全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(5): 842−854 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30871494), 教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(200803890006)和福建省自然科学基金项
目(2007J0304, 2008J0042)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 林文雄, E-mail: wenxiong181@163.com, Tel: 0591-83769440
第一作者联系方式: E-mail: zhangzhixingfz@163.com
Received(收稿日期): 2010-10-28; Accepted(接受日期): 2011-03-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00842
氮肥运筹对大穗型水稻品种金恢 809灌浆期叶片蛋白质表达的影响
张志兴 1,2 李 忠 1,2 陈 军 1,2 李奇松 1,2 陈龙怀 1,2 陈鸿飞 1,2 黄锦文 1
林文雄 1,2,*
1 福建农林大学农业生态研究所, 福建福州 350002; 2 福建农林大学生命科学学院, 福建福州 350002
摘 要: 籽粒灌浆期叶片的代谢情况对水稻最终产量的形成具有重要的意义。本文运用双向电泳技术探讨了两种不
同氮肥施用比例下, 籽粒灌浆不同时期叶片蛋白的差异表达情况。共检测到 32个出现差异表达的蛋白, 其中 27个在
后期适当增加氮肥施用比例的处理下上调表达, 5个下调表达。依据蛋白功能可以将鉴定到的蛋白分为 5大类即光合
代谢(12 个)、抗逆反应(5 个)、激素合成及信号转导(5 个)、细胞生长和分化(5 个)、假想蛋白(5 个)。为了进一步明
确氮肥调控对灌浆期叶片的影响, 本文考察了叶片光合以及保护酶相关指标。结果显示, 增加水稻生育后期的氮肥施
用比例, 延缓了叶片中叶绿素以及可溶性蛋白在籽粒灌浆期的降解, 延长了叶片光合作用时间, 提高了 SOD、POD
和 CAT 在灌浆后期的活性, 降低了膜脂过氧化程度。生理指标结果进一步证明了差异蛋白组学结果的可靠性, 说明
后期增加氮素的供应确能有效地促进叶片灌浆期正常的生理代谢。本研究在蛋白水平和生理指标水平, 为进一步揭
示氮肥调控措施对水稻灌浆代谢机制的影响提供了理论依据。
关键词: 水稻; 籽粒灌浆; 叶片; 蛋白; 氮肥
Effects of Nitrogen Management on Protein Expression of Flag Leaves during
Grain-filling Period in Large Panicle Rice (Oryza sativa L.)
ZHANG Zhi-Xing1,2, LI Zhong1,2, CHEN Jun1,2, LI Qi-Song1,2, CHEN Long-Huai1,2, CHEN Hong-Fei1,2,
HUANG Jin-Wen1, and LIN Wen-Xiong1,2,*
1 Institute of Agricultural Ecology, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2 School of Life Sciences, Fujian Agricultural
and Forestry University, Fuzhou 35002, China
Abstract: In rice (Oryza sativa), approximately 60–100% of the carbon in mature grains originates from CO2 assimilation during
the grain-filling period, with the flag leaf as the most important contributor to the yield. It is therefore important to understand
molecular mechanisms of flag leaf during the grain-filing period. Two-dimensional electrophoresis (2-DE) technology was applied
to investigate the differential expression patterns of leaf proteins from different periods during grain-filling process in rice cultiva-
tion Jinhui 809 treated by two different nitrogen application ratios. The results showed 32 differentially expressed proteins with 27
up-regulated and five down-regulated, in response to increased nitrogen application at grain-filling stage. According to their rela-
tive functions the identified proteins were classified into five main categories: photosynthesis (12); adversity-resistance response
(5); hormone synthesis and signal transduction (5); cell growth and differentiation (5); unknown functions (5). Then photosynthe-
sis-related features together with adversity-defense related indicators (SOD, POD, CAT, MDA, and soluble protein) were deter-
mined. The appropriate increase in nitrogen application at late growth stage on one hand delayed the degradation of chlorophyll
and soluble protein in leaf during grain filling period, in turn elongated the leaf photosynthesis process; on the other hand pro-
moted the activities of SOD, POD, CAT, while decreased the lipid peroxidation degree, which together indicated the strengthen of
leaf adversity-defense ability. The results not only verify the high efficient effect of increased nitrogen application on leaf metabo-
lisms during grain-filling process, but also provide the theoretic basis for studies on rational management of nitrogen fertilizer and
its relevant molecular regulation in the future.
第 5期 张志兴等: 氮肥运筹对大穗型水稻品种金恢 809灌浆期叶片蛋白质表达的影响 843


