全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(2): 243−246 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 浙江省重大科技攻关项目(2006C22016)
作者简介: 陆艳婷(1969−), 女, 硕士, 助理研究员, 从事水稻育种研究。E-mail: lytcc2003@hotmail.com
* 通讯作者(Corresponding author): 金庆生(1955−), 研究员, 从事水稻育种研究。Tel: 0571-86404200; E-mail: jinqs@mail.hz.zj.cn
Received(收稿日期): 2007-05-10; Accepted(接受日期): 2007-07-31.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00243
利用等位基因特异扩增快速检测水稻香味基因
陆艳婷 刘庆龙 王俊敏 严文潮 俞法明 金庆生*
(浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所, 浙江杭州 310021)
摘 要: 水稻香味受隐性基因控制, 杂合材料不表现出香味, 因此在香稻选育中需要寻找一种快速、简便的香味基因
检测方法。本试验通过等位基因特异扩增(ASA)方法对 9个香稻和 3个非香稻品种 (品系), 以及 3个香稻/非香稻组合
的 F1的香味基因, 进行快速检测。结果显示, 纯合非香稻可获得长度为 585和 355 bp的两条带, 纯合香稻可获得长
度为 577和 257 bp的两条带, 杂种 F1可获得长度为 355、257和 580 bp左右的 3条带。供试材料的分子检测结果与
香味基因型完全相符, 所用方法快速有效, 可应用于香稻育种实践。
关键词: 水稻; 香味基因; 等位基因特异扩增
Detection of Rice Fragrant Gene by Allele-Specific Amplification
LU Yan-Ting, LIU Qing-Long, WANG Jun-Min, YAN Wen-Chao, YU Fa-Ming, and JIN Qing-Sheng*
(Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, Zhejiang, China)
Abstract: The technically simplified approach of marker-assisted selection has directly and practically used in rice breeding.
Fragrance in rice, a recessive trait, has been known to be due to an 8 bp deletion and 3 SNPs difference in a gene on chromosome
8. Rice breeders have an interest in gaining access to a simple and inexpensive method for distinguishing between fragrant and
non-fragrant rice. Allele specific amplification (ASA) is a low-cost, robust technique that can be utilized to discriminate between
the alleles. We used a single tube ASA assay which allows discrimination between 9 fragrant and 3 non-fragrant rice varieties and
3 F1 plants to identify homozygous fragrant, homozygous non-fragrant, and heterozygous non-fragrant individuals. The research
showed that using tetras-primer amplification refractory mutation system PCR could result in three possible outcomes. External
primers generated a fragment of approximately 580 bp as a positive control for each sample. Internal and corresponding external
primers produced a 355 bp fragment from a non-fragrant allele, a 257 bp fragment from a fragrant allele and both 355 bp and
257 bp fragment from a heterozygous allele allowing simple analysis on agarose gels. A single tube allele specific PCR which
allows determination of the genotypic status of an individual rice plant, either homozygous fragrant, homozygous non-fragrant or
