全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(7): 1221−1231 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973 计划)项目(2011CB109300), 国家自然科学基金项目(31000724), 农作物种质资源保护项目
(NB2010-2130135-28B)和国家现代农业产业技术体系建设项目(CARS-14-种质资源评价)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 姜慧芳, E-mail: peanutlab@oilcrops.cn
第一作者联系方式: E-mail: tangmeitangyong@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2012-01-13; Accepted(接受日期): 2012-04-16; Published online(网络出版日期): 2012-05-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120511.1822.034.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01221
源于栽培种花生的 EST-SSR引物对野生花生扩增的多态性
唐 梅 1,2 陈玉宁 2 任小平 2 黄 莉 2 周小静 2 严海燕 1 姜慧芳 2,*
1 中南民族大学生命科学学院, 湖北武汉 430074; 2 中国农业科学院油料作物研究所 / 农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室,
湖北武汉 430062
摘 要: 以花生属 86份野生近缘种和 3份栽培种为材料, 利用从栽培种花生中开发设计的 EST-SSR引物, 分析其对
野生花生扩增的有效性, 探讨 EST-SSR引物用于花生资源遗传多样性研究的适用性。随机选取 235对 EST-SSR引物
进行筛选, 223对 EST-SSR引物均扩增出条带, 有效性为 94.89%, 其中能检测到多态性的 53对引物在 89份资源中共
扩增出 238条带, 包括 206条多态性带。每对引物能扩增出 1~12多态性带, 平均 3.89条, 多态性指数为 0.044~4.040,
平均 1.173。统计分析结果表明, 89 份花生种质材料间的平均相似系数为 0.685, 变异范围为 0.442~0.976, 在遗传距
离为 0.408处, 分成 2大组 9小组, 栽培种花生被聚在花生区组中, 相同区组的材料基本被聚在一起, A. duranensis与
栽培种花生(A. hypogaea L.)的关系较近, 聚类结果与花生属的植物学分类基本一致。对含油量和基因型数据相关性分
析和 t检验发现, POCR437-180/170等 6对标记可以作为含油量相关分析标记筛选的后备标记。用这 6对标记的引物
序列搜索 cDNA 文库和 BLAST 库, 发现引物 POCR437 序列对应丙二酸单酰-CoA-ACP 转酰酶和酰基载体蛋白的编
码基因, 这 2种蛋白质参与脂肪酸的合成。
关键词: 野生花生; EST-SSR; 有效性; 聚类分析
Genetic Diversity of Arachis Accessions Detected by EST-SSR from Cultivated
Peanut (Arachis hypogaea L.)
TANG Mei1,2, CHEN Yu-Ning2, REN Xiao-Ping2, HUANG Li2, ZHOU Xiao-Jing2, YAN Hai-Yan1, and
JIANG Hui-Hang2,*
1 College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China; 2 Oil Crops Research Institute of the Chinese Academy
of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062, China
Abstract: The amplification efficiency and application potential for the research on peanut genetic diversity by using culti-
vars-derived EST-SSR primers in 89 Arachis aeecssions were assessed. Based on randomly selected 235 EST-SSR primer pairs,
we detected 223 amplification bands in the 89 accessions with the amplification efficiency of 94.89%. Among them, 53 primer
pairs exhibited 206 polymorphic bands, which showed 1–12 bands per primer pair with an average of 3.89. The polymorphism
index ranged from 0.044 to 4.040 with an average of 1.173. The average similarity coefficient was 0.685 among 89 peanut acces-
sions, ranging from 0.442 to 0.976. The accessions from the same section were mainly clustered together, peanut cultivars were
grouped into the section of Arachis, and A. duranensis had a close relation to cultivated peanut, which is coincident with botanical
classification. According to the statistical analysis from the results of oil content and SSR data in wild peanuts, some interesting
bands such as POCR437-180/170 were found to be potential for candidate markers related to oil content. BLAST analysis indi-
cated that the alignment sequence of primer POCR437 corresponded to the coding genes of malonyl-CoA-ACP transacylase and
acyl-carrier-protein, both of which are involved in fatty acid synthesis.
