全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(6): 1050−1054 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(30770145, 30771314)和曲阜师范大学科研基金项目(XJ0706)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 邓晓建, E-mail: xjdeng2006@yahoo.com.cn
第一作者联系方式: 李秀兰, E-mail: lxljewel@163.com
Received(收稿日期): 2010-01-06; Accepted(接受日期): 2010-03-01.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01050
一个新的水稻黄绿叶突变体的遗传分析与基因定位
李秀兰 1,2 孙小秋 2 王平荣 2 周 慧 2 邓晓建 2,3,*
1 曲阜师范大学生命科学学院, 山东曲阜 273165; 2 四川农业大学水稻研究所, 四川成都 611130; 3 四川农业大学西南作物基因资源与
遗传改良教育部重点实验室, 四川成都 611130
摘 要: 通过化学诱变获得一份稳定遗传的水稻黄绿叶突变体 D83。该突变体苗期植株呈黄绿色, 分蘖期开始逐渐
转为淡绿色。与野生型相比, 突变体苗期叶绿素 a、叶绿素 b和类胡萝卜素含量分别下降 45.03%、53.93%和 39.56%,
成熟期每穗着粒数减少 9.45%, 千粒重下降 10.76%。对 D83 与正常绿色品种杂交 F1、F2代的遗传分析表明, D83的
突变性状由一对隐性核基因控制。以 D83/浙福 802 F2代作定位群体, 应用分子标记将 D83所携带的突变基因定位于
水稻第 2染色体短臂的 SSR标记 RM110附近, InDel标记 Ch2-27和 Ch2-32之间, 该基因与这 2个 InDel标记的遗传
距离分别为 1.2 cM和 2.3 cM。认为 D83所携带的突变基因是一个新的水稻黄绿叶突变基因, 暂命名为 chl13(t)。
关键词: 水稻; 黄绿叶突变体; 遗传分析; 基因定位
Genetic Analysis and Gene Mapping of a Novel Yellow-Green Leaf Mutant in
Rice
LI Xiu-Lan1,2, SUN Xiao-Qiu2, WANG Ping-Rong2, ZHOU Hui2, and DENG Xiao-Jian2,3,*
1 College of Life Science, Qufu Normal University, Qufu 273165, China; 2 Rice Research Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130,
China; 3 Key Laboratory of Southwest Crop Genetic Resources and Improvement, Ministry of Education, Sichuan Agricultural University, Chengdu
611130, China
Abstract: An inherited stably yellow-green leaf mutant D83 was isolated by chemistry mutagenesis. Its whole plant exhibited yel-
low-green trait at the seedling stage, and gradually changed into pea green from the tillering stage. Compared with its wild-type par-
ent 10079, at the seedling stage, the contents of chlorophyll a, chlorophyll b, and carotenoid decreased by 45.03%, 53.93%, and
39.56%, at the maturation period, the number of spikelets per panicle reduced by 9.45%, the 1000-grain weight decreased by 10.76%,
respectively. Genetic analysis of F1 and F2 generations of D83 crossed with green rice varieties showed that the yellow-green leaf
trait was controlled by one pair of recessive nuclear genes. Genetic mapping of the mutant gene was conducted by using molecular
marker and F2 mapping population of D83/Zhefu802. The results suggested that the mutant gene of D83 was mapped on the short
arm of rice chromosome 2, nearby SSR marker RM110, between InDel markers Ch2-27 and Ch2-32. The genetic distances from the
target gene to two InDel markers were 1.2 cM and 2.3 cM, respectively. The mutant gene of D83 was considered to be a new yel-
low-green leaf gene in rice and designated tentatively as chl13(t).