Keywords: Rice; Grain-filling; Flag leaf; Protein; Nitrogen fertilizer
水稻是世界上最重要的粮食作物之一, 不仅提
供了世界人口近 60%的粮食, 而且被广泛用作模式
植物进行研究。水稻籽粒的库容和灌浆速率往往决
定着终产量。为了进一步提高水稻产量, 许多遗传
育种学家把重点放在选育具有较大库能力上, 如提
高每穗粒数[1]。目前, 已选育出大量大穗、超大穗型
水稻品种 , 如国际水稻研究所 (IRRI)的新株型水
稻[2], 我国的超级稻品种(或组合)[3]。然而, 这些超
级稻往往在生产上并未表现超高产优势, 这主要是由
于其存在结实率低、灌浆速率慢等问题[2-5]。如何促进
大穗型水稻高产潜力的发挥, 是当前面临的主要问
题。抽穗后籽粒灌浆所需要的营养物质 60%~80%来自
叶片的光合作用。前人研究认为, 叶片的光合能力与
产量直接相关, 高产与适宜的叶面积指数相关联[6]。薛
艳风等[7]研究发现, 剪叶后光合源减小, 使籽粒灌浆
强度受到严重削弱, 仅有的灌浆物质又优先供应强势
粒, 使弱势粒的灌浆物质更少, 导致谷壳充满所需时
间延长, 有的甚至无法充满。籽粒灌浆期源器官叶片
早衰严重影响籽粒灌浆, 据推算, 水稻叶片每推迟 1 d
衰老, 可增产 2%左右, 实际试验表明可增产 1%左
右[8-10]。可见, 籽粒灌浆期叶片的代谢活动, 对大穗型
水稻的高产潜力发挥具有重要的作用。
在水稻生育进程中, 氮素营养一直是栽培调控
的重要内容。有效的氮素利用, 对水稻生长发育及
产量形成具有重要的作用。水稻生育后期合理的氮
肥调控不仅与叶片氮动态密切相关, 同时能显著促
进籽粒灌浆。在灌浆期, 水稻的稻穗是主要的生长
库, 所需要的氮来自水稻从土壤中的即时吸收(即土
壤供氮)和源组织氮素的转运两个部分, 而这个时段
完成发育的叶片都是库的后备氮源, 当土壤供氮量
不能满足库的氮需要时, 源叶片向库输出氮素的强
度增大, 叶片衰老加速[11]。氮素对衰老叶片中的抗
氧化代谢有重要调控效应, 水稻生育后期适当增施
氮肥可使植株体内保持高水平的保护酶活性, 降低
后期细胞膜脂过氧化水平, 延缓旗叶的衰老和光合
功能衰退, 延长旗叶的光合功能期[12-13]。此外, 在总
施氮量不变的情况下, 适当减少前期的氮肥施用量,
增加后期的氮肥比例, 能够有效地降低无效分蘖数,
优化水稻的群体结构, 提高成穗率, 促进物质的运
输, 提高结实率, 从而提高产量[14-18]。
水稻灌浆是一个复杂的生理及分子调控过程 ,
因此仅从生理上认识氮肥调控灌浆的机制是不够全
面的。必须运用系统生物学的方法研究其复杂的生
物学过程。近年来, 应用蛋白质组学技术研究复杂
的生理生化问题已经成为国内外研究的热点。蛋白
质是基因表达的最终产物 , 也是基因功能的执行
者。对蛋白质在特定组织或发育的某一阶段中表达
的功能分析是了解生物学过程的关键。本研究主要
应用差异蛋白质组学研究方法探讨不同氮肥比例处
理下, 大穗型水稻籽粒灌浆不同时期, 叶片的蛋白
质代谢模式及其对水稻籽粒灌浆的影响。为进一步
揭示氮调控水稻叶片物质代谢的分子机制, 丰富源
库理论提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2007 年和 2008 年 6 月在福建农林大学教学农
田种植本研究所自行选育的大穗型水稻(Oryza sa-
tiva L. ssp. indica)品种金恢 809。该品种株高 120 cm,
旗叶长 41.67 cm, 叶宽 2.55 cm, 穗长 31.33 cm, 总粒
数 305 粒, 结实率 87%, 千粒重 27.45 g, 是典型的大
穗型水稻品种。田间种植, 插植规格为 15 cm×15 cm。
试验地为沙壤土, pH 5.7, 含全氮 2.20 g kg−1、速效氮
190.60 mg kg−1、全磷 1.25 g kg−1、速效磷 126.60 mg
kg−1、全钾 1.05 g kg−1、速效钾 201.60 mg kg−1。试
验期间气候正常, 灌浆期间温度平均 25~32℃。田间
栽培管理除施氮条件外其他按常规高产栽培技术管
理。按施纯氮 225 kg hm−2量折算每区用量, N∶P∶
K = 1∶0.5∶0.8。磷肥作基肥一次性施用, 钾肥于分
蘖期和穗分化期各施 50%。设 NT (基肥∶分蘖肥∶
穗肥=6∶3∶1)和 NP (基肥∶分蘖肥∶穗肥∶粒肥
=5∶1∶3∶1) 2 种氮肥比例。每个小区间均筑趋田
埂, 并用农膜隔水。2007 年材料主要用于差异蛋白
组学研究, 2008 年材料主要用于相关生理指标的测
定。
1.2 叶片蛋白质样品制备
在抽穗开花期, 选取 50株长势整齐一致的稻穗
标记挂牌, 自开花至花后 28 d每隔 7 d, 分别于下午
16:00 左右在各小区非边行处取 5 株, 共取样 4 次,
剪取其剑叶叶片, 置液氮中保存, 用于蛋白质的提
取。按王经源等的蛋白质样品制备的 TCA-丙酮沉淀
法进行[19]。按 Garrels[20]的方法测定蛋白质溶液含量
844 作 物 学 报 第 37卷