Keywords: Wild peanut; EST-SSR; Effectiveness; Cluster analysis
1222 作 物 学 报 第 38卷

花生属(Arachis)隶属豆科(Legume), 蝶形花亚
科(Faboideae; Paplionoideae), 包含 9 个区组(section)
80个种(species), 其中, A. hypogaea L.为栽培种, 其
他均为野生种。花生属野生种具有对许多病虫害的
高度抗性 [1-3] 和优良的品质特性(如特高油)[4-6], 因
此 , 有必要探索利用野生花生资源来拓宽栽培种
花生抗病和优质的遗传基础。通过分子标记技术研
究花生资源的遗传多样性、亲缘关系, 并进行目标
基因的精细定位是利用野生花生改良栽培种花生
的基础性课题。然而, 由于花生中的 SSR标记引物
较少 , 导致目前花生的连锁图还很不完善。因此 ,
在花生的基础研究中, 迫切需要大量开发 SSR 标
记引物。
EST-SSR 是近年来发展起来的新型分子标记,
目前已在小麦[7-8]、甘蔗[9]、玉米[10]、水稻[8,11]和大
豆[12]等植物中建立了一批 EST-SSR标记, 广泛且有
效地应用于物种的遗传分析。EST-SSR 除具一般
SSR 分子标记特点外, 还具有以下优点: (1)开发简
单、快捷、费用低[13-14]; (2)通用性好, EST-SSR作为
基因的一部分, 通常其侧翼序列保守性较高, 在近
源物种中有较高水平的可转移性[15]; (3)它是功能标
记, 提供基因表达信息, 使直接鉴定决定重要性状
的等位基因成为可能[16]。所以基于 EST 序列进行
SSR标记的发掘已成为目前植物 SSR标记开发的重
点 [8]。梁炫强等 [17-18]报道证明源于栽培种花生的
EST-SSR 标记在野生种中具有可转移性。本实验室
在前期研究中, 构建了栽培种花生根、茎、叶和种
子的 5 个 cDNA 文库, 通过测序获得了大量的 EST
序列。本研究的目的是鉴定这些 EST-SSR引物在野
生花生中扩增的有效性 , 并通过这些有效的
EST-SSR引物研究花生属种间亲缘关系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
来自国家野生花生圃的 86份野生种资源(二倍
体 79份, 四倍体 7份)和 3份花生栽培种资源, 分别
属于 5个区组的 21个种, 其编号、种名及所属区组
见表 1。
1.2 DNA提取
采用改良CTAB法提取叶片DNA, 用 0.8%琼脂
糖凝胶电泳检测 DNA 浓度与纯度 , 并根据对照
λDNA的亮度估计花生基因组 DNA的浓度, 将全部
DNA浓度调至 20~50 ng µL–1。
1.3 PCR分析
根据本实验室从高油抗青枯病花生材料
“06-4104”构建的 5 个 cDNA 文库获得的 63 207条
EST, 经 MISA检索, 发现 2 643个 SSR位点, 分布
于 2 250条 EST中, 发生频率为 15.5%, 其中, 三核
苷酸和二核苷酸重复是最主要的 SSR 类型, 分别占
49.1%和 45.8%。在发现的 46类重复基序中, AG/TC
重复基序的频率最高, AAG/TTC次之。利用 Primer3
软件从含有 SSR 的 2 250 条 EST 中共设计并由
Invitrogen 公司合成 726 对。在 726 对 EST-SSR 引
物中随机取 235 对进行多态性筛选, PCR 反应体系
为 10 μL, 含 10 mmol L–1 Tris-HCl (pH 8.3)、50 mmol
L–1 KCl、300~400 μmol L–1 dNTPs、10~40 pmol L–1
引物对、10~20 ng基因组 DNA模板、2~4 mmol L–1
MgCl2、0.8~1.2 U Taq聚合酶。反应程序为 95℃预
变性 5 min、95℃变性 1 min、50~65℃ (引物的最佳
退火温度)复性 40 s、72℃延伸 1 min, 共 35个循环,
最后 72℃延伸 10 min。PCR产物经 6%变性聚丙烯
酰胺凝胶电泳检测, 硝酸银染色, 扫描保存。
1.4 数据分析
有扩增条带赋值 1, 无条带赋值 0, 输入
Microsoft Access 数据库中。多态性比例=多态性位
点数 /总位点数 , 采用唐荣华等 [19]报道的方法统计
多态性指数。用 NTSYS pc V2.1软件[20]计算品种间
遗传相似系数(genetic similarity, GS), 利用获得的
相似矩阵进行 UPGMA聚类分析。
2 结果与分析
2.1 EST-SSR引物在野生花生中的扩增
5 份来源于不同区组的野生花生通过 235对
EST-SSR引物的扩增, 223对 EST-SSR引物均扩增出
条带, 有效扩增比例为 94.89%。用这 223 对引物扩
增 89份野生和栽培种质, 53对 EST-SSR引物检测到
有多态性, 多态性比例为 22.55%。从表 2可以看出,
53对EST-SSR引物在野生花生中的多态性比例范围
为 20%~100%, 平均值为 87%, 其中 POCR325最低
(20%), POCR207 等 29 个引物多态性比例最高, 均
为 100%。多态性指数变化范围为 0.044~4.040, 平均
值为 1.173, 引物 POCR610 多态性指数最小, 为
0.044, 引物 POCR478 最大, 为 4.040。不同野生花
生存在 EST-SSR扩增的特异性。条带 POCR318/800、
POCR319/800、POCR561/200、POCR609/275 和
POCR610/535 仅在 WH10026 中出现, 条带 POCR
第 7期 唐 梅等: 源于栽培种花生的 EST-SSR引物对野生花生扩增的多态性 1223


表 1 供试花生 89份材料
Table 1 Eighty-nine peanut accessions for the experiment
序号
No.
