全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(9): 1597−1604 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家“十一五”科技支撑计划项目(2009BADA8B01)和国家自然科学基金项目(30800693)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 伍晓明, E-mail: wuxm@oilcrops.cn, Tel: 027-86812906
第一作者联系方式: E-mail: gaogz@oilcrops.cn
Received(收稿日期): 2011-01-20; Accepted(接受日期): 2011-04-27; Published online(网络出版日期): 2011-06-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110628.1012.023.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01597
热胁迫过程中白菜型油菜种子 DNA的甲基化
高桂珍 应 菲 陈碧云 李 浩 吕晓丹 闫贵欣 许 鲲 伍晓明*
中国农业科学院油料作物研究所 / 农业部油料作物生物学重点开放实验室, 湖北武汉 430062
摘 要: 过高的环境温度对植物造成热胁迫和热损伤, 影响植物的生长、发育, 以及种子的寿命。以白菜型油菜耐热
品种庆元本地油菜和不耐热品种绍兴矮大秆油菜新收获种子为材料, 研究了不同温度处理对油菜种子活力以及基因
组 DNA甲基化水平和状态的影响。结果表明, 种子经 37℃和 4℃处理 2 h, 发芽率和活力指数与对照差异不显著; 经
70℃处理 2 h后, 耐热和不耐热品种种子发芽率和活力指数均明显降低, 37℃热诱导后再进行 70℃热胁迫处理, 发芽
率和活力指数均高于直接 70℃处理的种子, 表明热诱导可以显著提高种子的耐热性。甲基化 MSAP 分析结果表明,
种子热胁迫过程中基因组 DNA甲基化水平降低, 同时有甲基化和去甲基化现象发生, 并以去甲基化现象为主。相关
性分析结果显示种子发芽势、发芽率、下胚轴长和活力指数与双链 DNA内部发生甲基化的条带数呈负相关, 而与双
链 DNA 外部发生甲基化的条带数呈正相关。更为重要的是耐热与不耐热性材料在热胁迫中表现完全相反的甲基化
变异模式, 耐热品种去甲基化的条带数多于不耐热品种, 但甲基化的条带数目则相反, 显示 DNA 甲基化与种子耐热
性有重要关系。在热胁迫过程中, 种子可能通过 DNA甲基化变化调控相关基因的表达来应对高温胁迫。
关键词: 白菜型油菜; 热诱导; 热胁迫; DNA甲基化; 活力指数
DNA Methylation of Seed in Response to Heat Stress in Brassica rapa L.
GAO Gui-Zhen, YING Fei, CHEN Bi-Yun, LI Hao, LÜ Xiao-Dan, YAN Gui-Xin, XU Kun, and WU
Xiao-Ming*
Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Oil Crops Biology of Ministry of Agriculture, Wuhan
430062, China
Abstract: High temperature or heat stress, causes thermal damage to plants, and affects plant growth, development, as well as
seed longevity. By using a seed heat tolerant genotype Qingyuanbendiyoucai and a seed heat susceptive genotype Shaoxingaida-
ganyoucai, this study aimed at investigation of the effect of different temperature treaments on seed vigor and DNA methylation of
these two landraces of Brassica rapa L. The result showed that the seed germination percentage and the vigor index present no
significant difference from those of CK under 37°C and 4°C, the seed vigor declined significantly under 70°C of heat stress, and
heat acclimation in 37°C for 2 h effectively enhanced seed thermo-tolerance. The results of MSAP analysis showed that the level
of global DNA methylation decreased under 70°C of heat stress, both DNA methylation and demethylation were detected, and
more DNA demethylation bands were recorded. Seed germinating potential, germination percentage, hypocotyl length, vigor in-
dex were significantly negatively correlatied with number of bands of full-methylated (both bands) at the internal cytosine, but
positively correlated with the the number of bands of full-methylated (both bands) at the external cytosine. Most importantly, op-
posite patterns of DNA methylation were discovered in heat tolerant and susceptive seeds under 70°C heat stress, more bands of
DNA demethylation were detected in the heat tolerant seeds, but more bands of DNA methylation were detected in the heat sus-
ceptive seeds, which suggested that DNA methylation and demethylation play an important role in seed heat tolerance, epigenetic
regulation of gene expression by DNA methylation is important for plant to cope with heat stress.
1598 作 物 学 报 第 37卷