后, 即可用于上样。
1.3 双向电泳(2-DE)
参照王经源等 [19]的方法 , 等电聚焦 (IEF)采用
18 cm自制管状胶条。上样量为 150 μg。在 25℃下,
依次按 200、300、400、500、600、800 V各 30 min,
1 000 V 16 h, 1 100 V 6 h的电压梯度进行电泳。
SDS-PAGE 凝胶规格为 180 mm × 180 mm × 1.5 mm,
分离胶浓度为 10%, 浓缩胶浓度为 5%。采用硝酸银
染色。
1.4 蛋白质图谱分析及差异点的确定
凝胶染色后使用 Umax powerlook III扫描仪进
行扫描, 构建蛋白质表达图谱。采用 ImageMaster5.0
软件分析凝胶图谱, 当蛋白质点间的差异大于 1.5
时 , 认为具有显著性差异 , 确定差异蛋白点后 , 从
胶上挖取差异点。
1.5 蛋白质点胶内酶解
参照 Peng等[21]的方法略作修改。挖取差异蛋白
质点, 在 1∶1的 0.03 mol L−1铁氰化钾和 0.1 mol L−1
硫代硫酸钠混合液中脱色; 57℃条件下 0.01 mol L−1
DTT溶液中还原 1 h, 0.055 mol L−1碘乙酰胺溶液烷
基化 1 h; 用 12.5 ng µL−1胰岛素酶缓冲液 4℃下水化
30 min, 并在 37℃下, 0.05 mol L−1碳酸氢铵溶液中
酶切 14 h。分别用 0.02 mol L−1碳酸氢铵溶液、含
5%TFA的 50%乙氰、100%乙氰萃取酶切产物。
1.6 MALDI-TOF/MS(基质辅助激光解吸电离
飞行时间质谱)分析
使用 Reflex III 型 MALDI-TOF 质谱仪(德国
BRUKER公司), 以反射模式, 离子源加速电压 1为
20 kV, 加速电压 2为 23 kV, N2激光波长 337 nm, 脉
冲宽度为 3 ns, 离子延迟提取 2000 ns, 真空度
1.9×10−5 Pa, 质谱信号单次扫描累加 50 次, 并用标
准 Mark峰作为外标校正质谱峰, 正离子谱检测。基
质为 HCCA (a-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid)饱和
液, 基质溶解液为 40%乙氰和 60%溶解有 0.1%TFA
的双蒸水。用 0.5%TFA溶液 2 µL溶解肽段, 按 1∶
1 将样品溶液和基质溶液混合后点样, 自然干燥后
进行质谱分析, 获得肽指纹图谱(PMF), 用 MASCOT
软件检索查询。
1.7 叶片叶绿素 SPAD值测定
利用 SPAD-502 叶绿素测定仪, 从齐穗后开始
起每 7 d测定一次挂牌标记的水稻植株剑叶的 SPAD
值。每片剑叶测上中下 3个部位 , 记平均值。共测
定 4次。
1.8 叶片光合速率测定
利用 LI-6400光合仪, 从齐穗后开始起每 7 d测
定一次挂牌标记的水稻植株剑叶的光合速率(Pn)。共
测定 4次。测定时光强为 1 200 μmol m−2 s−1, 空气
中 CO2浓度为 200 μmol mol−1左右。为尽量做到 3
种不同基因型水稻测定时期相同 , 于晴天上午
9:00~11:30测定叶片光合速率。
1.9 叶片可溶性蛋白含量及保护酶活性测定
参照张志良等测定可溶性蛋白含量及保护酶活
性[22]。采用考马斯亮蓝染色法测定可溶性蛋白质含
量, 以牛血清蛋白为标准蛋白。采用氮蓝四唑还原
法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性 , 以单位时间内
抑制光化还原 50%的氮蓝四唑为一个酶活单位。过
氧化氢酶 (CAT)活性采用紫外分光光度计法测定 ,
以每分钟每毫克蛋白氧化的 H2O2 毫摩尔数表示酶
活性。采用愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性,
以 OD 值在 1 min 内增加 0.01 为 1 个酶活单位, 以
样品中含有的蛋白含量计算酶活性。
2 结果与分析
2.1 灌浆不同时期水稻叶片图谱的构建与比较
分析
选取籽粒灌浆的 4个不同时期(7、14、21和 28)
的NP和NT两个不同氮肥施用比例下的水稻叶片共
8个样品, 经过双向电泳后得 8张重复的叶片 2D图
谱。在等电点从 3~10和分子量为 14~116 kD的范围
中, 每块胶大概有 900个点 , 当点与点之间差异达
到 1.5倍, 即认为表达量有显著差异。在灌浆的 4个
不同时期都发生变化的点大约有 100 个, 其中有 32
个蛋白点在 2 个不同氮肥比例的处理下出现差异表
达, 分别标号为 1到 32 (图 1)。
2.2 不同氮肥比例下叶片差异蛋白点的鉴定
进一步将这些差异蛋白点从 2D 胶上切取, 酶
解, 进行 MALDI-TOF/MS鉴定分析。根据质谱所得
的数据 , 去除杂质峰值后 , 通过 Matrix Science
(Matrix Science, London, UK)网站(http://www.ma-
trixscience.com/)提供的MASCOT软件查询, 结果见
表 1。
2.3 不同氮肥比例下叶片差异蛋白的功能以及
表达丰度分析
2.3.1 光合相关蛋白 在鉴定到的 32个差异蛋
白点中, 有 12 个是与光合代谢相关的蛋白, 可见后
期氮素的调控对水稻叶片光合代谢的影响较大。其
第 5期 张志兴等: 氮肥运筹对大穗型水稻品种金恢 809灌浆期叶片蛋白质表达的影响 845



图 1 籽粒灌浆期叶片 2D图谱
Fig. 1 2D map of flap leaf during the grain-filling period

中, 叶绿素 a/b结合蛋白(spot 23), ATP合酶 CF1亚
单位(spot 9), ATP合酶 γ链(spot 15), 甘油醛 3-磷酸
脱氢酶(spot 5, spot 14, spot 17, spot 18), NADPH铁
氧还原蛋白(spot 16), 氨基甲基转移酶(spot 20), 这
9个蛋白点在籽粒灌浆期都呈下降的趋势 , 但是在
NP施肥方式下 , 这些蛋白下降的趋势较小(图 2),
可见增加后期氮素的供应, 能够延缓光合代谢相关
蛋白的降解。核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚型前
体(spot 30), 核酮糖二磷酸羧化酶大链(spot 31), 核
酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基(spot 32), 这 3 个
与核酮糖二磷酸羧化酶的合成相关的蛋白, 在图 3
所示位置, NT施肥方式下灌浆的早期(7 d)和 NP处
理下的灌浆前中期(7 d, 14 d, 21 d)都是低丰度表达
的, 但是, 在NT施肥方式下均在灌浆 14 d就开始出
现上调表达, 而在 NP处理下直到 28 d, 才开始出现
上调表达, 推测这 3个蛋白点是Rubisco降解的产物,
在灌浆早期, Rubisco 未降解, 因此这 3 个点都是低
丰度表达, 但是到了灌浆的中后期, NT施肥方式下,
后期土壤中氮素供应不足, 造成 Rubisco 过早降解,
从而造成这 3 个 Rubisco 合成相关蛋白在灌浆 14 d
后就开始出现明显上调表达的现象。
2.3.2 抗逆相关蛋白 鉴定到 3 个与清除自由基
相关的蛋白即类异黄酮还原酶(spot 6), 超氧化物歧
化酶(spot 25), 依赖谷胱甘肽脱氢抗坏血酸还原酶
(spot 24); 2个与抗逆基因表达相关蛋白即WRKY转
录因子(spot 28), MYND型锌指蛋白(spot 29)。由图
4可知, 两种施肥方式下, 这 5个蛋白点出现差异表
达的时期主要集中在灌浆的后期(21 d, 28 d), 并且
NP施肥模式有利于这 5个蛋白在籽粒灌浆中后期的
表达。由此可见, 后期氮素的增加能够提高籽粒灌
浆中后期叶片抗逆相关蛋白的表达。
2.3.3 激素及信号转导相关蛋白 籽粒灌浆期 ,
叶片中激素的变化对叶片的正常生理功能以及籽粒
的灌浆进程都起着重要的调节作用。鉴定到 5 个与
激素变化相关的蛋白。由图 5可知, NP施肥方式能
够促进乙二醛酶 I (spot 2), S-腺苷甲硫氨酸合成酶
(spot 8), 顺式玉米素-O-葡萄糖基转移酶(spot 11),
钙调素(spot 27)这 4个蛋白在叶片中的表达。spot 3
被鉴定为 ABA诱导的蛋白激酶, 该蛋白在 NP施肥
方式下出现下调表达的现象。