编号
Code
种名
Name
区组
Section
平均含油量
Average oil content (%)
1 WH4367 A. rigonii 匍匐 Procumbentes 58.47
2 WH4370 A. rigonii 匍匐 Procumbentes 54.31
3 WH4354 A. paraguariensis 直立 Erectoides 55.90
4 WH4371 A. paraguariensis 直立 Erectoides 56.08
5 WH4369 A. duranensis 花生 Arachis 55.48
6 WH10057 A. duranensis 花生 Arachis 55.88
7 WH4372 A. duranensis 花生 Arachis 57.35
8 WH4373 Arachis sp.9835 不确定 Unknown 55.75
9 WH4375 Arachis sp. 不确定 Unknown 56.14
10 WH4352 A. pusilla 异形花 Heteranthae 56.69
11 WH4368 A. pusilla 异形花 Heteranthae 55.41
12 WH4376 A. appressipila 匍匐 Procumbentes 57.10
13 WH4359 Arachis sp. 不确定 Unknown 55.10
14 WH4361 Arachis sp. 不确定 Unknown 56.83
15 WH4377 A. duranensis 花生 Arachis 59.02
16 WH4379 A. duranensis 花生 Arachis 55.94
17 WH4349 A. helodes 花生 Arachis 55.83
18 WH4380 A. kuhlmannii 花生 Arachis 55.73
19 WH4381 A. oteroi 直立 Erectoides 57.27
20 WH4348 A. chacoense 花生 Arachis 55.85
21 WH4383 A. cardenasii 花生 Arachis 54.84
22 WH4363 A. stenosperma 花生 Arachis 57.09
23 WH4342 A. stenosperma 花生 Arachis 56.01
24 WH4387 Arachis sp.338297 不确定 Unknown 57.11
25 WH4343 A. stenosperma 花生 Arachis 55.40
26 WH4346 A. correntina 花生 Arachis 56.56
27 WH4344 A. correntina 花生 Arachis 55.40
28 WH4345 A. correntina 花生 Arachis 55.23
29 WH4332 A. monticola 花生 Arachis 55.29
30 WH4355 A. monticola 花生 Arachis 56.67
31 WH4334 A. duranensis 花生 Arachis 56.83
32 WH4331 A. monticola 花生 Arachis 58.12
33 WH4337 A. villosa 花生 Arachis 59.09
34 WH4389 A. oteroi 直立 Erectoides 57.08
35 WH4390 A. chacoense 花生 Arachis 55.00
36 WH4391 A. cardenasii 花生 Arachis 55.84
37 WH4392 A. cardenasii 花生 Arachis 55.66
38 WH4393 A. villosa 花生 Arachis 53.98
39 WH4339 A. villosa 花生 Arachis 54.85
40 WH10065 Arachis sp. 不确定 Unknown 56.62
41 WH4397 A. duranensis 花生 Arachis 55.55
42 WH4398 A. duranensis 花生 Arachis 55.36
43 WH4399 A. duranensis 花生 Arachis 57.57
44 WH4340 A. duranensis 花生 Arachis 57.03
1224 作 物 学 报 第 38卷

(续表 1)
序号
No.
编号
Code
种名
Name
区组
Section
平均含油量
Average oil content (%)
45 WH4341 A. duranensis 花生 Arachis 55.39
46 WH4400 A. hoehnei 花生 Arachis 55.18
47 WH4401 A. batizocoi 花生 Arachis 55.47
48 WH4403 A. duranensis 花生 Arachis 55.67
49 WH4404 A. duranensis 花生 Arachis 56.57
50 WH4405 A. paraguariensis 直立 Erectoides 55.57
51 WH4407 A. batizocoi 花生 Arachis 55.40
52 WH4410 Arachis sp.289637 不确定 Unknown 57.43
53 WH4412 A. paraguariensis 直立 Erectoides 55.78
54 WH4413 Arachis sp. 不确定 Unknown 58.51
55 WH4414 A. duranensis 花生 Arachis 57.87