heterozygous has practical utility for rice breeders worldwide.
Keywords: Rice; Fragrant gene; Allele specific amplification
香稻因具有独特的香味特征而倍受广大消费者
欢迎和育种工作者的重视, 香米的国际市场价格远
高于非香稻米。因此香稻育种已成为现代水稻育种
的重要内容之一, 明确香味遗传的分子生物学机理
有利于新品种的选育。
从 20 世纪 70 年代起, 就有许多研究者对香米
的香气成分进行了广泛而深入的研究, Yajima 等在
1979年报道香米含有 114种挥发性化合物[1]。Buttery
等研究表明, 米粒中含有 2-乙酰-1-吡咯啉是香米香气
的主要成分[2], 因此, 通常采用咀嚼法或使用 KOH
法[3] 来区分香稻与非香稻, 但同一香稻品种在不同种
植地域会表现香、微香与甚至几乎不香[4-5], 给鉴别工
作带来一定困难, 因此在香稻的选育中, 特别是在
田间香味表达不显著时如何高效地利用基因型进行
选择, 是广大育种工作者面临的问题。大多数研究
表明水稻的香味遗传受第 8 条染色体上的隐性单基
因控制[6-15]。澳大利亚学者 Bradbury等在 2005年报
道水稻香味的产生是第 8 染色体上一个编码 BAD2
244 作 物 学 报 第 34卷

蛋白的基因缺失 8 个碱基和 3 个单核苷酸差异, 导
致基因编码的过早停止, 蛋白结构改变所致。同时
泰国学者 2005年底也宣布, 他们在对泰国香米的研
究中发现了导致香味的原因, 也是第 8 染色体上控
制香味的基因比正常水稻缺失了 8 个碱基 , 与
Bradbury 等结果相仿, 并且已经在美国专利与商标
局申请了 4项专利[16]。
已有众多的研究者利用 SNP、RFLP、SSR 和
ISSR等与香味基因连锁的标记来分析水稻的香味品
种 [7,10,14-15,17], 然而这些标记可能存在假阳性的情
况。在育种实践中如能直接利用基因型进行鉴定, 将
有助于提高育种效率。本研究根据 Bradbury等的研究
结果, 利用扩增受阻突变体系 PCR(ARMS, amplifica-
tion refractory mutation system)技术进行等位基因特异
扩增(ASA, allele specific amplification)来检测水稻香
味基因, 旨在建立快捷准确的基因分型法来鉴定水稻
香味 fgr等位基因, 以提高香味性状的选择效率。
1 材料与方法
1.1 供试材料
香稻品种(品系)Rmt(浙江省农业科学院作物与
核技术利用研究所通过辐射诱变获得的突变系 ),
HDF80, CRRI 香, 中海香 1 号, 航香 10 号, 大粒香,
R4020, R4013, 云南黑香米(黑香米); 非香稻品种(品
系)秀水 110, 日本晴, R128; 以及秀水 110、日本晴、
R128 分别与 Rmt 杂交的杂种 F1。均在 2006 年春播
于浙江省农业科学院试验田内, 按当地水稻常规栽
培方式管理。
1.2 试验方法
1.2.1 标记引物 引物序列来自 Bradbury 等的报
道[12], 4条单核苷酸引物 ESP(External Sense Primer)、
INSP(Internal Non-fragrant Sense Primer)、IFAP(Internal
Fragrant Antisense Primer)、EAP(External Antisense
Primer) (图 1)由上海生工生物工程技术服务有限公司
合成。非香稻品种核苷酸序列来自 NCBI 网页, 编号
为 AP004463, BAC克隆的香味 fgr基因核苷酸序列来
自 Bradbury等的报道[11]。
1.2.2 试验基本原理 等位基因特异扩增法, 是
根据香味基因 fgr 与非香稻品种对应的核苷酸序列
存在缺失和单核苷酸差异设计等位基因特异引物 ,
当引物序列与目标等位基因序列完全配对时, 通过
PCR 扩增, 特异引物仅在一种基因型中有扩增产物,
而在另一种基因型中没有扩增产物, 从而可以区分
香稻、非香稻及其杂合体, 是一种快速、简便、低
成本、高通量的基因型检测方法。在实验中, 引入
四引物 ARMS-PCR法, 在突变位点设计 2个延伸方
向相反的内侧引物 INSP 和 IFAP, 然后按常规方法
设计 2个方向相反的外引物 ESP和 EAP(图 1), 用这
4个引物链组成的 3对引物在 1个 PCR反应中进行
扩增(也称巢式 PCR), 扩增产物用凝胶电泳检测, 出
现 2 条带的是纯合型 (纯合香型或纯合非香型), 出
现 3条带的是杂合型。
1.2.3 DNA 提取 苗期分单株取叶片, −20℃保
存备用。按毛加宁等提供的 CTAB法[18] 提取幼苗叶
片全基因组 DNA。
1.2.4 PCR扩增 在 200 μL PCR管中, 加 10 ×
buffer 3 μL, 25 mmol L−1 MgCl2 1.8 μL, 10 mmol L−1
dNTP 0.6 μL, 100 μmol L−1引物 ESP、IFAP、INSP、
EAP各 0.5 μL, Taq DNA聚合酶 1 U, DNA模板 40~
80 ng, 用 ddH2O将总体积补足至 30 μL。在 Biometra
公司 T1 Thermocycler 型 PCR 扩增仪上按下列程序
扩增, 94℃预变性 5 min; 接着 94℃ 30 s, 54℃ 30 s,
72℃ 30 s扩增 30个循环; 最后 72℃延伸 10 min。
1.2.5 电泳检测 PCR 扩增产物在浓度为 1%的