Keywords: Oryza sativa L.; Yellow-green leaf mutant; Genetic analysis; Gene mapping
叶绿素缺乏突变在植物界较为常见, 突变基因往往
直接或间接影响叶绿素的生物合成或降解, 叶绿素含量
不同程度下降, 叶色出现黄化、白化、苍绿色、斑马纹、
条纹等不同症状。已从玉米[1]、豌豆[2]、烟草[3]、大豆[4]、
大麦[5]、拟南芥[6]和水稻[7]等作物中获得了叶绿素缺乏突
变体。近年来, 大量研究结果显示叶绿素缺乏突变体是植
物光合作用机制、叶绿素生物合成途径、叶绿体的结构功
能和遗传发育调控机理、作物标记性状等研究的理想材
料[8-9]。因此, 发掘和鉴定植物叶绿素缺乏突变基因, 开展
叶绿素缺乏突变基因的定位、克隆以及作用机理等方面的
研究具有重要的理论意义和应用价值。
水稻的叶绿素缺乏突变一般受隐性核基因控制, 而
由显性基因或细胞质基因控制的报道相对较少[10-11]。水
稻叶绿素缺乏突变类型丰富, 除第 12 染色体外, 在其他
染色体上均发现了叶绿素缺乏突变基因(http://www.gra-
mene.org/newsletters/rice-genetics/rgn12/v12p93.html)。目
前, 利用分子标记定位了 10 多个水稻叶绿素缺乏突变基
因, 其中 6个已被克隆, 它们参与叶绿素的生物合成[7,12-14]。
第 6期 李秀兰等: 一个新的水稻黄绿叶突变体的遗传分析与基因定位 1051
我们通过 EMS 诱变获得一份黄绿叶突变体 D83, 该突变
体表现叶绿素缺乏特征, 本文对其形态生理特征、主要农
艺性状等进行了观察和分析, 并利用分子标记对其突变
基因进行定位, 以期为该基因的克隆及作用机理的研究
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料和田间试验
10079 是来自粳稻品种日本晴(Nipponbare)的一个迟
熟突变品系, 由中科院遗传与发育生物学研究所储成才
研究员和方军博士提供。用化学诱变剂 EMS 处理 10079
获得一份黄绿叶突变体 , 经多代自交 , 其黄绿叶性状已
稳定遗传, 暂定名为“D83”。将 D83分别与正常绿色的野
生型亲本 10079及籼稻品种浙福 802、9311等杂交, 在四
川成都分别播种亲本、F1 及 F2 代, 从苗期开始观察叶色
表现, 成熟期调查主要农艺性状。
1.2 光合色素含量的测定
参照 Arnon 等[15]的方法测定光合色素含量。苗期取
D83突变株及其野生型亲本 10079相同部位的叶片, 称取
2 g, 剪成 2~3 mm细丝, 在 4℃、避光条件下用 80%丙酮
浸提 48 h, 然后用日立 UV-1700 型分光光度计进行叶绿
素、类胡萝卜素含量的测定。
1.3 定位群体的构建和总 DNA的提取
根据叶色调查与分析结果, 从 D83/浙福 802的 F2代
中选取 30株显性正常绿苗和 158株黄化苗构成定位群体,
分单株取叶片提取总 DNA。在此基础上随机选取正常绿
苗和黄化苗各 10 株, 每单株取等量叶片, 将正常绿苗和
黄化苗单株叶片分别混合, 提取总 DNA 作为绿苗和黄化
苗近等基因池。参照 McCouch等[16]的方法提取总 DNA。
1.4 分子标记分析和遗传图谱的构建
根据 McCouch 等[17]构建的 SSR 连锁图(http://www.
gramene.org/microsat/)获得简单序列重复 (SSR)标记 , 运
用 Primer5.0 软件自行设计插入缺失(InDel)标记。由上海
英骏生物技术有限公司合成 SSR 和 InDel 引物。参照
Panaud 等[18]的 PCR 反应体系, 扩增产物经 3.0%~3.5%琼
脂糖凝胶电泳及溴化乙锭染色后在紫外灯下观察拍照。根
据定位群体叶色和标记的分离数据, 用 MAPMAKER3.0
软件进行遗传作图, 用 Kosambi 函数将重组率转化为遗
传距离(cM)。
2 结果与分析
2.1 突变体的形态特征及主要农艺性状表现
D83 突变体植株苗期为黄绿色, 可明显地区别于其
野生型 , 从分蘖期开始逐渐转为淡绿色 , 但仍可与其野
生型明显区分(图 1)。与其野生型相比, 成熟期 D83 的株
高降低 6.47%, 每穗着粒数减少 9.45%, 千粒重下降
10.76%, 穗长、有效穗数、结实率等农艺性状差异不显著
(表 1)。
图 1 突变体 D83(右)与其野生型亲本 10079(左)在苗期(A)、拔节期(B)及抽穗期(C)的植株形态
Fig. 1 Plant phenotype of mutant D83 (right) and its wild-type parent 10079 (left) at the seedling (A), elongation (B), and heading (C) stages
表 1 突变体 D83与其野生型亲本 10079主要农艺性状的比较
Table 1 Comparison of primary agronomic traits between mutant
D83 and its wild-type parent 10079
性状
Trait
10079 (CK) D83
比对照增减
Compared
with CK (%)
抽穗期 Days to heading (d) 125.1±2.62 127.2±2.50 1.68
株高 Plant height (cm) 106.6±2.31 99.7±3.48 −6.47*
穗长 Panicle length (cm) 19.9±1.17 18.9±0.57 −5.03
单株有效穗数 No. of produc-
tive panicles per plant
10.8±2.81 10.2±1.87 −5.56
每穗着粒数 No. of spikelets
per panicle
95.2±2.06 86.2±3.10 −9.45*
结实率 Seed setting rate (%) 91.7±1.49 88.6±2.09 −3.38
千粒重 1000-grain weight (g) 25.1±1.77 22.4±2.31 −10.76*
* 在 P = 0.05水平上差异显著。
* significantly different at P = 0.05.