56 WH4415 A. duranensis 花生 Arachis 55.47
57 WH4416 A. duranensis 花生 Arachis 54.98
58 WH4417 A. duranensis 花生 Arachis 55.48
59 WH4418 A. batizocoi 花生 Arachis 56.27
60 WH10022 A. appressipila 匍匐 Procumbentes 55.30
61 WH10023 Arachis sp. 不确定 Unknown 55.02
62 WH10024 A. duranensis 花生 Arachis 56.87
63 WH10073 Arachis sp. 不确定 Unknown 56.42
64 WH10070 A. chiquitana 匍匐 Procumbentes 56.70
65 WH10071 A. duranensis 花生 Arachis 56.37
66 WH7631 中花 8号 Zhonghua 8 花生 Arachis 55.68
67 WH7635 中花 12 Zhonghua 12 花生 Arachis 56.19
68 WH6996 白沙 1016 Baisha 1016 花生 Arachis 52.90
69 WH4386 A. paraguariensis 直立 Erectoides 58.62
70 WH4364 A. duranensis 花生 Arachis 57.23
71 WH4409 Arachis sp. 不确定 Unknown 58.96
72 WH10026 A. rigonii 匍匐 Procumbentes 62.82
73 WH10034 A. duranensis 花生 Arachis 57.82
74 WH10058 A. rigonii 匍匐 Procumbentes 59.21
75 WH4378 A. macedoi 围脉 Exranervosae 56.76
76 WH4335 A. monticola 花生 Arachis 59.47
77 WH4330 A. monticola 花生 Arachis 58.07
78 WH4336 A. villosa 花生 Arachis 59.46
79 WH4338 A. villosa 花生 Arachis 58.79
80 WH4395 Arachis sp.289639 不确定 Unknown 57.63
81 WH4365 A. villosa 花生 Arachis 60.64
82 WH4396 A. duranensis 花生 Arachis 57.96
83 WH4406 A. batizocoi 花生 Arachis 57.45
84 WH4357 A. cryptopotamica 直立 Erectoides 56.88
85 WH4356 Arachis sp.30089 不确定 Unknown 57.60
86 WH4347 A. duranensis 花生 Arachis 57.86
87 WH4411 A. hoehnei 花生 Arachis 56.91
88 WH10072 Arachis sp. 不确定 Unknown 58.34
89 WH10025 A. monticola 花生 Arachis 59.79
第 7期 唐 梅等: 源于栽培种花生的 EST-SSR引物对野生花生扩增的多态性 1225


表 2 EST-SSR标记在不同花生品种间的多态性
Table 2 Polymorphism for each EST-SSR marker in peanut cultivars
区组材料中扩增的多态性 Amplified polymorphism in sections
引物
Primer
重复单元
Repeat motif
总位
点数
Total
sites
多态性
位点数
Poly.
sites
多态性
比例
Poly.
ratio
多态性
指数
Poly.
index
花生
区组
Ara-
chis
直立
区组
Erec-
toides
匍匐区组
Procum-
bentes
围脉
区组
Exraner-
vosae
异形花
区组
Heter-
anthae
不确定
区组
Unknown
POCR202 (TC)7 6 2 33 0.492 1 1 1 1 0 2
POCR207 (AG)8 2 2 100 0.714 2 2 2 2 2 2
POCR218 (GA)15 3 2 67 0.722 2 2 2 1 1 2
POCR222 (TC)6 2 1 50 0.309 1 1 1 0 1 1
POCR223 (AG)6 4 4 100 1.585 4 4 4 3 4 4
POCR318 (CA)8 3 3 100 0.565 2 2 3 2 2 2
POCR319 (CA)8 3 3 100 0.517 2 2 2 2 1 2
POCR321 (AC)6,
(CT)13
2 2 100 0.519 2 2 2 1 2 2
POCR325 (CT), (TC)9 5 1 20 0.065 1 1 0 0 0 0
POCR328 (AT)7 2 1 50 0.467 1 1 1 1 1 1
POCR334 (TC), (CT)8 2 1 50 0.106 1 1 0 0 0 1
POCR339 (AG)8 2 1 50 0.482 1 1 1 1 0 1
POCR349 (CT)6 4 4 100 0.260 4 2 3 2 2 4
POCR386 (AG)8 4 4 100 1.270 4 4 4 2 3 4
POCR388 (CA)8,
(GA)10