Keywords: Brassica rapa L; Heat acclimation, Heat stress; DNA methylation; Vigor index
DNA甲基化(DNA methylation)是一种主要的表
观遗传修饰形式, 在高等植物中普遍存在, 它在基
因组防御、调控基因表达、参与异染色质形成、影
响染色体结构等方面有重要作用[1]。DNA甲基化水
平因植物种类而异, 大约 30%~50%的基因组 DNA
胞嘧啶处于甲基化状态, 其中绝大部分位于 CpG二
核苷酸和 CpNpG三核苷酸对中[2]。
DNA 甲基化和去甲基化是生物体应对各种逆
境的重要机制 [3], 近年来的研究表明 , 非生物胁迫
(如盐胁迫、干旱等)会影响基因组 DNA的甲基化水
平。Steward等[4]发现低温胁迫使玉米幼苗基因组甲
基化水平降低, 李雪林等 [5]研究发现盐胁迫后棉花
幼苗根基因组DNA甲基化比率低于对照, 同时棉花
幼苗根 DNA的甲基化水平与 NaCl处理浓度呈显著
负相关。钟兰等[6]认为不同品种间的耐盐性差异也
与甲基化水平有关, 耐盐小麦品种在盐胁迫后 10 d
比盐敏感小麦品种的甲基化程度更高。Chio等[7]研
究表明, 烟草叶片在重金属铝处理 12 h 后, 与不经
处理的叶片相比,基因组甲基化水平降低, 同时烟草
NtGPDL基因在非生物胁迫(重金属、低温和盐胁迫)
下, 基因编码区发生去甲基化模式; Hashida 等[8]研
究表明, 温度的变化可诱导金鱼草基因组中 Tam3
的转座子甲基化状态的明显改变, 高温可导致该转
座子超甲基化 , 而低温则导致该转座子去甲基化 ,
认为这种温度敏感转座子 Tam3 的甲基化状态在同
代中随着温度而可逆变化。研究还表明, 植物体内
基因组甲基化水平的变化与不同环境胁迫也有关[9],
DNA 甲基化的改变对植物来说是一种重要的胁迫
保护措施[10-11]。环境温度显著上升或下降会对植物
造成非生物胁迫, 研究表明高温储藏下, 种子的发
芽率逐步下降, 在种间和种内都出现明显的基因型
差异[12], 温度影响对种子基因型间差异的机制目前
还不太清楚。这种热胁迫下的基因型生活力的差异
与DNA甲基化的变化是否也有相似的关系, 还需进
一步研究。
甲基化敏感扩增多态性(MSAP)是一种基于同
裂酶应用在 AFLP 基础上发展起来的检测基因组
DNA 甲基化的方法 [13], 能够很好地反映基因组
DNA胞嘧啶的甲基化水平和状态[14]。Portis等[15]使
用这种方法研究发现, 辣椒种子在萌发过程中基因
组甲基化模式会发生明显改变。该技术已被应用于
水稻、油菜、棉花和小麦等多种植物的基因组 DNA
甲基化研究中[5,16-18]。
本研究观察不同耐热性油菜种子热胁迫下, 种
子生活力的变化, 分析热胁迫后基因组DNA甲基化
水平和模式的变化, 探讨在热胁迫过程中DNA甲基
化与种子耐热性的关系, 以期为研究耐热机制以及
热胁迫下植物的应对机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
由国家油料作物种质资源中期库提供稳定的地
方种品种, 经前期种子耐高温胁迫鉴定。其中耐热
品种庆元本地油菜 (国家种质库编号为 0038), 在
60℃高温下密封处理 1 个月后发芽率保持在 98%,
不耐热品种绍兴矮大秆油菜 (国家种质库编号为
0019), 相同处理后发芽率仅有 10%。
1.2 温度处理
将新收获种子放入锡箔袋中密封, 经不同的温
度或温度组合处理, 以分析 70℃热胁迫以及 37℃热
诱导及 4℃冷诱导对油菜种子的活力以及基因组
DNA 甲基化水平和状态的影响。由于 60℃高温下,
耐热种子可维持高生活力 6个月以上, 试验中将高
温胁迫温度提高到 70℃, 一方面缩短实验时间, 另
一方面也鉴定耐热种子在 70℃高温下的生活力变
化。试验设 6种处理: ①以不经任何处理的原始种子
作对照; 37② ℃处理 2 h; 4③ ℃处理 2 h; 37④ ℃处理
2 h, 室温放置 1 h, 70℃处理 2 h; 4⑤ ℃处理 2 h, 室
温放置 1 h, 70℃处理 2 h; 70⑥ ℃处理 2 h。将处理后
的种子一部分用于提取 DNA, 一部分用于发芽试验,
每个处理设 3个重复。
1.3 种子活力指数测定
参照国标 GB5520-1985《粮食、油料检验种子
发芽试验》做发芽试验。以 2层滤纸作为发芽床, 每
份 100 粒种子, 3 次重复, 发芽温度为 20℃, 在第 2
天统计发芽势, 第 7 天统计发芽率并量下胚轴长度,
简易活力指数=发芽率×下胚轴长度。
1.4 DNA提取及甲基化的 MSAP分析
采用 DNA 提取试剂盒(TaKaRa)提取 DNA。主
要参照 Xiong 等[19]的 MSAP 实验程序。分别使用
EcoR I/Hpa II和 EcoR I/Msp I两组限制性内切酶消
化DNA样品, 取 500 ng DNA用 10 U EcoR I和 20 U
第 9期 高桂珍等: 热胁迫过程中白菜型油菜种子 DNA的甲基化 1599