2.2 突变体的光合色素
D83 突变体在苗期时黄绿叶特征十分明显, 表 2 表
明, 苗期 D83叶绿素 a、叶绿素 b及类胡萝卜素含量分别
为 1.77 mg g−1、0.41 mg g−1和 0.55 mg g−1, 较对照 10079
分别下降 45.03%、53.93%和 39.56%, 差异极显著(P<0.01),
表明 D83 的突变性状主要是由叶绿素含量下降引起的。
同时, D83 叶绿素 a/b 值较 10079 提高了 0.66, 说明 D83
突变体叶绿素 b的降幅大于叶绿素 a, 叶绿素 b可能在突
变体的叶片黄化性状表现中起更重要的作用。
2.3 突变性状的遗传分析
D83 分别与正常绿色的野生型亲本 10079 及籼稻品
种浙福 802、9311杂交 F1代的叶色均表现为正常绿色, F2
代植株可区分为叶色差异明显的正常绿苗和黄化苗两组,
经卡方(χ2)测验, 其分离比例均符合 3∶1 (表 3), 表明 D83
1052 作 物 学 报 第 36卷
表 2 苗期 D83与其野生型亲本 10079叶片光合色素含量的比较
Table 2 Comparison of photosynthetic pigment contents between mutant D83 and its wild-type parent 10079 at the seedling stage
光合色素
Pigment
叶绿素
Chl (mg g−1)
叶绿素 a
Chl a (mg g−1)
叶绿素 b
Chl b (mg g−1)
叶绿素 a/b
Chl a/b
类胡萝卜素
Caro (mg g−1)
10079 (CK) 4.11±1.30 3.22±0.72 0.89±0.58 3.63±0.94 0.91±1.02
D83 2.18±1.04 1.77±0.42 0.41±0.60 4.29±0.82 0.55±0.76
比对照增减 Compared with CK −46.96%** −45.03%** −53.93%** 0.66** −39.56%**
**在 P = 0.01水平上差异显著。** significantly different at P = 0.01.
表 3 突变体 D83与正常绿色品种杂交 F2代的叶色分离
Table 3 Segregation of leaf color in F2 population of the crosses between D83 and green rice varieties
F2组合
F2 combination
总株数
Total No. of plants
绿苗株数
No. of green plants
黄化苗株数
No. of etiolation plants
理论比
Expect ratio
χ2 P
D83/10079 560 426 134 3:1 0.24 0.50–0.75
D83/浙福 802 D83/ Zhefu 802 690 532 158 3:1 1.63 0.10–0.25
D83/9311 544 426 118 3:1 3.18 0.05–0.10
的突变性状由 1对隐性核基因控制。
2.4 突变基因的分子标记定位
以 D83/浙福 802 的 F2群体作为定位群体, 用 240 对
较均匀分布于水稻 12 条染色体上的微卫星引物扩增亲本
浙福 802和D83的DNA, 然后用在两亲本间表现出多态的
引物扩增绿苗和黄化苗近等基因池, 再用在池中检测到多
态的引物扩增 F2群体, 结果发现位于水稻第 2染色体上的
微卫星标记 RM110、RM423 与 D83 所携带的突变基因有
连锁关系。为了进一步定位目标位点, 新开发了 3 个具有
亲本多态性的插入/缺失(InDel)标记 Ch2-27、Ch2-32 和
Ch2-41 (表 4)。用这 3个 InDel标记对 F2定位群体进行扩
增, 结果表明它们也与 D83所携带的突变基因连锁(图 2)。
根据 F2定位群体的叶色和微卫星标记的分离数据构
建局部分子连锁图(图 3), 可知 D83 所携带的突变基因位
于水稻第 2 染色体短臂 RM110、Ch2-27 和 Ch2-32、
Ch2-41、RM423之间, 与它们的遗传距离分别为 9.0、1.2、
2.3、11.9和 12.8 cM。因该基因可能是一个新的水稻黄绿
叶突变基因, 暂命名为 chl13(t)。
表 4 本研究开发的多态性 InDel标记
Table 4 Polymorphic InDel markers developed in this study
标记
Marker
正向引物
Forward primer (5–3)
反向引物
Reverse primer (5–3)
所在 BAC
Originated BAC
Ch2-27 CCTTGGAGGTAAAGCATC GGGACGGAGGGAGTAGTT AP005412
Ch2-32 CCAGGCAAGCAAGCAACC GCTGATGAACGCCGTGAAG AP004843
Ch2-41 TTAGGGAGTTAGGGTGCG TGAACTATGGAGCCGTGT AP003992
图 2 InDel标记 Ch2-32在 D83/浙福 802 F2群体中的分离
Fig. 2 Segregation of InDel marker Ch2-32 in the F2 population of D83/Zhefu 802
M: DL-2000 marker; P1: 浙福 802; P2: D83; 1~10: F2黄化植株; 11~20: F2绿色植株。
P1: Zhefu802; P2: D83; 1–10: yellow-green plants in F2; 11–20: green plants in F2.