3 2 67 0.879 2 2 2 1 1 2
POCR409 (AG)8 2 1 50 0.065 1 1 1 1 1 1
POCR410 (AG)10 2 1 50 0.164 1 1 1 1 1 1
POCR412 (CT)13,
(CTT)10
4 4 100 1.478 4 3 4 3 2 4
POCR415 (AG)12 4 3 75 0.651 2 2 3 2 1 3
POCR419 (GA)7 2 1 50 0.477 1 1 1 1 0 1
POCR437 (TC)6 3 2 67 0.981 2 2 2 2 1 2
POCR439 (GA)14 3 3 100 0.938 3 3 3 2 3 3
POCR454 (TC)14 2 1 50 0.742 1 1 1 1 1 1
POCR462 (AG)10 9 9 100 2.087 7 6 8 2 5 8
POCR478 (AG)6 12 12 100 4.038 12 10 10 1 10 10
POCR480 (GA)13 2 2 100 0.192 2 1 2 1 1 1
POCR485 (GA)7 5 5 100 1.818 5 5 4 3 3 5
POCR503 (GA)9 4 3 75 1.079 2 2 3 2 2 3
POCR509 (CT)9, (AT)6 5 5 100 1.815 5 5 5 3 2 5
POCR516 (GA)7 8 6 75 1.416 6 3 3 2 1 3
POCR517 (GA)7 6 6 100 2.138 6 5 4 4 2 5
POCR523 (TC)7 4 2 50 0.249 1 1 2 1 1 2
POCR527 (TC)8 3 2 67 0.862 2 2 1 2 1 2
POCR536 (TC)11 2 1 50 0.492 1 1 1 1 1 1
POCR541 (TC)19 6 6 100 1.137 4 3 5 2 3 5
POCR556 (CT)9 5 5 100 1.701 4 4 3 2 4 5
POCR557 (CT)9 5 5 100 1.717 5 5 4 2 4 5
POCR561 (TC)6 6 6 100 2.034 5 5 6 4 2 5
POCR562 (TC)8 7 7 100 2.488 7 7 6 5 5 7
POCR570 (TA)7 12 12 100 2.904 11 11 10 3 7 10
POCR577 (TA)6 2 2 100 0.622 2 2 2 1 2 2
POCR582 (TC)6 7 7 100 2.365 7 6 7 3 4 7
POCR607 (AT)8 2 1 50 0.477 1 1 1 1 1 1
POCR609 (GA)7 9 9 100 2.055 7 8 6 3 3 8
POCR610 (CT)12 3 2 67 0.044 1 1 2 1 1 1
POCR616 (GA)8 7 6 86 0.908 6 4 4 1 1 5
POCR617 (AC)7 4 4 100 0.462 3 3 2 1 2 2
POCR618 (CT)12 2 1 50 0.199 1 1 1 0 1 1
POCR623 (AG)6 4 3 75 0.738 3 2 3 1 1 2
XY-2 (AG)10 8 8 100 2.437 8 8 7 4 4 7
XY-17 (TTC)7 6 6 100 2.216 5 5 6 3 3 6
XY-34 (CTT)7 10 10 100 3.333 10 9 6 2 5 9
XY-38 (AGA)7 4 4 100 1.568 3 3 4 2 4 4
平均Mean 4.49 3.89 87 1.173 3.53 3.22 3.25 1.79 2.19 3.45
Poly: polymorphic.
1226 作 物 学 报 第 38卷

517/360、POCR617/180 仅在 WH4403 中出现, 条带
POCR516/344、POCR516/365仅在WH4407中出现, 条
带 POCR202/90仅在WH4413中出现, 条带 POCR516/
357 仅在 WH4404 中出现, 条带 POCR541/ 250 仅在
WH4375中出现, 条带 POCR570/320仅在WH4390和
WH4391中出现, 条带 POCR617/165仅在WH4381中
出现, 条带 POCR616/60仅在WH4338中出现。
53 对 EST-SSR引物在 89 份花生材料中共检测
出 238个位点, 206个为多态性位点, 多态率达 86.55%
(表 2)。每对 EST-SSR 引物在野生花生中能扩增出
1~12个多态性条带, 平均扩增 3.89个多态性条带。
引物 POCR478和XY-26扩增的多态性条带最多, 有
12个。综合分析 53对引物扩增的平均结果, 花生区
组材料平均 3.53 个多态性条带, 直立区组材料平均
3.22 个, 匍匐区组材料平均 3.25 个, 围脉区组材料
平均 1.79 个, 异形花区组材料平均 2.19 个, 不确定
区组材料平均 3.45 个。结果表明, 花生区组、直立
区组、匍匐区组材料的多态性条带均比围脉区组、
异形花区组材料多。引物 POCR325、POCR334 只
在花生区组、直立区组材料中扩增出多态性条带 ,
引物 POCR222、POCR618 仅在围脉区组材料中未
扩增出多态性条带。这说明不同区组的野生花生也
存在 EST-SSR扩增特异性。
2.2 基于 EST-SSR标记的花生遗传多样性分析
基于 53对 EST-SSR引物的扩增, 89份花生种质
之间的相似系数平均值为 0.685 (表 3), 变异范围为