Hpa II或 10 U Msp I在 37℃酶切 12 h, 取酶切片段
用 5 pmol EcoR I接头 50 pmol Hpa II~Msp I接头和
3 U T4 DNA酶在 20℃连接过夜, 取出 65℃灭活 10
min, 并用 ddH2O稀释 10倍作为 PCR扩增的底物。
取 5 μL 酶切-连接产物进行预扩增反应。将所得的
PCR 产物稀释 10~100 倍后再次用于选择性扩增反
应 , 并进行变性凝胶电泳分离和硝酸银染色检测 ,
扩增程序与 AFLP相同(表 1)。

表 1 MSAP所用接头和引物序列
Table 1 Sequences of adaptors and primers for MSAP analysis
引物与接头
Adaptor and primer
EcoR I(E)序列
EcoR I(E) sequence
Hpa II/Msp I (HM)序列
Hpa II/Msp I (HM) sequence
接头 1 Adaptor1 5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′ 5′-GATCATGAGTCCTGCT-3′
接头 2 Adaptor2 3′-CATCTGACGCATGGTTAA-5′ 3′-AGTACTCAGGACGAGC-5′
预扩增引物 Pre-amplification primer 5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′ 5′-CATGAGTCCTGCTCGGT-3′
选择性扩增引物 Selective-amplification primer 5′-GACTGCGTACCAATTCAAC-3′ 5′-CATGAGTCCTGCTCGGTCC-3′
5′-GACTGCGTACCAATTCAAG-3′ 5′-CATGAGTCCTGCTCGGTTC-3′
5′-GACTGCGTACCAATTCACC-3′ 5′-CATGAGTCCTGCTCGGTCT-3′
5′-GACTGCGTACCAATTCACG-3′
5′-GACTGCGTACCAATTCAGA-3′
5′-GACTGCGTACCAATTCATT-3′
5′-GACTGCGTACCAATTCATC-3′

1.5 数据处理
采用Microsoft Excel 2003软件处理平均数等常
规数据和作图, 利用统计软件 SPSS 9.0分析数据差
异显著性和相关性。
2 结果与分析
2.1 不同温度处理后油菜种子活力指数的变化
经过 37℃和 4℃处理 2 h, 种子发芽势、发芽率
和活力指数保持不变, 说明室温和低温的短期处理
不影响油菜种子的活力, 经 70℃热胁迫处理 2 h, 种
子的发芽势、发芽率和活力指数明显下降(表 2)。
庆元本地油菜和绍兴矮大秆油菜种子经 70℃热
胁迫后, 发芽率和活力指数均下降, 庆元本地油菜
经发芽率为 37%, 简易活力指数为 62.9, 比对照发
芽率降低了 60%, 活力指数降低了 69%; 而绍兴矮
大秆油菜发芽率降到 18%, 简易活力指数为 28.8,
比对照发芽率下降了 79%, 活力指数降低了 86%。
37℃热诱导后再进行 70℃热胁迫, 庆元本地油菜发

表 2 不同温度处理对种子发芽势、发芽率和活力指数的影响
Table 2 Effect of different temperature on seed germination potential, germination percentage, and vigor index
品种
Variety
处理
Treatment
发芽势
Germination potential (%)
发芽率
Germination percentage (%)
下胚轴
Hypocotyl length (cm)
活力指数
Vigor index
1 92±0.06 a 97±0.02 a 2.1±0.38 a 203.7
2 93±0.02 a 97±0.02 a 2.1±0.46 a 203.7
3 93±0.05 a 98±0.01 a 2.1±0.22 a 205.8
4 62±0.03 b 67±0.04 b 1.9±0.23 a 127.3
5 28±0.04 c 39±0.07 c 2.1±0.47 a 81.9
庆元本地油菜
Qingyuanbendiyoucai
6 27±0.04 c 37±0.07 c 1.7±0.30 a 62.9


1 94±0.03 a 97±0.02 a 2.1±0.17 a 203.7
2 89±0.04 a 97±0.01 a 2.1±0.27 a 203.7
3 81±0.04 b 95±0.02 a 2.0±0.22 a 190.0
4 25±0.04 c 42±0.07 b 1.8±0.28 a 75.6
5 9±0.02 d 19±0.04 c 1.6±0.41 b 30.4
绍兴矮大秆油菜
Shaoxingaidaganyoucai
6 10±0.02 d 18±0.09 c 1.6±0.21 b 28.8
不同温度处理之间的差异显著性水平用不同的字母表示(P<0.05)。
Values followed by a different letters are significantly different at the 0.05 probability level.
Treatment 1: control; treatment 2: 37℃ 2 h; treatment 3: 4℃ 2 h; treatment 4: 37℃ 2 h+70℃ 2 h; treatment 5: 4℃ 2 h+70℃ 2 h;
treatment 6: 70℃ 2 h.

