科学评价。笔者建议先对引物两两组合进
行效率评价, 如果两个引物组合不足以有效区分所
有品种, 可增加引物数量, 对 3对引物、4对引物或
5 对引物等组合方式进行评价, 选出区分效率较高
的引物组合, 同时使用生产上的主栽品种对评价出
的高效引物组合进行效率检验, 最终确定用于 DNA
指纹分子身份证构建的最佳引物组合。本研究通过
对核心引物两两组合的效率评价表明引物
MSSCIR16 和 MSSCIR36 为最佳组合, 因此最后选
定 MSSCIR16和 MSSCIR36作为云南甘蔗自育品种
DNA指纹身份证构建的关键核心引物。

表 5 高效引物组合效率检验
Table 5 Efficiency analysis of the best primer combinations
引物组合
Primer combination
总带数
Total band
多态带
PB
多态条
带比例
PPB
特异条带
Specific
band
品种最大相似性系数
The biggest GS
between cultivars
品种聚类区分率
RDVC
(%)
MSSCIR16/MSSCIR36 35 34 97.14 1 0.800 100
MSSCIR36/SMC336BS 31 30 96.77 1 0.800 100
MSSCIR36/MSSCIR21 38 36 97.37 1 0.882 100
PB: polymorphic band; PPB: percentage of polymorphic bands; PIC: polymorphism information content; GS: genetic similarity; RDVC:
rate of distinguishing cultivars by cluster.

表 6 6个品种的 DNA指纹 ID
Table 6 DNA fingerprint ID of six cultivars
品种名称
Cultivar name
国圃号+国家地区+育成单位+核心引物名称+SSR数据
Serial No. of NNSGR + country & region code+ breeding unit+ core primer name + SSR marker data
云蔗 68-154 Yunzhe 68-154 CHO542−CYZ−YSRI−MSSCIR36-011100010111110000-MSSCIR16-00000010010101111
云蔗 71-388 Yunzhe 71-388 CH0570−CYZ−YSRI−MSSCIR36-010010011111010000-MSSCIR16-10000011000001111
云辐 82-682 Yunzhe 82-682 CH0539−CYZ−YSRI−MSSCIR36-001100010111000000-MSSCIR16-00000010000100101
云蔗 89-7 Yunzhe 89-7 CH0816−CYZ−YSRI−MSSCIR36-000011111110001010-MSSCIR16-10110000101101111
云蔗 92-19 Yunzhe 92-19 CH1119−CYZ−YSRI−MSSCIR36-000110001110010001-MSSCIR16-10001100000011111
云蔗 94-375 Yunzhe 94-375 CH1123−CYZ−YSRI−MSSCIR36-011001011111100001-MSSCIR16-10000010110011111
第 2期 刘新龙等: 云南甘蔗自育品种 DNA指纹身份证构建 209


3.2 DNA指纹身份证构建方法
目前, 我国作物品种资源的生产和经营还很不
规范 , 品种引种混乱或品种造假的现象屡有发生 ,
极大地损害了品种专利拥有者和广大农民的经济利
益, 因此开展作物品种资源鉴定显得尤为重要[29]。
传统的鉴定方法依据表型特征, 虽然简单、经济、
快速, 但表型特征受环境影响大 [30], 鉴别错误率较
高, 加之品种的相似度越来越高, 导致鉴别越来越
困难。由于 DNA遗传物质受环境影响小、多态性高,
DNA技术已成为作物品种鉴定最有效的方法[5-6]。目
前大部分农作物的 SSR 指纹图谱或分子 ID 已相继
构建[7-16], 但这些指纹图谱或分子 ID 还仅仅是对分
子标记数据的数字化, 包含的信息量有限。对于甘
蔗品种, 美国、澳大利亚等研究者使用毛细管电泳
技术(CEQ)完成了部分品种的 SSR 指纹图谱研究,
但该技术所用仪器设备昂贵及试剂耗材昂贵, 限制
了其发展。国外建立的甘蔗品种指纹图谱数据库也
仅由分子数据构成, 还不能称为真正的DNA指纹身
份证。本研究借鉴国家居民身份证的格式, 将品种
的国圃号、国家地区、育种单位、引物名称和分子
数据有序地整合在一起, 形成每个品种唯一的识别
代码, 从这个指纹身份证代码, 研究者可以很方便
地获取品种的重要信息和分子数据用于品种区分鉴
定研究。
3.3 品种分子指纹身份证数据的可扩充性
由于甘蔗品种数目不是固定的, 每年各遗传育
种单位都会育出新的品种充实到品种库, 推广到生
产, 品种的分子指纹身份证数据也必将随着新品种
指纹数据的输入而得到不断扩大; 同时随着品种数
据库的不断增大, 现有引物组合的鉴定效率必将受
到影响, 因此品种分子指纹身份证数据也应该像居
民身份证一样具有可扩充性。当现有引物组合不能
满足品种鉴定需求时, 可增加新的有效核心引物数
据进入分子指纹数据库 , 从而确保数据库的准确
性、及时性和实用性。
4 结论
建立了云南甘蔗自育品种的 8对核心引物; 引物
MSSCIR16 和 MSSCIR36 组合可以有效地将所有品
种及主栽品种区分开, 为DNA指纹身份证构建的关
键核心引物; 使用品种的国圃号、国家地区、育种
单位、分子数据建立了品种的指纹身份证数据库,可
用于品种的真伪鉴定和知识产权保护。
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