0.442~0.976, 其中花生区组 A. duranensis的WH4369
与 WH4372 之间相似系数最大(0.976), 二者亲缘关系
较近; 花生区组的 A. duranensis (WH4415)与匍匐区组
的 A. rigonii (WH10026)相似系数最小(0.442), 二者亲
缘关系较远。从表 3 可以看出, 花生区组种质的平均
相似系数为0.686, 变异范围为0.490~0.976, 相似系数
小于 0.60 的有 441 个组合, 占 37.5%; 直立区组种质
的平均相似系数为0.662, 变异范围为0.558~0.825, 相
似系数小于 0.60的有 3个组合, 占 6.7%。可见虽然花
生区组的材料比直立区组多, 但直立区组种质间的遗
传分化程度大于花生区组。这些结果表明不同区组间
存在较大的遗传差异, 同一区组不同物种间也存在丰
富的遗传多样性。花生区组的 A. duranensis (WH4364)
与花生栽培种WH6996的相似系数为 0.951, 与 3份栽
培种的平均相似系数为 0.917。可见, A. duranensis
(WH4364)与花生栽培种亲缘关系较近。


表 3 不同区组材料间相似系数
Table 3 Similarity coefficient in different sections
相似系数 Similarity coefficient in sections
区组
Section
资源份数
Accession
number
最大值
Max
最小值
Min
平均值
Average
相似系数≤0.60的组数
No. of groups with
similarity coefficient
less than 0.60
相似系数≤0.60组数的比例
Percentage of groups with simi-
larity coefficient less than 0.60
(%)
花生 Arachis 57 0.976 0.490 0.686 441 37.5
直立 Erectoides 8 0.825 0.558 0.662 3 6.7
匍匐 Procumbentes 7 0.801 0.524 0.636 15 41.7
围脉 Exranervosae 1 — — — — —
异形花 Heteranthae 2 — — 0.816 0 0
不确定 Unknown 14 0.930 0.550 0.710 26 24.8


利用 NTSYS pc V2.10 软件绘制聚类图(图 1),
可以看出在遗传距离为 0.408处 89份花生材料可分
成 2 大组(A 和 B)。A 组共 37 份材料, 包括花生区
组的 20份野生种质和全部栽培种花生、少部分匍匐
区组种质、1 份直立区组种质、围脉区组种质、少
部分不确定区组种质; B组共 52份材料, 包括 28份
花生区组的野生种质、大部分匍匐区组种质、9 份
直立区组、全部异形花区组种质、大部分不确定区
组种质。
A组在遗传距离为 0.345时又可以进一步分为 5
个亚组(A1、A2、A3、A4和 A5)。匍匐区组 A. rigonii
的 WH4367、WH10026以及围脉区组 A. macedoi的
WH4378 与其他种质间的差异较大, 被单独聚为 3
个亚组(A1、A3 和 A5)。匍匐区组的 A. rigonii
(WH10058)与不确定区组的(WH4413)组成 A2 亚组,
遗传距离为 0.253。A4亚组共 32份材料, 包括花生
区组的 23份野生种和 3份栽培种、1份直立区组种
质、1 份围脉区组种质和 5 份不确定区组种质。花
生区组 A. monticola 的 2 份种质 (WH4355 和
WH4331)、A.villosa的 2份种质(WH4338和WH4365)
第 7期 唐 梅等: 源于栽培种花生的 EST-SSR引物对野生花生扩增的多态性 1227



图 1 基于 EST-SSR标记获得的的 89份花生属资源的聚类图
Fig. 1 Dendrogram of 89 accessions of Arachis based on EST-SSRs
A1、A2、A3、A4和 A5表示 A组在遗传距离为 0.345时进一步分为 5个亚组; B1、B2、B3和 B4表示 B组在遗传距离为 0.335时进
一步分为 4个亚组。
A1, A2, A3, A4, and A5: cluster A was further divided into five sub-clusters in the genetic distance of 0.345; B1, B2, B3, and B4: cluster B
was further divided into four sub-clusters in the genetic distance of 0.335.

1228 作 物 学 报 第 38卷

分别被聚在一起, 遗传距离分别为 0.044 和 0.073。
可见 A. monticola、A. villosa在种内不同种质间 DNA
水平上遗传变异都相对较小。花生栽培种材料被聚
在花生区组中, 与栽培种花生的植物学分类吻合。A
组的聚类结果也与花生属的区组分类基本一致。
B 组在遗传距离为 0.335 时可进一步分为 4 个
亚组(B1、B2、B3和 B4)。B1组共 48份材料, 包括
27 份花生区组的野生种质、4 份匍匐区组种质、7
份直立区组种质、2 份异形花区组种质和 8 份不确
定区组种质。B1组在遗传距离为 0. 678时进一步分
为 3 个亚亚组(B11、B12 和 B13)。匍匐区组的 A.