含 EB 的琼脂糖凝胶上于 0.5 × TBE 缓冲液中电泳,
用 Bio Basic Inc. 100 bp DNA Ladder作分子量标记,
然后在凝胶成像系统(BIO-RAD Gel Doc EQ)上成像。
2 结果与分析
对非香稻与香稻亲本进行四引物 ARMS-PCR
扩增, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳可显示出 3 种位
置的条带(图 2), 被外引物 ESP和 EAP扩增的 580 bp
左右的条带(非香稻为 585 bp, 香稻为 577 bp)在每一
个样品中均出现, 主要起到阳性对照的作用, 它也
可以有效地降低非特异 PCR产物的扩增和引物二聚
体的形成[19]。355 bp的条带符合非香稻的等位基因
被正向内引物 INSP和反向外引物 EAP扩增的 PCR
产物。257 bp的条带符合香味等位基因被反向内引
物 IFAP和正向外引物 ESP扩增的产物。
图 2所示日本晴等非香稻品种经 ARMS-PCR可
获得 580 bp和 350 bp左右的两条带, Rmt等香味品
种可获得 580 bp和 250 bp左右的两条带, 根据引物
设计的扩增原理, 可以断定日本晴等为纯合非香型
水稻, Rmt等为纯合香型水稻。
图 3显示了 3组非香稻与香稻品种及其杂种 F1
的四引物 ARMS-PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结
果, 纯合香型、纯合非香型均显示两条带, 杂种 F1
则显示 3条带, 其中 355 bp和 257 bp分别为双亲的
特征带型。图 2和图 3的 PCR扩增的结果可准确地
反映出田间种植材料的基因型。
第 1期 陆艳婷等: 利用等位基因特异扩增快速检测水稻香味基因 245


图 1 水稻 8 号染色体上 AP004463 BAC 克隆中标记香味基因的序列
Fig. 1 The sequences of fragrant and non-fragrant rice chromosome 8 of the AP004463 BAC clone



图 2 琼脂糖凝胶电泳显示非香稻、香稻的ARMS-PCR产物带型
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis showing the banding patterns
of non-fragrant and fragrant varieties by ARMS-PCR
1~3: 非香稻品种秀水 110、日本晴、R128; 4~12: Rmt、HDF80、
CRRI香、中海香 1号、航香 10号、大粒香、R4020、R4013、
黑香米; 13: 不加 DNA模板的空白对照。
M: 100 bp DNA Ladder. Lane 1–3: non-fragrant variety Xiushui
110, Nipponbare, and R128, respectively. Lane 4–12: fragrant vari-
ety Rmt, HDF80, CRRI-Xiang, Zhonghaixiang 1, Hangxiang 10,
Dalixiang, R4020, R4013, and Heixiangmi, respectively. Lane 13:
Negative control.

图 3 琼脂糖凝胶电泳显示非香稻、香稻、杂种F1 的ARMS-PCR
产物带型
Fig. 3 Agarose gel electrophoresis showing the banding pat-
terns of non-fragrant and fragrant varieties, and heterozygous
individual by ARMS-PCR
1、4、7: 非香稻品种秀水 110、日本晴、R128; 3、6、9: 香稻品
种 Rmt; 2、5、8: 秀水 110/Rmt、日本晴/Rmt、R128/Rmt的杂种 F1。
M: 100 bp DNA Ladder. Lane 1, 4, and 7: non-fragrant varieties
Xiushui 110, Nipponbare, and R128, respectively. Lane 3, 6, and 9:
fragrant variety Rmt. Lane 2, 5, and 8: heterozygous individual
Xiushui 110/Rmt, Nipponbare/Rmt, and R128/Rmt, respectively.
1 11 21 31 41 51
Non Fragrant Rice TACCAGGACT TGTTTGGAGC TTGCTGATGT GTGTAAAGAG GTTGGTCTTC CTTCAGGTGT
Fragrant Rice TACCAGGACT TGTTTGGAGC TTGCTGATGT GTGTAAAGAG GTTGGTCTTC CTTCAGGTGT
5′-T TGTTTGGAGC TTGCTGATG -3′(ESP，F-primer)
61 71 81 91 101 111
Non Fragrant Rice GCTAAACATA GTGACTGGAT TAGGTTCTGA AGCCGGTGCT CCTTTGTCAT CACACCCTGG
Fragrant Rice GCTAAACATA GTGACTGGAT TAGGTTCTGA AGCCGGTGCT CCTTTGTCAT CACACCCTGG
121 131 141 151 161 171