846 作 物 学 报 第 37卷

表 1 叶片差异蛋白点 MALDI-TOF/MS质谱鉴定结果
Table 1 MALDI-TOF/MS results of differentially expressed proteins in leaf
蛋白点编号
Spot No.
登录号
Accession No.
蛋白名称
Protein name
分子量
Mw
等电点
pI
得分
Score
覆盖率
Coverage
(%)
匹配肽段数
Matched
peptides
1 Gi|125543573 Hypothetical protein OsI_11250 21520 9.92 66 45 6
2 Gi|115463027 Glyoxalase I 21373 5.84 96 58 11
3 Gi|29164823 Abscisic acid-inducible protein kinanase 40425 5.20 65 28 9
4 Gi|108862998 Cysteine synthase 43842 8.76 136 54 16
5 Gi|108705994 B Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B 34024 4.99 84 38 13
6 Gi|115434036 Isoflavone reductase-like protein 33481 5.69 73 45 11
7 Gi|3646373 Reversibly glycosylated polypeptide 40079 8.21 90 39 14
8 Gi|3024122 S-adenosylmethionine synthetase 43330 5.68 116 50 18
9 Gi|11466784 ATP synthase CF1 alpha subunit 55687 5.95 302 54 32
10 Gi|115444705 Cinnamyl-alcohol dehydrogenase 39132 5.94 64 39 13
11 Gi|115459948 Cis-zeatin O-glucosyltransferase 50875 5.95 104 37 14
12 Gi|257096334 Probable cinnamyl alcohol dehydrogenase 46450 7.23 69 20 12
13 Gi|115476042 Hypothetical protein 60609 9.81 54 31 13
14 Gi|968996 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 36641 6.61 165 53 15
15 Gi|115472339 ATP synthase gamma chain 40081 8.60 81 32 13
16 Gi|41052915 Ferredoxin-NADP(H) oxidoreductase 41095 7.98 75 35 14
17 Gi|108705994 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B 34024 4.99 84 38 13
18 Gi|108705994 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B 34024 4.99 70 23 9
19 Gi|125572433 Hypothetical protein OsJ_03874 55803 5.54 127 44 17
20 Gi|115460656 Aminomethyltransferase 44340 8.53 73 24 10
21 Gi|218191038 Hypothetical protein OsI_07779 45045 8.19 78 27 19
22 Gi|62734305 Hypothetical protein 41661 9.43 67 21 12
23 Gi|2570511 Chlorophyll a-b binding protein 33403 9.65 53 37 16
24 Gi|75336179 GSH-dependent dehydroascorbate reductase 1 23541 5.65 358 50 15
25 Gi|122169258 Superoxide dismutase [Mn] 24982 6.50 91 11 18
26 Gi|115443951 Vesicle transport v-SNARE family protein 26964 9.30 33 26 11
27 Gi|122222234 Calmodulin (CaM) 26438 4.58 46 40 13
28 Gi|77556447 WRKY DNA binding domain containing protein 38527 9.73 64 19 16
29 Gi|255674817 Zinc finger, MYND-type domain containing protein 19489 9.08 62 40 21
30 Gi|57283874 RuBisCO activase small isoform precursor 53331 6.23 76 23 17
31 Gi|110288945 Ribulose bisphosphate carboxylase large chain 40763 8.51 86 27 19
32 Gi|11466795 Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit 53418 6.22 99 26 16

2.3.4 细胞生长和分化相关蛋白 植物体的个体
发育, 是植物细胞不断分裂、生长和分化的结果。
鉴定到 5 个与植物细胞生长和分化相关的蛋白。由
图 6 可知, 可逆的糖基化多肽(spot 7), 肉桂醇脱氢
酶(CAD, spot 10, spot 12), v-SNARE家族膜泡运输
蛋白(spot 26), 这 4个蛋白在 NP施肥模式下出现上
调表达现象, 但是半胱氨酸合酶(spot 4)在 NP 施肥
模式下出现下调表达的现象。
2.3.5 假定蛋白 spot 1、spot 13、spot 19、spot
21和 spot 22被鉴定为假定蛋白, 功能未知, 有待进
一步的研究, 蛋白点丰度的表达模式如图 7所示。
2.4 不同氮肥比例下叶片叶绿素 SPAD值以及光
合速率的变化趋势
不同氮肥施用方式对光合代谢相关蛋白的影响
较大, NP施肥方式能够延缓光合代谢相关蛋白的降
解, 从而延缓叶片光合速率的下降。为了验证 NP和
NT 施肥方式对叶片光合能力的影响, 进一步考察
了叶片的 SPAD 值以及光合速率的变化。由图 8 可
看出, 在 NP施肥方式下, 叶片叶绿素 SPAD值在灌
浆后还有一个小幅度的上升。同时, 在整个籽粒的
灌浆期氮肥 NP施肥方式比 NT方式的叶绿素 SPAD
值高, 随着籽粒灌浆, 2个施肥方式间的 SPAD值的
第 5期 张志兴等: 氮肥运筹对大穗型水稻品种金恢 809灌浆期叶片蛋白质表达的影响 847