rigonii (WH4370)与直立区组的 A. paraguariensis
(WH4371)组成 B11 组, 相似系数为 0.253。B12 组
共 45份材料, 包括花生区组的 26份野生种、3份匍
匐区组种质、6份直立区组种质、2份异形花区组种
质和 8 份不确定区组种质。其中异形花区组 A. pu-
silla的 2份材料(WH4352和WH4368)被聚在同一小
组 , 平均遗传距离为 0.184, 花生区组 A. steno-
sperma 的 2 份种质(WH4363 和 WH4343)、A. cor-
rentina的 2份种质(WH4344和WH4345)分别被聚在
同一小组, 遗传距离分别为 0.189 和 0.151。花生区
组 A. duranensis的 WH4379被单独聚为 1个亚亚组
(B13 组)。花生区组 A. duranensis 的 WH10071 和
WH10024 被单独聚为 2 个亚组(B2 和 B4)。花生区
组 的 A. batizocoi (WH4401) 与 A. duranensis
(WH4415)组成 B3亚组, 遗传距离为 0.330。B组的
聚类结果与植物学花生属的区组分类也基本一致。
2.3 EST-SSR标记与含油量的相关性
根据 86 份野生花生参试材料的含油量变异及
分布 [5], 其含油量普遍较高, 将其相对划分为一个
高油群体和一个低油群体, 即含油量小于 55.5%的
划为低油材料, 共 22份, 平均含油量 55.15%, 变异
范围 53.98%~55.48%; 含油量大于 58%的划为高油
材料 , 共 16 份 , 平均含油量 59.21%, 变异范围
58.07%~62.82%。统计不同 EST-SSR 条带在高油和
低油材料中的差异。表明 206个差异条带中有 21个
条带能够有效区分高油材料和低油材料(表 4), 这些
差异条带为 13 对 EST-SSR 引物所扩增, 其中标记
POCR437-180、POCR462-155、POCR503-332、
POCR516-270、POCR517-375/365、POCR541-200、
POCR562/145、POCR561-165、XY-38-110为大部分
低油材料所拥有, 标记 POCR319-800、POCR419-
800、POCR437-170、POCR485-475/60、POCR516-
350、POCR517-120、POCR561-195/188、XY-17-237
为大部分高油材料所拥有。通过计算, 这 21个条带
区分低油和高油材料的检测符合率为 62.5%~100%。
其中标记 POCR437-180、POCR516-270、POCR517-
365、POCR517-375和 POCR561-165在 22份低油材

表 4 与含油量相关的 EST-SSR标记
Table 4 EST-SSR markers associated with oil content
标记
Marker
低油材料符
合率
Match rate
(%)
标记
Marker
高油材料符
合率
Match rate
(%)
86份材料中含有
低油标记的平均
含油量
A (%)
86份材料中含有
高油标记的平均
含油量
B (%)
86份材料中含有低
油高油标记材料含
油量 t检验 C
POCR437-180 72.7 POCR437-170 81.3 56.33 57.53 6.67E–4**
POCR516-270 72.7 POCR516-350 100.0 56.04 57.24 4.83E–5**
POCR517-365 90.9 POCR517-120 68.8 56.30 57.54 1.40E–4**
POCR517-375 90.9 POCR517-120 68.8 56.35 57.54 1.61E–4**
POCR561-165 77.3 POCR561-195 81.3 56.07 57.47 8.13E–7**
POCR561-165 77.3 POCR561-188 75.0 56.07 57.68 5.87E–7**
POCR462-155 68.2 POCR319-800 77.3
POCR503-332 77.3 POCR419-800 68.8
POCR541-200 68.2 POCR485-475 62.5
POCR562-151 68.2 POCR485-460 68.8
POCR 562-145 68.2 XY-17-237 75.0
XY-38-110 68.2
**表示在 0.01水平差异显著。
** Significant at P<0.01. A: the average oil content of the material with low oil content marker in 86 accessions (%); B: the average oil
content of the material with high oil content marker in 86 accessions (%); C: t-test of oil content with markers associated with high oil or low
oil content in 86 accessions.

第 7期 唐 梅等: 源于栽培种花生的 EST-SSR引物对野生花生扩增的多态性 1229


料中的检测符合率较高 , 分别为 72.7%、72.7%、
90.9%、 90.9%和 77.3%, 标记 POCR437-170、
POCR516-350、 POCR517-120、 POCR561-195 和
POCR561-188 在 16 份高油材料中的检测符合率分
别为 81.3%、100%、68.8%、81.3%和 75.0%。结果表
明, POCR437-180/170、POCR516-270/350、POCR517-