3 讨论
迄今, 国内外报道了位于水稻第 1~11染色体上的 80
多个叶绿素缺乏突变基因(http://www.gramene.org/news-
letters/rice-genetics/rgn12/v12p93.html)。目前, 在水稻第 2
染色体定位了 3个叶绿素缺乏突变基因(http://www.gram-
ne.org/rice_ mutant), 即 z11、z12和 chl10, 其中 z11和 z12
为水稻“斑马叶”的控制基因, 突变体性状主要表现为叶
片及叶鞘部位出现有规律的褪绿横带, 整个叶片呈现淡
绿、绿相间条段; chl10 为控制水稻黄化的叶绿素缺乏突
第 6期 李秀兰等: 一个新的水稻黄绿叶突变体的遗传分析与基因定位 1053
图 3 黄绿叶基因 chl13(t)在水稻第 2染色体短臂上的分子连锁图
Fig. 3 Linkage map of a yellow-green leaf gene, chl13(t), on the
short arm of rice chromosome 2
变基因, 位于第 2 染色体长臂 142 cM 处, 突变体全生育
期叶片呈黄色。我们获得的 D83 突变体植株苗期为黄绿
色, 从分蘖期开始逐渐转为淡绿色, 并伴有株高变矮、每
穗着粒数减少、千粒重下降等特征, 且分子标记分析表明
D83 所携带的突变基因位于水稻第 2 染色体短臂的 SSR
标记 RM110附近, InDel标记 Ch2-27和 Ch2-32之间。因
此, 认为 D83 所携带的突变基因是一个新的水稻黄绿叶
突变基因, 暂命名为 chl13(t)。
在水稻叶绿素缺乏突变体中, 叶绿素 b 显著减少突
变最为常见, 已通过自然突变或诱变途径获得大量水稻
叶绿素 b减少突变体[19-21]。Terao等[19]按照叶绿素 a/b值
将水稻叶绿素缺乏突变体划分为 3类, 即不含叶绿素 b或
叶绿素 a/b值接近或超过 20的突变体、叶绿素 a/b值介于
10.0~15.6的突变体及叶绿素 a/b值介于 6~10的突变体。
本研究中 D83突变体叶绿素 a/b值为 4.29, 与 Hsu等[20]、
龚红兵等[21]发现的水稻叶绿素 b减少突变体的叶绿素 a/b
值 4.9、4.5较接近, 可能属于同一类突变体。
叶色标记的应用可作为提高杂交水稻特别是两系杂
交水稻的种子纯度的途径之一, 防范可能给大田生产造
成的损失, 因而愈来愈受关注。舒庆尧等[24]认为, 作为叶
色标记必须具备以下 4 个条件: (1) 标记性状明显, 幼苗
易鉴别; (2) 标记性状稳定, 不易受环境因素影响; (3) 标
记性状对杂交种或不育系的产量无显著负效应; (4) 标记
性状受隐性核基因控制。在迄今发现的水稻叶绿素缺乏突
变体中, 绝大多数由于农艺性状欠佳而不能应用于生产,
通过导入叶色标记仅育成 3个水稻不育系, 即 M2S[9]、全
龙 A[22]和中紫 S[23]。本研究中 D83 的突变性状由 1 对隐
性核基因控制, 幼苗为黄绿色, 易与正常绿苗区分, 且不
受环境影响, 同时, 与其野生型相比, 抽穗期、穗长、有
效穗、结实率等主要农艺性状差别不显著, 株高、每穗着
粒数、千粒重等农艺性状虽差异显著(0.01
携带的 chl13(t)突变基因在提高杂交水稻种子纯度上具有
较好的应用前景。
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