差距逐渐加大, 可见灌浆期增加氮素的供应能够促
进叶绿素的合成, 延缓其降解。图 9 显示, NP 施肥
方式下 , 叶片在籽粒灌浆期具有较高的光合速率 ,
表现在灌浆的前 14 d保持有较稳定的光合速率, 到
了 21 d 虽然开始出现下降的趋势, 但是相对于 NT
方式其下降的趋势较缓慢。由此说明, 后期适当增
加氮肥的供应能够延缓叶片籽粒灌浆期光合速率的
下降。

图 2 光合代谢相关蛋白丰度表达模式
Fig. 2 Expression pattern of proteins related to photosynthesis
代表 NT施肥模式下蛋白丰度值; 代表 NP施肥模式下蛋白丰度值。
Expression abundance under NT fertilizer application model; Expression abundance under NP fertilizer application model.


图 3 Rubisco相关蛋白表达变化图
Fig. 3 Expression changes of proteins related to Rubisco


图 4 抗逆相关蛋白丰度表达模式
Fig. 4 Expression pattern of proteins related to defenses
代表 NT施肥模式下蛋白丰度值; 代表 NP施肥模式下蛋白丰度值。
Expression abundance under NT fertilizer application model; Expression abundance under NP fertilizer application model.

848 作 物 学 报 第 37卷


图 5 激素合成及信号转导相关蛋白丰度表达模式
Fig. 5 Expression pattern of proteins related to hormonal synthesis and signals transduction
代表 NT施肥模式下蛋白丰度值; 代表 NP施肥模式下蛋白丰度值。
Expression abundance under NT fertilizer application model; Expression abundance under NP fertilizer application model.

图 6 细胞生长和分化相关蛋白丰度表达模式
Fig. 6 Expression pattern of proteins related to cell growth and differentiation
代表 NT施肥模式下蛋白丰度值; 代表 NP施肥模式下蛋白丰度值。
Expression abundance under NT fertilizer application model; Expression abundance under NP fertilizer application model.

图 7 假定蛋白丰度表达模式
Fig. 7 Expression pattern of hypothetical protein
代表 NT施肥模式下蛋白丰度值; 代表 NP施肥模式下蛋白丰度值。
Expression abundance under NT fertilizer application model; Expression abundance under NP fertilizer application model.


图 8 不同氮肥比例下叶片叶绿素 SPAD值
Fig. 8 SPAD values of leaf under different N proportions

2.5 不同氮肥比例下叶片可溶性蛋白含量以及
细胞保护酶活性的变化
根据差异蛋白结果可知, 32个蛋白中有 18个的
表达呈下降趋势, 并且 NP 施肥方式下这些蛋白下
降的趋势较小。图 10所示, 籽粒灌浆期叶片可溶性
蛋白含量呈下降趋势, 籽粒灌浆 21 d后, NP施肥模
式下, 可溶蛋白含量下降的趋势比 NT 施肥模式小,
可见 NP 施肥方式确能延缓籽粒灌浆期叶片蛋白的
降解。此外, 5个与叶片抗逆相关蛋白, 结果显示 NP
施肥能够促进其在灌浆中后期的表达, 为了进一步
验证氮素对叶片抗逆能力的影响, 进一步测定了灌
浆期叶片保护酶在两种不同施肥模式下的变化。由
图 11 可见, 灌浆前期叶片 SOD 活性在两种不同施
肥模式下差别不大, 到了灌浆的中后期(14 d), NT施
肥模式下叶片 SOD活性开始出现明显的下降趋势。
CAT活性在籽粒灌浆期都呈下降趋势, 但是由图 12
可知, NT 施肥模式下 CAT 下降的速率较快。POD
活性在籽粒灌浆早期有个上升的过程, 到了灌浆的
中期开始出现下降的趋势, 由图 13可知, NP施肥模
式下, 灌浆早期 POD 上升幅度较大, 灌浆中后期下
降的幅度又较小。由此可知, 后期适当增加氮素供
应确能有效提高叶片保护酶活性, 从而提高叶片在
灌浆期的抗逆能力。
第 5期 张志兴等: 氮肥运筹对大穗型水稻品种金恢 809灌浆期叶片蛋白质表达的影响 849



图 9 不同氮肥比例下叶片光合速率
Fig. 9 Photosynthetic rate of leaf under different N propor-
tions

图 10 不同氮肥比例下叶片可溶性蛋白变化
Fig. 10 Changes of soluble protein in leaf under different N
proportions

图 11 不同氮肥比例下叶片 SOD活性变化
Fig. 11 Changes of SOD activity in leaf under different N
proportions

图 12 不同氮肥比例下叶片 POD活性变化
Fig. 12 Changes of POD activity in leaf under different N
proportions

图 13 不同氮肥比例下叶片 CAT活性变化
Fig. 13 Changes of CAT activity in leaf under different N
proportions