1600 作 物 学 报 第 37卷

芽率为 67%, 简易活力指数为 127.3, 比对照发芽率
降低了 30%, 活力指数降低了 38%, 绍兴矮大秆油
菜发芽率降到 42%, 简易活力指数为 75.6, 比对照
发芽率降低了 55%, 活力指数降低了 63%。根据差异
显著性分析可以看出, 37℃和 4℃处理后发芽势和发
芽率与对照差异不显著, 与 70℃热胁迫后的差异显
著。在不同的诱导与 70℃热胁迫组合处理中, 处理 4、
5与 6之间, 种子发芽势和发芽率的差异显著, 经过短
时间的 37℃热诱导处理, 可以提高种子耐热能力, 但
4℃冷诱导处理, 对种子耐热能力无明显影响。
2.2 DNA甲基化的 MSAP分析
MSAP的技术基础是同裂酶 Hpa II和 Msp I的
识别序列对甲基化的敏感性不同, 这 2 种酶都能识
别四核苷酸序列 5′-CCGG-3′, 但活性受该序列甲基
化状态的影响。Hpa II 对外部胞嘧啶的甲基化
(m5CCGG)和内部胞嘧啶的甲基化(Cm5CGG)都敏
感, 而Msp I仅对外部胞嘧啶的甲基化敏感, 因此对
酶切片段进行 MSAP分析能够反应酶切位点的甲基
化状态及程度, 将 Hpa II和 Msp I酶切产物的扩增
条带划分为 4种类型, 类型 I, 2条泳道均有带(H/M =
+/+), 无甲基化发生; 类型 II, Hpa II 有带而 Msp I
无带(H/M = +/–), 单链 DNA外部甲基化; 类型 III,
Hpa II无带而 Msp I有带(H/M = –/+), 双链 DNA内
部甲基化; 类型 IV, 2条泳道均无带(H/M = –/–), 双
链 DNA的外部甲基化。
2.2.1 不同温度处理后种子 DNA甲基化水平变化
采用 8 对选择性扩增引物对 2 份经不同温度处
理的白菜型油菜种子进行 MSAP 分析, 并对差异带
进行统计分析, 发现种子经不同温度处理后DNA甲
基化水平发生了变化。

图 1 油菜种子不同温度处理及对照 DNA甲基化水平变化情况
Fig. 1 DNA methylation levels of seeds under different tem-
perature treatments

由图 1 可知, 与对照相比, 庆元本地油菜 70℃
热胁迫后甲基化比例(MSAP% = 总甲基化扩增条
带数/总扩增条带数)下降幅度最大, 为 7.3%, 其次
是 37℃诱导后进行 70℃热胁迫, 甲基化下降幅度为
5.5%, 下降最小的是 4℃诱导处理, 下降了 3.7%。
绍兴矮大秆油菜甲基化比例下降幅度相对较小 ,
37℃和 4℃诱导后 70℃热胁迫处理下降幅度都是
1.8%, 直接 70℃热胁迫后甲基化水平增加了 1.8%。
以上数据说明 70℃热胁迫后种子 DNA 甲基化水平
在不同耐热性品种间存在差异, 耐热品种庆元本地
油菜在热胁迫后甲基化水平下降程度高于不耐热品
种绍兴矮大秆油菜。在 2个材料中, 37℃热诱导处理
下, 甲基化水平均高于对照, 其中庆元本地油菜上
升幅度高于绍兴矮大秆油菜, 这有可能与 37℃热诱
导处理提高种子的耐热性相关。
2.2.2 不同温度处理后种子 DNA甲基化状态变化
DNA 甲基化状态的变化主要表现在甲基化带
型的多态性方面, 多态性指热胁迫过程中 MSAP 带
型发生了改变, 反应出 CCGG 位点的甲基化状态在
热胁迫过程中发生了变化。多态性片段分为 4组: A、
B、C和 D (图 2和表 3), 其中出现频率最高的是 A
组和 B组。A组是指对照种子 DNA中 H和 M泳道
都无带, 或者仅在其中一个泳道有带, 热胁迫后 H
和M泳道中同时有带, 暗示在 CCGG位点发生了完
全的去甲基化。B组是指在对照中由于 CCGG位点
胞嘧啶的完全甲基化而检测不到, 但在热胁迫后由
于甲基化程度的降低而出现在 H或 M泳道中, A和
B组表示热胁迫后发生去甲基化。与此相反, C组和
D 组反映的是热胁迫后甲基化程度升高的状态, 表
示的是热胁迫后与对照相比发生甲基化。庆元本地
油菜热胁迫后发生去甲基化的条带总数是 19, 发生
甲基化的条带为 1; 绍兴矮大秆油菜热胁迫后发生
去甲基化的条带总数为 10, 发生甲基化的条带为 7。
这两份油菜种子在热胁迫过程中同时发生甲基化和
去甲基化现象, 但以去甲基化为主。
图 3和图 4表明, 与对照相比, 不同温度处理过
程中也均发生了甲基化状态的改变, 油菜在 70℃热
胁迫过程中发生去甲基化的条带数最多, 其中庆元
本地油菜有 19条, 而 37℃热诱导去甲基化的条带最
少, 但发生甲基化的条带数较多, 这可能与 37℃热
诱导可以激活相关基因的表达, 与热诱导提高种子
的耐热性可能相关。热胁迫过程中, 耐热性的庆元
本地油菜发生去甲基化的数目多于不耐热型的绍兴
矮大秆油菜, 但发生甲基化的数目则相反, 绍兴矮
大秆油菜的数目多于庆元本地油菜。
第 9期 高桂珍等: 热胁迫过程中白菜型油菜种子 DNA的甲基化 1601