365/120、POCR517-375/120、POCR561-165/188、
POCR561-165/195为较好区分低油/高油的标记。其
他 11个条带在这 38份材料中检测结果较差。
统计这 6对标记在 86份材料中的扩增情况, 以
鉴定其检测效率。经 t 检验, POCR437-180/170、
POCR516-270/350、POCR517-365/120、POCR517-
375/120、POCR561-165/188、POCR561-165/195 等
6 对含有低油/高油标记的材料的平均含油量均达极
显著差异。进一步用这 6 对标记的引物序列, 搜索
cDNA 文库和 BLAST 库, 发现引物 POCR437 序列
(F: 5′-TCCGAACCTCACATTCTTCC-3′, R: 5′-TGGA
GGGTTTGTAATCGGAG-3′)对应丙二酸单酰 -CoA-
ACP 转酰酶和酰基载体蛋白的编码基因, 基因序列
号分别为 gb|AAG43518.1 和 AF210698.1, E 值分别
为 3E-50和 9E-49, 均呈显著相关。
3 讨论
3.1 源于栽培种的 EST-SSR 标记对扩增野生花
生的有效性
梁炫强等 [17-18]曾用来源于栽培种花生的 EST-
SSR 引物扩增野生花生, 认为花生栽培种 EST-SSR
在野生种中具有很高的可转移性, 而且栽培种花生的
EST-SSR引物在野生花生中检测到的多态性比例高达
76%以上。Proite等[21]证明源于花生野生种的 EST-SSR
在栽培种中也有可转移性。本研究表明, 源于栽培种
花生的 EST-SSR引物在野生种中具可转移性。5份来
源于不同区组的野生花生通过 235对来源于栽培种花
生EST-SSR引物的扩增, 223对引物均扩增出条带, 有
效性较高, 为 94.89%。但是, 多态性比例只有 22.55%,
低于梁炫强等[17-18]的结果, 造成这种差异的原因可能
是设计SSR引物时位点搜索的限制因子较短以及核苷
酸重复类型不同, 还可能是开发 SSR 引物时构建的
cDNA 文库不同。总之, 利用来源于栽培种花生的
EST-SSR 引物扩增野生花生是有效的, 而且栽培种花
生的 EST-SSR在野生花生中的可转移性很高。
3.2 EST-SSR标记的适用性
聚类结果表明相同区组的材料基本被聚在一起,
栽培种花生与花生区组材料聚在同一小组内, 聚类
结果基本上与花生属的区组分类一致 , 与陈本银
等[22]用基因组 SSR引物分析获得的聚类结果基本一
致。在同一区组不同种质材料间的聚类分析上, 花
生区组的 A. monticola、A. villosa、A. stenosperma、
A. correntina种内材料间在 DNA水平上遗传变异相
对较小, 与陈本银等[22]用基因组 SSR的分析结果相
符。相似系数和聚类结果均表明花生区组的 A. du-
ranensis (WH4364)与 3份花生栽培种亲缘关系最近,
与唐荣华等[19]和陈本银等[22]推测的 A. duranensis是
花生栽培种(A. hypogaea L.)的野生种亲本之一的结
论相符。这些结果表明 EST-SSR标记在揭示花生系
统进化差异上是有效的。
本研究结果表明, 利用花生栽培种 EST 开发
SSR 标记是可行的, EST-SSR 分子标记在野生种中
具较高有效性和扩增多态性, 而且适合于分析花生
资源之间的遗传多样性, 这对丰富花生栽培种 SSR
标记具有积极的意义。
3.3 EST-SSR 标记在野生花生含油量分析上的
应用潜力
在花生目标性状分子标记研究方面, 国内外主
要集中在遗传性相对简单的质量性状 (如抗病性 )
上[23-24]。有关花生含油量遗传研究报道较少, 陈四
龙等[25]认为不同亲本组合的花生含油量基因遗传特
点差异明显, 有 2 个杂交组合分离世代 F2符合主基
因+多基因遗传特征, 其含油量遗传受 1 对加性-显
性主基因+加性-显性-上位性多基因控制; 另外 2 个
杂交组合 F2符合多基因遗传特征。花生含油量遗传
基础复杂, 不同学者报道的结果不尽一致。而且近
几年高油花生育种的研究由于传统方法的缺陷而进
展缓慢, 国内外少见花生含油量分子标记的研究报
道。由于 EST-SSR来自基因组的转录区域, 可为功
能基因提供“绝对”的标记[26], 有可能与性状特征联
系起来[7]。本研究以大量的野生花生为材料(涉及 5
个区组 86 份野生花生材料), 首次将 EST-SSR 标记
与含油量联系起来分析, 获得了可以作为含油量分
子标记的候选引物 6对 EST-SSR标记。用这 6对标
记的引物序列, 搜索 cDNA文库和 BLAST库, 未找
到与含油量直接相关的基因, 但发现引物 POCR437
序列对应丙二酸单酰-CoA-ACP 转酰酶和酰基载体
蛋白的编码基因。这 2种蛋白质参与脂肪酸的合成,
而脂肪酸与含油量相关, 根据搜索结果, 我们推测
标记 POCR437与含油量相关。由于油的形成是一个
1230 作 物 学 报 第 38卷

非常复杂的生理生化过程[27], 这一推测还需要实验
进一步证明。本研究结果显示, EST-SSR标记在野生
花生含油量分析上具有重要的应用潜力。
4 结论
利用花生栽培种 EST 开发 SSR 标记是可行的,
EST-SSR 分子标记在野生种中具较高有效性和扩增
多态性, 而且适合于分析花生资源之间的遗传多样
性, 这对丰富花生栽培种 SSR 标记具有积极的意
义。获得了 POCR437-180/170、POCR516-270/350、
POCR517-365/375/120和 POCR561-165/195/188等 6
对可以作为含油量相关分析标记筛选的后备标记。
经 B LAST搜索, 推测标记 POCR437与含油量相关。
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