3 讨论
3.1 叶片蛋白组学对氮肥调控的响应
3.1.1 光合系统相关蛋白的响应 水稻叶片的光
合同化物质作为籽粒灌浆的主要营养物质来源之一,
对产量的形成起着极其重要的作用。本研究中鉴定
到的 32 个差异蛋白中有 12 个与光合代谢相关, 暗
示氮肥对灌浆期叶片光合能力具有重要的调节作
用。spot 23 为叶绿素 a/b 结合蛋白, 是捕光叶绿素
结合蛋白(LHC)的成分[23], 绿色植物通过 LHC 接受
太阳能最终同化 CO2。随着灌浆的进行, 该蛋白在
水稻叶片中的表达量也逐渐下调, 但 NP 施肥下降
解的速率较慢, 说明后期氮肥的增加有利于延缓叶
片色素蛋白的降解, 从而有利于叶片在灌浆后期吸
收较多的太阳能。
NADPH 和 ATP 通常被认为是植物的同化能
力。鉴定到的 ATP合酶 γ链(spot 15)和 ATP合酶 CF1
α亚单位(spot 9)参与 ATP酶的合成, 而 ATP合酶的
主要生理功能是合成 ATP。鉴定到的 NADPH 铁氧
还原蛋白(spot 16), 是光合电子传递中关键的酶, 参
与 NADPH的合成[24]。随着叶片的衰老, NADPH以
及 ATP 合成量的减少, 产生的同化力逐步下降, 造
成灌浆后期 CO2同化的减少, 而对于水稻尤其是大
穗型水稻来说, 灌浆后期往往是弱势籽粒灌浆的重
要时期, 此时光合同化能力, 对弱势籽粒灌浆具有
重要作用。本研究发现, NP施肥能够提高这 3个与
光合同化能力相关蛋白在籽粒灌浆后期叶片中的表
达, 意味着后期适当增加氮肥能够使叶片保持较高
的同化能力。
叶片要利用同化力(NADPH和 ATP), 经过卡尔
文循环将 CO2转化为糖类运输到籽粒中, 为其灌浆
提供营养物质。spot 5、spot 14、spot 17和 spot 18
这 4个点都被鉴定为甘油醛 3-磷酸脱氢酶(GADPH),
850 作 物 学 报 第 37卷

灌浆期这 4个蛋白在 NP施肥方式下的表达量比 NT
方式高。此外, 核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚型
前体(spot 30), 核酮糖二磷酸羧化酶大链(spot 31),
核酮糖二磷酸羧化酶 /加氧酶大亚基(spot 32), 这 3
个蛋白都是核酮糖二磷酸羧化酶 /加氧酶(Rubisco)
的重要组成部分, NP 施肥方式下, 这 3 个蛋白在灌
浆前中期(花后 7 d, 14 d, 21 d)都是低丰度表达, 花
后 28 d 才略微出现上调表达, 而在 NT施肥方式下
这 3个蛋白在灌浆 14 d就开始出现明显的上调表达
现象, 这可能是由于NT施肥下, 后期氮素供应不足
造成叶片中 Rubisco 在灌浆的中期就开始出现大量
的降解, 而 NP 施肥方式推迟了 Rubisco 的降解。
Rubisco 和 GADPH 都是卡尔文循环的关键酶 ,
Rubisco参与 CO2的羧化, GADPH参与 CO2的还原。
由此可见, NP施肥方式增加了灌浆期土壤中氮的供
应, 能够有效地延缓上述 2个关键酶的降解 , 保证
了灌浆后期卡尔文循环的顺利运转, 使叶片能有较
充足的同化物质输出。
此外, 本研究鉴定到的氨基甲基转移酶(spot 20)
与光呼吸代谢相关, 该蛋白属于甘氨酸脱羧酶家族,
催化亚甲基四氢叶酸的合成[25]。四氢叶酸是光呼吸
代谢中的一个关键酶, 而光呼吸与植物光合作用的
关系密切。大量的研究认为, 光呼吸能够减缓叶绿
素的降解[26], 使叶片中的 Rubisco 含量增加[27], 调
节 PSI和 PSII之间的状态转换[28]。在本试验中, NP
施肥方式下, 氨基甲基转移酶在籽粒灌浆期的表达
量相对 NT 施肥有所提高, 说明增加灌浆期氮素的
供应能够促进叶片中光呼吸代谢, 进而影响叶片的
光合代谢。
3.1.2 抗逆相关蛋白的响应 籽粒灌浆期间, 叶
片作为主要的源器官代谢旺盛, 但由于此时营养物
质主要运往籽粒, 叶片受到营养胁迫。由于旺盛代
谢和营养胁迫的矛盾使光合碳循环遭到破坏, 能量
代谢失调, 产生自由基, 自由基的量超出防御性保
护酶系统的清除能力, 过量自由基引发膜脂过氧化
作用, 从而引起叶片的衰老。这必然影响籽粒的灌
浆结实, 且主要是对弱势粒产生影响[10]。如何采取
有效的栽培调控措施, 延缓叶片的衰老, 是水稻尤
其是大穗型水稻高产的重要问题。林文雄等[29]研究
认为合理的施氮能够促使水稻叶片的保护酶活性处
于相对较高的生理状态, 从而保证水稻叶片在生育
后期不早衰。本试验发现, 在鉴定到的蛋白点中有 3
个与自由基清除相关蛋白, 2个与抗逆基因表达相关,
这似乎也从蛋白表达水平暗示氮肥调控对叶片的抗
逆起着重要作用。
植株体内活性氧自由基产生与清除的平衡至关
重要, 这一平衡的紊乱将导致植株的衰老和死亡。
植物通过各种方式产生活性氧, 同样也有各种相对
应的清除活性氧自由基的途径, 本试验共鉴定到 3
个参与活性氧自由基清除相关的蛋白。超氧化物歧
化酶(SOD, spot 25)主要参与自由基的清除和膜的保
护。依赖谷胱甘肽脱氢抗坏血酸还原酶(spot 24)是植
物细胞内合成抗坏血酸的一个关键酶, 而抗坏血酸
也是植物组织中一个重要的清除活性氧自由基的化
学物质。spot 6被鉴定为类异黄酮还原酶, Kim等[30]
研究发现过量表达水稻的一个类异黄酮还原酶基因
(OsIRL)会提高叶片清除活性氧自由基的能力。虽然
上述 3 个蛋白的表达趋势, 在籽粒灌浆过程中的变
化趋势不一样, 但是在 NP施肥方式下, 这 3个蛋白
的表达量相对 NT 施肥都表现出上调的现象, 可见
后期适当增加氮素的供应能够提高叶片中活性氧清
除酶系统的能力, 有效阻止高浓度氧的积累, 从而
延缓叶片的衰老。
本试验中, 在 NP 施肥方式下出现上调表达的
蛋白中有 2个是与转录因子以及锌指蛋白相关的 ,
分别为 WRKY转录因子(spot 28), MYND型锌指蛋
白(spot 29)。前人研究认为, 在活性氧类物质存在时,
有一些转录因子如 MYB、WRKY、热激因子和多种
类型锌指蛋白的含量增加, 它们共同参与维持活性
氧的含量稳定[31]。可见, WRKY 转录因子以及锌指
蛋白的上调表达, 也是后期适当增加氮素能够延缓
叶片衰老的一个重要原因。
3.1.3 细胞生长和分化相关蛋白的响应 细胞是
植物体形态结构和生命活动的基本单位, 籽粒灌浆
期叶片正常的细胞活动对维持其源器官的功能起着
重要的作用。肉桂醇脱氢酶(CAD, spot 10, spot 12)
是木质素生物合成过程中的一个关键酶类, 而木质
素又是构成植物细胞壁的成分之一, 具有使细胞相
连的作用[32]。可逆的糖基化多肽(spot 7), 参与细胞
壁多糖的合成[33]。v-SNARE家族膜泡运输蛋白(spot
26), 促进植物细胞板形成, 能与离子通道蛋白相互
作用, 有利于植物的正常生长发育[34]。上述 4 个参
与细胞活动的蛋白在 NP 施肥方式下都出现上调表
达。由此可见, 氮素的改变对植物叶片中正常的细
胞活动也起着重要的调节作用, 籽粒灌浆期足够的
氮素供应能够保证叶片正常的细胞活动。
第 5期 张志兴等: 氮肥运筹对大穗型水稻品种金恢 809灌浆期叶片蛋白质表达的影响 851