图 2 对照与热胁迫处理之间种子基因组 DNA的甲基化扩增类型
Fig. 2 Patterns of seed DNA methylation between control and heat stress
H1和 M1为对照组的 MSAP带型, H2和 M2泳道为处理组的 MSAP带型。
H1和 H2为 EcoR I/Hpa II酶切, M1和 M2为 EcoR I/Msp I酶切。A、B、C、D所示带型见表 3。
Lanes H1 and M1 are MSAP patterns of control, lanes H2 and M2 are MSAP of heat stress. H1 and H2 represent digestion with EcoR I/Hpa II,
M1 and M2 represent digestion with EcoR I/Msp I. Band patterns of A, B, C, and D can be seen in Table 3.

表 3 高温胁迫下种子 DNA甲基化状态的变化
Table 3 Changes of seed DNA methylation pattern under high temperature stress
对照 Control 高温胁迫 High temperature stress 甲基化状态变化 Changes of methylation status 数目 Number
H1 M1 H2 M2
类型
Type 处理前
Before treatment
处理后
After treatment
0038 0019
– – + + A1 CCGG GGCC CCGG GGCC 5 3
– + + + A2 CCGG GGCC CCGG GGCC 1 0
+ – ＋ + A3 CCGG GGCC CCGG GGCC 0 1
– – – + B1 CCGG GGCC CCGG GGCC 11 6
– – + – B2 CCGG GGCC CCGG GGCC 2 0
+ + – – C1 CCGG GGCC CCGG GGCC 0 3
+ + – + C2 CCGG GGCC CCGG GGCC 1 2
– + – – D1 CCGG GGCC CCGG GGCC 0 1
+ – – – D2 CCGG GGCC CCGG GGCC 0 1
H1和 H2为 EcoR I/Hpa II酶切, M1和 M2为 EcoR I/Msp I酶切。带类型参考图 2; +: 有带, –: 无带。
H1 and H2 represent digestion with EcoR I/Hpa II, M1 and M2 represent digestion with EcoR I/Msp I. Band types are referred to Fig. 2;
+: presence of band; –: absence of band.



图 3 不同温度处理后种子基因组 DNA去甲基化的条带数
Fig. 3 Band number of DNA demethylation in seeds under
different temperature treatments

图 4 不同温度处理后种子基因组 DNA甲基化的条带数
Fig. 4 Band number of DNA methylation in seeds under
different temperature treatments
1602 作 物 学 报 第 37卷

2.3 油菜种子活力指数与甲基化的关系
目前常用来检测种子活力的方法是种子的发
芽试验, 通过种子的发芽势和发芽率可以清楚、可
靠地判断种子的活力情况, 为此, 我们试图分析油
菜种子发芽率下降过程中 DNA 的甲基化情况, 寻
找种子活力与 DNA 甲基化之间的关系。2 份材料
的种子经过不同温度处理后, 发芽势、发芽率以及
活力指数均出现不同幅度的变化 , 从而得到不同
活力的种子 , 以供我们分析种子活力指数与甲基
化的关系。

表 4 油菜种子生活力指标与 DNA甲基化的相关性分析
Table 4 Correlation between seed viability indicators and number of different DNA demethylation bands
甲基化扩增类型带数
Types of amplified bands
Hpa II Msp I
发芽势
Germination potential
(%)
发芽率
Germination percentage
(%)
下胚轴
Hypocotyl length
(cm)
简易活力指数
Vigor index
Type I + + −0.360 −0.328 −0.407 −0.354
Type II + – 0.313 0.270 0.267 0.301
Type III – + −0.843** −0.843** −0.762** −0.857**
Type IV – – 0.702* 0.701* 0.660* 0.715**
** Significant at P<0.01. * Significant at P<0.05.

