全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(2): 228−232 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30270791)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2002AA212011)资助。
第一作者联系方式: E-mail: xpfang2008@163.com; xpfang@public.wh.hb.cn
Received(收稿日期): 2009-07-14; Accepted(接受日期): 2009-10-02.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00228
能以植酸磷为唯一磷源生长的转基因甘蓝型油菜
方小平 1 王 转 1 陈茹梅 2 李 均 1 范云六 2 罗莉霞 1 陈坤荣 1
任 莉 1
1 中国农业科学院油料作物研究所 / 农业部油料作物遗传改良重点开放实验室, 湖北武汉 430062; 2 中国农业科学院生物技术研究
所, 北京 100081
摘 要: 由于难溶性矿物磷酸盐和有机磷的大量存在, 土壤总磷虽高, 但多数土壤缺乏有效磷, 这是世界范围内农
业生产的主要限制因素之一。土壤中有机磷的存在形式主要是植酸, 为了提高土壤有效磷供给, 利用根癌农杆菌菌株
LBA4404, 通过两步再生方法将植物表达载体 pBINPR-phyI 中含有的带胞外分泌信号肽序列的植酸酶基因转入油菜
品种中双 6 号中, 并获得转基因油菜 56 株, 转化效率 0.16%~9.20%。分子检测和酶活性检验表明, 植酸酶基因已导
入中双 6号, 转基因植株能有效表达植酸酶基因并向根外分泌植酸酶, 转基因植株能以植酸为唯一磷源正常生长, 非
转基因植株则不能。结果表明, 转基因植株根系分泌大量高活性植酸酶有助于土壤中有机磷释放出有效磷供植物利
用; 利用基因工程技术提高植物对土壤闭蓄态有机磷利用效率的前景是可期待的。
关键词: 油菜; 植酸酶; 转基因; 胞外分泌
Transgenic Brassica napus Growing with Phytate as a Sole Phosphorus Source
FANG Xiao-Ping1, WANG Zhuan1, CHEN Ru-Mei2, LI Jun1, FAN Yun-Liu2, LUO Li-Xia1, CHEN
Kun-Rong1, and REN Li1
1 Key Laboratory of Oil Crops Genetic Improvement, Ministry of Agriculture / Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sci-
ences, Wuhan 430062, China; 2 Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: Phosphorus (P) deficiency in soil is a major constraint in agricultural production worldwide. Most soils contain signifi-
cant amounts of total soil P that occurs in insoluble inorganic and organic fractions, but lack available phosphorus. Phytic acid is
the major storage form of organic phosphorus in soil. In this experiment, the phytase gene with the signal peptide sequence of
extracellular secretion was introduced into Brassica napus cv. Zhongshuang 4 via Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Fifty six
plants of transgenic Brassica napus were obtained and checked by PCR and phytase activity, most of them gave the positive re-
sults. The transformation efficiency was 0.16–9.20%. When grown in MS medium with phytic acid as a sole phosphorus source
under sterile conditions, transgenic Brassica napus plants were able to obtain inorganic phosphate from phytic acid and grew
normally, but the wild-type plants not. These results show that extracellular phytase secreted from plant roots is a significant fac-
tor in the utilization of phosphorus from phytate and indicate that there exists a prospect for using gene technology to improve the
ability of plants to utilize accumulated forms of soil organic phosphorus.
Keywords: Brassica napus; Phytase; Transgene; Extracellular secretion
磷是作物生长必需的大量矿物元素, 土壤有效
磷含量低是农业生产普遍存在的问题, 土壤有效磷
的缺乏已成为限制作物产量的主要因素之一[1]。有
资料表明, 土壤的总磷含量很高 [2-3], 全磷的 20%~
80%是有机磷, 其中有机磷的 20%~50%是植酸磷[4-7],
在大豆、油菜、玉米等主要农作物种子中磷的基本
存在形式也是植酸磷[8-10]。土壤中的植酸主要来源于
腐烂的植物残体, 然而由于植物只能吸收利用无机
磷, 有机磷只有在植酸酶的作用下分解释放出无机
磷后才能被吸收利用 [4,11], 因此土壤缺乏的是能为
植物吸收利用的有效态磷。
植酸酶(phytase)是一种能水解植酸的磷酸酶类,
在一定条件下能将植酸分解成为肌醇和磷酸, 释放
出植物可利用的无机磷, 1 g植酸完全分解理论上可
第 2期 方小平等: 能以植酸磷为唯一磷源生长的转基因甘蓝型油菜 229