Non Fragrant Rice TGTAGACAAG GTACAGCTAT TCCTCCTGTA ATCATGTATA CCCCATCAAT GGAAATGATA
Fragrant Rice TGTAGACAAG GTACAGCTAT TCCTCCTGTA ATCATGTATA CCCCATCAAT GGAAATGATA
181 191 201 211 221 231
Non Fragrant Rice TTCCTCTCAA TACATGGTTT ATGTTTTCTG TTAGGTTGCA TTTACTGGGA GTTATGAAAC
Fragrant Rice TTCCTCTCAA TACATGGTTT ATGTTTTCTG TTAGGTTGCA TTTACTGGGA GTTATGAAAC
241 251 261 271 281 291
Non Fragrant Rice TGGTAAAAAG ATTATGGCTT CAGCTGCTCC TATGGTTAAG GTTTGTTTCC AAATTTCTGT
5′-C TGGTAAAAAG ATTATGGCTT CA -3′(INSP，F-primer)

Fragrant Rice TGGTATATA* *******TTT CAGCTGCTCC TATGGTTAAG GTTTGTTTCC AAATTTCTGT
3′-CCATATAT* *******AAA GTCGACGAGG ATAC -5′(IFAP，R-primer)
301 311 321 331 341 351
Non Fragrant Rice GGATATTTTT TGTTCTCTTT CTACTAACTC TCTATTATCA ATTCTCAATG TTGTCCTTTT
Fragrant Rice GGATATTTTT TGTTCTCTTT CTACTAACTC TCTATTATCA ATTCTCAATG TTGTCCTTTT
361 371 381 391 401 411
Non Fragrant Rice CTTTTAACTC CTTTACTTTT TAGAATTGTG ATCAAGACAC TTTGAGCATC ATTCTAGTAG
Fragrant Rice CTTTTAACTC CTTTACTTTT TAGAATTGTG ATCAAGACAC TTTGAGCATC ATTCTAGTAG
421 431 441 451 461 471
Non Fragrant Rice CCAGTTCTAT CCTGTTTCTT ACCTTTTTAT GGTTCGTCTT TTCTTGACAG CCTGTTTCAC
Fragrant Rice CCAGTTCTAT CCTGTTTCTT ACCTTTTTAT GGTTCGTCTT TTCTTGACAG CCTGTTTCAC
481 491 501 511 521 531
Non Fragrant Rice TGGAACTTGG TGGAAAAAGT CCTATAGTGG TGTTTGATGA TGTTGATGTT GAAAAAGGTA
Fragrant Rice TGGAACTTGG TGGAAAAAGT CCTATAGTGG TGTTTGATGA TGTTGATGTT GAAAAAGGTA
541 551 561 571 581 591
Non Fragrant Rice CATGCCACTT GCTATGATTA ACTAATTCTG AAGTGCGGGA CTTTGTAAAG CACTTAACTG
Fragrant Rice CATGCCACTT GCTATGATTA ACTAATTCTG AAGTGCGGGA CTTTGTAAAG CACTTAACTG
（EAP, F-primer） 3′-CGCCCT GAAACATTTC GTGA -5′
246 作 物 学 报 第 34卷

3 讨论
四引物 ARMS PCR 技术是一种在普通 PCR 和
ARMS 基础上发展起来并专门用于检测单核苷酸突
变的衍生技术, 它综合了四引物 PCR 技术的优点,
对单核苷酸突变检测具有快速、简便、可以区分等
位基因是否纯合以及费用低廉等特点。Ye、卜莹、
管峰等众多试验中引用的四引物 ARMS-PCR 法核
心是, 引物 3′末端碱基必须落在突变的位置上, 2个
内引物 3′末端碱基分别与 SNP位点的 1个碱基相同
(或互补), 并常常再引入错配碱基以增加引物的特
异性[20-22]。而本试验的 2 个延伸方向相反的内引物
是利用 fgr基因的 8个缺失和 3个单核苷酸差异, 引
物的稳定性好, 避免了引物 3′末端与模板不互补而
仍然延伸的情况, 增加了特异性, 使引物在与其互
补的模板中正常扩增, 减少了假阳性的发生。
关于水稻香味基因的遗传机理目前认识尚不一
致。众多学者与 Bradbury和泰国学者的观点一致[6-15],
但姚方印等、任光俊等和 Lorioux 等[23-25] 的研究结果
显示水稻香味遗传机理可能更为复杂。本研究的
ARMS-PCR 结果表明在试验所采用的材料中, 香稻品
种均符合第 8染色体上 8个碱基的缺失和 3个单核苷
酸的差异, 这与 Bradbury等对 14个香稻品种和 64个
非香品种的等位基因分析结果一致[11]。
4 结论
通过四引物 ARMS-PCR扩增, 纯合非香稻可获
得长度为 585 bp和 355 bp的两条带, 纯合香稻可获
得长度为 577 bp和 257 bp的两条带, 杂种 F1可获得
长度为 355、257 和 580 bp 左右的 3 条带。供试材
料的分子检测结果与香味基因型完全相符, 因此利
用本试验方法可以快速、准确地检测杂交后代分离
个体的香味基因型, 大大地提高分子育种的效率。
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