半胱氨酸蛋白酶(spot 4)与植物细胞程序化死亡
有关系,可降解贮存蛋白, 实现氮素的再利用[35]。该
蛋白在NT施肥方式下, 出现上调表达的现象, 这可
能是由于后期土壤中氮肥的供应不足, 不能够满足
水稻灌浆期对氮的需求, 因此, 叶片中主要的储存
氮元素的蛋白被降解, 以释放更多的氮元素运输至
籽粒中, 然而叶片中大量的储存氮元素的蛋白被降
解, 必然导致其衰老的加快, 造成籽粒灌浆后期叶
片源功能的衰退, 影响了籽粒的灌浆, 后期适当增
加氮肥的施用(NP 施肥), 使土壤中氮元素的供应较
充足, 能够为籽粒的灌浆提供较多的氮, 因此半胱
氨酸蛋白酶的活性相对后期低氮的处理(NT 施肥)低,
从而延缓了相关蛋白的降解, 延缓了叶片的衰老。
此外 , 半胱氨酸蛋白酶也存在于叶绿体和液泡中 ,
可降解光合作用必需酶 Rubisco 的大亚基。本试验
也发现, NT施肥下, 半胱氨酸蛋白酶出现上调表达,
与之相对应的是本试验也鉴定到在 NT 施肥下多个
与 Rubisco相关蛋白发生降解, 如 spot 30、spot 31
和 spot 32), 这进一步说明, 后期氮肥的的供应不足,
会造成光合反应中重要的 Rubisco 酶降解, 使叶片
在灌浆后期的光合能力下降 ,反之适当增加后期氮
素的供应能够降低半胱氨酸蛋白酶的活性, 延缓叶
片的衰老。
3.1.4 植物激素及信号转导相关蛋白响应 叶片
的衰老速度和激素的水平密切相关。鉴定到 3 个与
激素相关的蛋白 , 顺式玉米素-O-葡萄糖基转移酶
(spot 11), 能够激发植物体内细胞分裂素活性 [36],
而细胞分裂素能够调节叶绿素的合成、物质的分解
代谢、矿质营养的转移和再分配等多种生理生化过
程, 提高细胞分裂素的含量在一定程度上能够延缓
植物的衰老[37]。乙二醛酶 I (spot 2)是磷酸化蛋白,
是赤霉素(GA3)信号通路中重要成分[38], GA3能够提
高叶片中清除自由基的能力[39]。NP施肥方式下能够
提高上述 2个蛋白在叶片中的表达 , 可见适当增加
后期氮肥施用比例能够提高籽粒灌浆后期叶片中细
胞分裂素的活性, 促进 GA3 的信号转导, 使叶片保
持合理的激素水平, 这不仅有利于其正常的生理活
动 , 同时在一定程度上延缓了叶片的衰老。同时 ,
ABA 诱导的蛋白激酶(spot 3)受 ABA 诱导表达, 该
蛋白的表达量从花后 14 d出现上调表达的趋势, 暗
示着籽粒灌浆后期叶片中的ABA含量逐渐上升, 而
ABA 能抑制蛋白质的合成, 加速叶片中蛋白质和核
酸的降解, 造成叶片的衰老。此外, NP施肥方式下,
该蛋白的表达量到了后期上调的幅度较小, 暗示着
氮素的增加能够降低灌浆后期叶片中 ABA的含量。
陈新红等[40]的研究也认为, 增加氮素的供应能够降
低灌浆期叶片中 ABA含量, 这与本试验结果一致。
S-腺苷甲硫氨酸合成酶(spot 8)催化甲硫氨酸和
ATP生成 S-腺苷甲硫氨酸(SAM), SAM既是植物体
内转甲基反应的甲基供体及多胺的前体[41], 同时也
是植物生物碱合成过程中甲基化反应唯一的甲基供
体[42-43]。植物组织中的多胺具有自由基清除剂的能
力 , 可提高活性氧清除酶类如超氧化物歧化酶
(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等的
活性[38]。本试验发现, NP施肥方式下能够提高 S-腺
苷甲硫氨酸合成酶在灌浆 21 d以及 28 d的表达, 进
而促进叶片中蛋白的甲基化反应以及多胺的合成 ,
有利于保护酶活性的提高。
spot 27 被鉴定为钙调素(CaM), 该蛋白的表达
在 NP 施肥方式下出现下调现象。CaM 是植物体内
一种主要的钙结合蛋白, 与细胞内 Ca2+一起共同调
节许多重要的生理生化过程。钙作为植物生长发育
的第二信使已得到广泛认可, Ca2+对植物衰老具有
重要的调节作用, 胞质内 Ca2+增加, 激活 Ca2+-CaM
系统, 促进乙烯生成, 加速衰老。内源 CaM 含量变
化与乙烯的生成密切相关, 植物衰老时, CaM 含量
增加; 降低 CaM 含量, 推迟衰老。本试验也证实后
期氮肥比例高的处理下, 能降低叶片灌浆后期 CaM
的表达, 这对延缓灌浆期叶片的衰老是有利的。
综上可知, 氮肥调控下水稻叶片有 32个蛋白点
出现差异表达, 其中 5个为功能未知的假想蛋白 ,
其余 27个蛋白点都分别得到鉴定, 这些蛋白具有不
同的功能, 参与了不同的代谢途径, 归属不同的功
能类群, 然而植物的生理活动是个复杂的生态过程,
氮素调控水稻叶片的生理活动并不是单单通过改变
某一类蛋白的表达而实现的, 必然是要通过上述出
现差异表达的蛋白共同起作用, 从整体上影响水稻
叶片的生理代谢活动。
3.2 叶片光合作用及保护酶等生理指标的响应
植物中的各种生理活动与蛋白质之间的相互作
用紧密相关, 蛋白是功能的执行者, 而生理活动是
外在体现者。通过上述分析可知, 虽然鉴定到蛋白
功能涉及光合代谢、抗逆反应、细胞分化、激素合
成等, 但是主要是对叶片的光合以及抗逆能力产生
影响, 因此, 为了明确氮肥调控对水稻叶片作用的
机制, 进一步考察了不同氮肥比例下叶片光合以及
852 作 物 学 报 第 37卷