释放出无机磷 281.6 mg [9-13]。自然条件下, 植物根系
能分泌有机酸和少量磷酸酯酶(主要是植酸酶), 降
低根围土壤 pH, 促使土壤难溶性矿物磷酸盐的溶解
和水解土壤中的植酸和其他有机磷, 释放出无机磷
供植株吸收利用。研究表明, 植物通过这两种方式
吸收利用土壤中植物难利用磷的能力很弱, 植物本
身并不能大量产生胞外植酸酶[14-15]。近年来, 研究
人员将植酸酶基因导入植物(如烟草、拟南芥、油菜、
玉米、大豆、水稻等)[16-21], 多数使植酸酶在子叶和
种子中表达, 用来帮助动物消化吸收利用饲料中的
植酸磷, 改善植物吸收利用植酸磷的报道较少, 仅
Richardson等[22-23]报道了带转胞外分泌信号肽序列的
植酸酶基因拟南芥具有利用植酸中磷素的能力。
甘蓝型油菜是我国重要的油料作物, 甘蓝型油
菜又是对磷素很敏感的作物, 土壤缺有效磷可引起
减产[24], 开展甘蓝型油菜磷素营养高效利用遗传改
良、筛选和培育油菜磷利用高效品种, 是解决土壤
缺磷的有效途径之一。Ponstein 等 [25]将来源于 A.
niger 植酸酶 phyA 基因转移到油菜籽中, 用种子特
异性启动子 CruA 控制 phyA, 并在植酸酶成熟肽前
加上十字花科信号肽序列, 结果发现 95%的油菜籽
中检测到植酸酶的活性。
本文以油菜具柄子叶为外植体, 应用农杆菌介
导的方法, 将具有胞外分泌信号肽序列的植酸酶基
因转入甘蓝型油菜。通过植酸酶在植株根系中表达
并分泌至胞外, 使植株根系分泌物中含大量高活性
的植酸酶以水解土壤中的植酸, 释放出磷供植株吸
收利用。探索通过基因工程技术提高油菜对土壤有
机磷的利用效率, 建立土壤有机磷→植物可利用的
无机磷→植物储存的有机磷→土壤有机磷的植物磷
素营养循环利用的环保型新途径。
1 材料与方法
1.1 试验材料
受体材料是由中国农业科学院油料所选育的甘
蓝型油菜品种中双 6号。根癌农杆菌(Agrobacterium
tumfaciens)菌株为 LBA4404, 植物表达载体 pBINPR-
phyI 含带胞外分泌信号肽序列的植酸酶基因和
NPTⅡ基因, 由中国农业科学院生物技术研究所范
云六院士课题组构建并提供(图 1)。检测植酸酶基因
所用的引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成。
1.2 外植体的选择和农杆菌菌液的制备
将饱满的中双 6号种子消毒(70%酒精 5~10 s、
1% DICA 消毒 8~15 min、无菌水洗 3~4 次), 植入


图 1 植物表达载体 pBINPR-phyI构建图谱
Fig. 1 Chart of plant expression vector pBINPR-phyI

1/2 MS培养基生长 3~4 d (25℃、光 16 h/暗 8 h), 从
子叶节上 1 mm 处切下具柄子叶作为外植体。将一
含有植物表达载体的农杆菌单菌落划线于含 50 mg
L–1 kan的 YEB固体培养基(每升含 5 g胰蛋白胨, 1 g
酵母提取物, 5 g蔗糖, 0.5 g MgSO4⋅7H2O)上, 28℃培
养 1~2 d, 用 1/2 MS液体培养基(pH 5.4)洗下菌体,
并将菌液稀释至 OD600＝0.08, 作为侵染用菌液。
1.3 根癌农杆菌介导转化甘蓝型油菜
将油菜具柄子叶置侵染用农杆菌菌液中, 22℃
侵染 5~10 min, 其间轻轻摇动。捞出后在无菌吸水
纸上吸干菌液, 将子叶转至 MS + 1 mg L–1 2,4-D +
0.2 mg L–1 6-BA培养基上, 22℃暗培养 2~3 d, 然后
转移到 MS + 4.5 mg L–1 BA + 5 mg L–1 AgNO3 + 500
mg L–1 Cb(羧苄)上延迟培养 5~7 d, 再转至筛选培养
基 MS + 4.5 mg L–1 BA + 5 mg L–1 AgNO3 + 500 mg
L–1 Cb + 10~20 mg L–1 kan上培养 2~3周, 待再生绿
苗长至 1~2 cm时, 切下, 植入生根培养基 MS + 0.2
mg L–1 NAA + 20 mg L–1 kan上, 待根系发达成为完
整植株时, 经炼苗移栽在花盆中遮荫保湿培养(以上
培养基均含 3%蔗糖, 并用 0.8%的琼脂固化, pH 5.8。
培养条件为 25℃、光 16 h/暗 8 h)。
1.4 转基因植株的 PCR检测
采用 CTAB法[26]提取植物基因组 DNA, 上游引
物为 5′-AGCGAGACGTTCAACAATACGC-3′, 下游
引物为 5′-GCAGAATACCCATCCAATTCCTT-3′, 以
非转基因油菜植物总 DNA 为阴性对照 , 以质粒
DNA为阳性对照, 采用 20 μL反应体系进行 PCR扩
230 作 物 学 报 第 36卷