由表 4可知, 类型 III带型的条带数与发芽率、
发芽势、下胚轴长以及简易活力指数呈负相关, 而
类型 IV带型的条带数与发芽势、发芽率、下胚轴长
以及简易活力指数呈正相关。类型 III表明双链DNA
内部甲基化; 类型 IV表明双链 DNA的外部甲基化,
这两种带型都是发生的双链甲基化, 也即 CCGG 位
点发生全甲基化。由此可知, 发芽势、发芽率、下
胚轴长和活力指数与双链 DNA 内部均发生甲基化
的条带数呈负相关, 而与双链DNA外部均发生甲基
化的条带数呈正相关。
3 讨论
过高的环境温度将对植物造成热胁迫和热损伤,
但在热胁迫前经中等温度短期热驯, 生物可产生耐
热性 , 使植物对后续的高温胁迫适应并存活下
来[20]。周人纲等[21]研究发现, 热锻炼不但使作物品
种之间的耐热性差异能够表现出来, 而且还可提高
作物的耐热性, 这种现象称耐热性获得, 它是作物
适应高温环境的一种能力。马晓娣等[22]对耐热性不
同的小麦品种进行 34℃热锻炼 48 h, 然后进行 49℃
的热胁迫处理, 结果显示, 经热锻炼后的热致死时
间明显长于未经热锻炼的致死时间。
DNA 甲基化是基因组 DNA 的一种主要表观遗
传修饰形式, 是调节基因组功能的重要手段, DNA
甲基化在基因表达调控、外源基因防御、个别基因
表达模式的遗传等途径中起着重要的作用[23]。一些
生物和非生物逆境胁迫也可导致 DNA 甲基化的变
化, 产生表观遗传变异[3]。有研究表明, 环境胁迫会
使植物DNA发生去甲基化的变异, 甲基化的降低可
作用于植物细胞, 调节一些基因表达, 进而防御胁
迫[11,23]。本文研究发现, 种子经热胁迫后甲基化水
平降低, 但 37℃热诱导后甲基化水平增高, 耐热品
种增高的比例显著高于不耐热的品种, 甲基化水平
的变化可能与温度胁迫有关, 但不同的植物对不同
的胁迫反应也不完全一致。Steward等[24]发现低温胁
迫使玉米幼苗DNA甲基化转移酶表达量较少, 这可
能会导致基因组甲基化水平的降低, 于是他进一步
通过高效液相色谱证实了玉米幼苗基因组甲基化水
平在冷胁迫下减少超过 10%[4]。潘雅姣等[25]发现水
分胁迫导致水稻DNA甲基化平均水平明显增加, 其
中根部增加幅度尤为明显。甲基化水平的变化可能
是种子适应热胁迫的机制的一部分, 通过改变染色
体的结构, 调节基因表达, 从而提高种子耐高温的
能力。
在热胁迫下, 与对照相比, 庆元本地油菜发生
去甲基化的比例高于不耐热的绍兴矮大秆油菜, 但
发生甲基化的数目则相反。由此推测, DNA 去甲基
化可能与植物对热胁迫的适应起积极作用, 这可能
是去甲基化与受环境因子调控的许多基因的表达有
关, 从而对热胁迫作出反应, 这与盐胁迫棉花基因
组的结果相一致, 耐盐品种中受盐胁迫诱导发生去
甲基化的位点数目要多于盐敏感品种中的数目[26]。
华扬等[27]通过对 5℃冷处理 48 h 的水稻 9311 叶片
DNA 胞嘧啶甲基化模式分析, 发现冷处理 48 h 后
9311基因组中一些CCGG位点发生了重新甲基化和
去甲基化, 并得到 CIDM7片段在冷胁迫后去甲基化,
Northen杂交证明 CIDM7 在冷胁迫后增强表达。前
人的研究也表明, 在基因的内部和邻近区域发生甲
第 9期 高桂珍等: 热胁迫过程中白菜型油菜种子 DNA的甲基化 1603