保护酶等相关生理指标的变化。
本研究在灌浆期对两种不同氮肥比例下水稻叶
片叶绿素 SPAD 值以及光合速率的考察发现, 在水
稻的生育后期适当增加氮肥的供应, 能够有效地延
缓籽粒灌浆期叶绿素的降解以及光合速率的下降 ,
与上述光合相关蛋白表达的趋势一致, 证明了蛋白
鉴定结果的准确性。前人研究认为在水稻生育后期
增施氮素营养能提高水稻功能叶片的光合能力, 延
缓叶片的衰老和光合功能的衰退 [15,44-45], 赵全志
等[46]研究认为增加后期的施氮量有利于提高叶片的
叶绿素含量和叶片的含氮量, 这与本试验的研究结
果一致。
对灌浆期叶片的可溶性蛋白含量以及细胞保护
酶活性的考察发现, 叶片中可溶性蛋白含量随着灌
浆的进行逐渐下降, 但NP施肥方式下, 可溶性蛋白
含量下降的趋势明显比 NT 方式小, 这说明在籽粒
灌浆期适当增加氮素的供应, 能够有效延缓叶片中
可溶性蛋白的降解。植物体内的可溶性蛋白既是氮
素吸收同化的产物, 又是植物体内可转运氮的贮存
物 , 是构成光合与其他生理生化过程的活性基础 ,
与植物氮的吸收、同化、转运及酶生理生化作用密
切相关。因此, 水稻生育后期叶片可溶蛋白含量的
高低可以反映叶片生理生化作用状态[47]。NP施肥方
式下, 籽粒灌浆后期较高的可溶性蛋白含量, 对维
持叶片正常的生理代谢起着重要的作用。SOD、
CAT、POD是植物抗氧化酶系统中的 3种重要保护
酶, 在本试验中, 籽粒灌浆期这 3种酶在 NP施肥方
式下都表现出较高的活性, 可见加大水稻生育后期
氮素的供应, 能够增强细胞膜的抗氧化能力, 降低
质膜受损程度, 维持细胞结构及功能的稳定性, 从
而延缓水稻叶片衰老, 这与杨安中等[12-13]研究的观
点一致。
由此可见, 氮肥运筹方式对叶片的光合作用以
及抗逆能力有重要的作用, 适当增加水稻生育后期
土壤中氮素的供应, 能够有效地延长水稻籽粒灌浆
期叶片的有效功能期, 从而保证水稻籽粒灌浆的主
要“源”器官叶片合成更多的同化物质, 转运至籽粒
中, 促进了籽粒的灌浆, 尤其对大穗型水稻籽粒灌
浆中后期的弱势籽粒的灌浆是有利的。本研究所近
3年, 连续考察了不同氮肥比例运筹方式大穗型水
稻产量的影响, 发现 NP 施肥模式下水稻每穗粒数
平均提高 5%, 结实率提高 5%, 千粒重提高 0.85 g,
最终产量提高约 14%, 这也说明在总施氮量不变的
情况下, 后期适当增加氮素的供应的施肥方式确能
提高大穗型水稻的产量, 结果另文报道。
4 结论
在栽培调控上如何采取有效的措施保持叶片在
灌浆期的正常代谢活动, 对大穗型水稻高产潜力的
发挥具有重要的作用。在全生育期总施氮量为 225
kg hm−2 的情况下, 适当增加后期穗粒肥的模式(NP
施肥方式)能够有效延缓叶片的衰老, 使叶片在灌浆
的中后期还具有较高的光合能力, 保证后期光合同
化物质的合成与输出, 促进大穗型水稻高产潜力的
发挥。但是, 籽粒灌浆是个复杂的生理生态过程, 要
通过栽培措施促进籽粒灌浆, 达到增产的目的, 不
仅需要掌握各灌浆时段的特性, 还要明确光、温、
湿等环境因子的生态作用以及综合影响。
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