增。反应程序为 94℃ 4 min, 94℃ 30 s、53℃ 30 s、
72℃ 45 s, 30个循环, 72℃ 5 min。PCR产物用 1%
的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.5 转基因植株的 Southern杂交验证
参照分子克隆实验指南[27], 取大量制备的基因
组 DNA 15 μg, 用 BamH I酶切, 在 0.8%琼脂糖凝胶
上电泳分离, 然后转移到 Hybond-N+尼龙膜上。以植
酸酶基因片段作为探针, 用 32P标记与膜杂交。
1.6 转基因植株根系植酸酶表达检验
转基因和非转基因油菜种子经消毒后分别植入
以植酸磷为唯一磷源的MS固体培养基, 生长 4 d左
右。实验一, 用 0.03% FeCl3＋0.3%磺基水杨酸浸泡
培养基 30 min, 观察颜色变化以确定培养基中的植
酸是否被植株利用(有植酸存在时褪色)。实验二, 距
子叶节下 5~10 mm切下幼苗, 回接MS (以植酸磷为
唯一磷源)＋0.2 mg L–1 NAA固体培养基生根培养,
观察以确定植株是否能够利用培养基中的植酸而正
常生长。
2 结果与分析
2.1 油菜转化及抗性植株的获得
中双 6 号具柄子叶农杆菌介导的植酸酶基因遗
传转化结果见表 1, 实验平均转化率为 2%, 图 2 为
转化所得到的绿苗, 图 3为在生根培养基中的绿苗。
转化效率受外植体子叶柄的长度和外植体在培养基
上的放置方式的影响。以 4 日龄幼苗从子叶节上 1
mm切下为宜, 子叶柄以插入培养基较好, 并尽量避
免子叶接触培养基, 降低植株再生效率。共培养时
间的影响, 在本试验中, 以 2 d可较好地完成外源基
因的整合过程, 此时可见子叶柄切口处稍微膨大并
有晕丝状农杆菌生长, 转化率较高。农杆菌的浓度
和感染时间是影响遗传转化率的重要因素。试验证
明, 当农杆菌菌液浓度(OD600)在 0.05~0.08时处理外
植体 5~10 min, 效果较好。
2.2 抗性植株的 PCR及 Southern检测
从图 4中可以看出, 用抗性植株 DNA扩增出的
片段与用质粒 DNA(CK+)扩增出的片段大小一致, 而
非转基因油菜植株 DNA(CK−)未扩增出相应谱带。初
步证明外源植酸酶基因已经整合进抗性油菜植株中。
图 5表明, PCR检测阳性的转基因植株 1~5号的
基因组 DNA 与植酸酶基因片段作为探针扩增出的
片段杂交呈阳性 , 而与非转基因油菜植株基因组
DNA(CK−)的杂交呈阴性。该结果进一步证明外源
植酸酶基因已经整合进油菜基因组中。

表 1 农杆菌菌液浓度和侵染时间对转化的影响
Table 1 Influence of Agrobacterium tumefaciens concentration and infection time on transformation
侵染时间
Infection time
农杆菌菌液浓度
Agrobacterium tumefaciens
concentration (OD600)
接种外植体数
No. of inoculated
explants
再生绿芽
Regenerated green
bud
转化率
Transformation
efficiency (%)
0.02 344 0 0 2 min
0.08 597 1 0.16
0.05 472 12 2.54
0.08 576 53 9.20
5 min
0.12 522 0 0
0.05 492 9 1.80 10 min
0.08 283 1 0.35



图 2 抗性绿芽
Fig. 2 Green shoot with resistance


图 3 生根的转基因苗
Fig. 3 Transgenic plants with roots
第 2期 方小平等: 能以植酸磷为唯一磷源生长的转基因甘蓝型油菜 231




图 4 转基因植株的 PCR检测结果
Fig. 4 PCR analysis of transgenic plants
M: DNA marker; 1~7: 转基因植株 DNA扩增片段; CK−: 阴性对
照; CK+: 阳性对照。
M: DNA marker; 1–7: transgenic plant, CK–: negative control;
CK+: positive control.