基化可以抑制这些基因的表达, 而去甲基化后又可
以激活基因的表达[28]。因此, 去甲基化有可能是某
些基因表达的必要条件, 本研究结果为植物耐热性
研究提供了新的课题和方向, 如关于哪些基因在热
胁迫过程中发生去甲基化并导致植物的耐热性提高
值得深入研究。
4 结论
油菜种子经热胁迫后发芽势、发芽率和活力指
数均下降, 耐热品种庆元本地油菜下降幅度小于不
耐热品种绍兴矮大秆油菜, 37℃热诱导可明显提高
耐热种子耐高温的能力。种子经热胁迫后 DNA甲基
化水平下降, 状态也发生了改变。热胁迫过程中同
时发生甲基化和去甲基化, 但以去甲基化为主, 耐
热品种庆元本地油菜发生去甲基化的数目要多于不
耐热品种绍兴矮大秆油菜, 但发生甲基化的数目则
绍兴矮大秆油菜多于庆元本地油菜, 以此适应和提
高热耐热能力。发芽势、发芽率、下胚轴长和活力
指数与双链 DNA 内部发生甲基化的条带数呈负相
关, 而与双链DNA外部发生甲基化的条带数呈正相
关。
References
[1] Rassoulzadegan M, Grandjean V, Gounon P, Vincent S, Gillot I,
Cuzin F. RNA-mediated non-mendelian inheritance of an epige-
netic change in the mouse. Nature, 2006, 441: 469−474
[2] Chan S W L, Henderson I R, Jacobsen S E. Gardening the ge-
nome: DNA methylation in Arabidopsis thaliana. Nat Rev Genet,
2005, 6: 351−360
[3] Grant-Downton R T, Dickinson H G. Epigenetic and its implica-
tion for plant biology: 2. The ‘epigenetic Epiphang’: epigenetics,
evolution and beyond. Annal Bot, 2006, 97: 11−27
[4] Steward N, Ito M, Yamaguchi Y, Koizumi N, Sano H. Periodic
DNA methylation in maize nucleosomes and demethylation by
environmental stress. J Biol Chem, 2002, 277: 37741−37746
[5] Li X-L(李雪林), Lin Z-X(林忠旭), Nie Y-C(聂以春), Guo
X-P(郭小平), Zhang X-L(张献龙). MSAP analysis of epigenetic
changes in cotton (Gossypium hirsutum L.) under salt stress. Acta
Agron Sin (作物学报), 2009, 35(4): 588−596 (in Chinese with
English abstract)
[6] Zhong L(钟兰), Wang J-B(王建波). The role of DNA hyper-
methylation in salt resistance of Triticum aestivum L. J Wuhan
Bot Res (武汉植物学研究), 2007, 25(1): 102−104 (in Chinese
with English abstract)
[7] Choi C S, Sano H. Abiotic-stress induces demethylation and
transcriptional activation of a gene encoding a glycerophos-
phodiesterase-like protein in tobacco plants. Mol Genet Geno-
mics, 2007, 277: 589−600
[8] Hashida S N, Kitamura K, Mikami T, Kishima Y. Temperature
shift coordinately changes the activity and the methylation state
of transposon Tam3 in Antirrhinum majus. Plant Physiol, 2003,
132: 1207−1216
[9] Labra M, Ghiani A, Citterio S, Sgorbatis S, Sala F, Vannini C,
Ruffini-Castiglione M, Bracale M. Analysis of cytosine methyla-
tion pattern in response to water deficit in pea root tips. Plant
Biol, 2002, 4: 694−699
[10] Dyachenko O V, Zakharchenko N S, Shevchuk T V, Bohnert H J,
Cushman J C, Buryanov Y L. Effect of hypermethylation of
CCWGG sequences in DNA of Mesembryanthemum crystal-
linum plants on their adaptation to salt stress. Biochemistry, 2006,
71: 461−465
[11] Wada Y, Miyamoto K, Kusano T, Sano H. Association between
up-regulation of stress-responsive genes and hypomethylation of
genomic DNA in tobacco plants. Mol Genet Genom, 2004, 271:
658−666
[12] Gao G-Z(高桂珍), Wu X-M(伍晓明), Lü X-D(吕晓丹), Chen
B-Y(陈碧云), Xu K(许鲲), Yan G-X(闫贵欣). Genotype differ-
ences of seed viability in rapeseed during storage at different
temperature. Chin J Oil Crop Sci (中国油料作物学报), 2010,
32(4): 495−499 (in Chinese with English abstract)
[13] Reyna-Lopez G E, Simpson J, Ruiz-Herrera J. Differences in
DNA methylation patterns are detectable during the dimorphic
transition of fungi by amplification of restriction polymorphisms.
Mol Gen Genet, 1997, 253: 703−710
[14] Madlung A, Masuelli R W, Watson B, Reynolds S H, Davison J,
Comai L. Remodeling of DNA methylation and phenotypic and
transcriptional changes in synthetic Arabidopsis allotetraploids.
Plant Physiol, 2002, 29: 733−746
[15] Portis E, Acquadro A, Comino C, Lanteri S. Analysis of DNA
methylation during germination of pepper (Capsicum annuum L.)
seeds using methlation-sensitive amplification polymorohism
(MSAP). Plant Sci, 2004, 166: 169−178
[16] Sha A H, Lin X H, Huang J B, Zhang D P. Analysis of DNA me-
thylation related to rice adult plant resistance to bacterial blight
based on methylation-sensitive AFLP (MSAP) analysis. Mol
Genet Genom, 2005, 273: 484−490
[17] Lu G Y, Wu X M, Chen B Y, Gao G Z, Xu K. Evaluation of ge-
netic and epigenetic modification in rapeseed (Brassica napus)
induced by salt stress. J Integr Plant Biol, 2007, 49: 1599−1607
1604 作 物 学 报 第 37卷