图 5 转基因植株的 Southern杂交结果
Fig. 5 Southern Hybridization of transgenic plants
M: DNA marker; 1~5: 转基因植株 DNA酶切片段; CK–: 阴性对
照; CK+: 阳性对照。
M: DNA marker; 1–5: transgenic plant; CK–: negative control;
CK+: positive control.

2.3 转基因植株根系植酸酶表达检验
转基因植株根系分泌植酸酶到培养基中水解植
酸, 培养基中植酸量随时间推移越来越少, 培养基
颜色越来越深(图 6-A)。非转基因植株根系分泌植酸
酶量很少, 培养基中植酸被水解的量很少, 铁离子
被植酸吸附, 培养基颜色很浅(图 6-B)。前者可利用
培养基中的植酸磷正常生长(图 6-D), 而后者很难利
用培养基中植酸为磷源正常生长(图 6-C)。
3 讨论
土壤缺磷是世界范围内普遍存在的问题, 它严
重限制了作物产量的提高。随着人口增长对粮、棉、
油等的需求以及由此引起的能源危机不断增加, 这
种趋势还将不断加重。因此, 如何通过提高植物自
身潜力, 减少土壤对磷酸盐的固定、吸附以提高植
物对磷肥的利用效率及活化被土壤固定的磷, 对提
高粮、棉、油等产量、降低生产成本以及保护生态
环境将起到重要作用。
本研究表明植酸酶基因已转入油菜品种中双 6号
中, 并能利用土壤中有机磷正常生长。这一结果与
Richardson 等[22]报道的转植酸酶基因的拟南芥研究
结果是一致的。
在油菜中约有 80%的遗传转化是由农杆菌介导
完成的[28]。外植体种类很多, Moloney等[29]认为具柄
子叶的子叶柄末端切口处的细胞再生能力强, 且易
被农杆菌浸染和转化。谢建坤等[30]研究表明, 合适
的农杆菌浓度、感染时间及共培养时间对转化结果
起重要作用。本实验以具柄子叶为外植体, 通过研
究影响转化效率的各种因素, 发现以 4日龄幼苗从子
叶节上 1 mm 切下为宜, 子叶柄以插入培养基较好,
并尽量避免子叶接触培养基; 共培养 2 d 可较好地
完成外源基因的整合, 提高转化率, 后期培养抑制
农杆菌容易; 农杆菌菌液浓度(OD600)在 0.05~0.08时
与外植体共培养 5~10 min最有利于转化。本研究通
过农杆菌介导的油菜具柄子叶二步再生法遗传转化
植酸酶基因, 获得了转植酸酶基因的植株, 平均转
化效率为 2%, 可供甘蓝型油菜转基因研究参考。



图 6 转基因和非转基因中双 6号植株利用培养基中植酸和生长情况
Fig. 6 Comparison between transgenic and wild plants in growth and utilization of phytate in the medium
A和 B: 转基因植株分泌植酸酶水解培养基中植酸(A), 非转基因植株很少水解培养基中植酸(B), 颜色越深, 植酸水解越多; C和 D:
非转基因(C)和转基因(D)植株在唯一植酸磷源的培养基中生长情况。
A and B: the growth of transformed (A) and wild (B) Brassica napus plants on agar plates showing that stained regions are lose phytate in the
media because of the combination of FeCl3 with the phytate released by phytase from transformed plant roots; C and D: the growth of trans-
formed (D) and wild (C) Brassica napus plants grown for 12 d in the media with phytate.

232 作 物 学 报 第 36卷

植物几乎不能直接吸收利用土壤有机磷, 磷多
以无机磷的形式被植物吸收利用。Richardson等[22-23]
证明拟南芥缺乏直接利用植酸磷的能力, 但转胞外
分泌型真菌植酸酶基因拟南芥可以利用植酸磷。本
研究进一步表明通过转植酸酶基因, 可提高油菜根
系分泌到土壤中的植酸酶量, 水解土壤中的有机磷
释放出无机磷, 增加植株可利用有效磷量, 增强油
菜利用有机磷的能力。
4 结论
获得了转植酸酶基因的植株, 该植株能高效表
达植酸酶基因并将植酸酶分泌到细胞外, 使油菜能
利用土壤中植酸正常生长, 非转基因油菜则不能。
转基因油菜向胞外分泌植酸酶可以提高油菜对土壤
中磷素的利用效率。
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