[18] Shaked H, Kashkush K, Ozkan H, Feldman M, Levy A A. Se-
quence elimination and cytosine methylation are rapid and re-
producible responses of the genome to wide hybridization and
allopolyploidy in wheat. Plant Cell, 2001, 13: 1749−1759
[19] Xiong L Z, Xu C G, Saghai M A, Zhang Q. patterns of cytosine
methylation in an elite rice hybrid and its parental lines, detected
by a methylation-sensitive amplification polymorphism tech-
nique. Mol Gen Genet, 1999, 261: 439−446
[20] Larkindale J, Hall J D, Knight M R, Vierling E. Heat stress phe-
notypes of Arabidopsis mutants implicate multiple signaling
pathways in the acquisition of thermo-tolerance. Plant Physiol,
2005, 138: 882−897
[21] Zhou R-G(周人纲), Fan Z-H(樊志和), Li X-Z(李晓芝), Wang
Z-W(王占武), Han W(韩炜). The effect of heat acclimation on
membrane thermo-stability and relative enzyme activity. Acta
Agron Sin (作物学报), 1995, 21(5): 568−572 (in Chinese with
English abstract)
[22] Ma X-D(马晓娣), Wang L(王丽), Jiang M(江矛), Peng H-R(彭
惠茹). Difference in relative conductivity and ultra structure of
leaf between two wheat cultivars with different thermo-tolerance
under heat acclimation and heat stress. J China Agric Univ (中国
农业大学学报), 2003, 8(3): 4−8 (in Chinese with English ab-
stract)
[23] Long L K, Lin X Y, Zhai J Z, Kou H P, Yang W, Liu B. Heritable
alteration in DNA methylation pattern occurred specifically at
mobile elements in rice plants following hydrostatic pressuriza-
tion. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 340: 369−376
[24] Steward N, Kusano T, Sano H. Expression of ZmMET1, a gene
encoding a DNA methyltransferase from maize, is associated not
only with DNA replication in actively proliferating cells, but also
with altered DNA methylation status in cold-stressed quiescent
cells. Nucl Acids Res, 2000, 28: 3250−3259
[25] Pan Y-J(潘雅姣), Fu B-Y(傅彬英), Wang D(王迪), Zhu L-H(朱
苓华), Li Z-K(黎志康). Spatial and temporal profiling of DNA
methylation induced by drought stress in rice. Sci Agric Sin (中国
农业科学), 2009, 42(9): 3009−3018 (in Chinese with English
abstract)
[26] Zhao Y-L(赵云雷), Ye W-W(叶武威), Wang J-J(王俊娟), Fan
B-X(樊保香). Analysis of DNA cytosine methylation on cotton
under salt stress. Cotton Science Society of China, 2008
[27] Hua Y(华扬), Chen X-F(陈学峰), Xiong J-H(熊建华), Zhang
Y-P(张义平), Zhu Y-G(朱英国). Isolation and analysis of differ-
entially-methylated fragment CIDM7 in rice induced by cold
stress. Hereditas (遗传), 2005, 27(4): 595−600 (in Chinese with
English abstract)
[28] Grunau C, Renault E, Rosenthal A, Roizes G. MethDB—a public
database for DNA methylation data. Nucl Acid Res, 2001, 29:
270−274



欢迎订阅 2012年《作物杂志》
《作物杂志》是中国作物学会和中国农业科学院作物科学研究所主办的农作物实用性技术类期刊，1985
年创刊。刊登具有创新性、实用性强的有关农作物的文章；快速报道农业新技术和新成果。栏目设置有专
家论坛、专题综述、研究报告、种子科技与管理、栽培技术、植物保护等。读者对象为农业科研人员、农业
院校师生、农业技术推广工作者，种植业专业户、农业经营人员，农业示范园区、农场等有关人员。
本刊信息量大、时效性强；影响面广。曾荣获第三届、第四届、第五届全国优秀农业科技期刊奖、中
国科协优秀科技期刊奖。连续入选全国中文核心期刊、中国科技核心期刊和中国农业核心期刊，2005 年进
入国家精品期刊库。
本刊为双月刊，大 16开本，每期 152页，定价 15元，全年 90元，全国各地邮局均可订阅，漏订者请
寄款至编辑部。
地址：北京中关村南大街 12号中国农科院作物所内，收款人：作物杂志编辑部，邮编：100081
本刊已正式开通网上在线投稿系统，在线投稿地址: http://www.zwzz.cb.cnki.net
电话：(010)82108790 E-mail: zwzz304@mail.caas.net.cn
ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ ˆˇˆ ˇˆˇ