全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(10): 17861790 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2009AA10AA03)和国家自然科学基金项目(30871538)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 汤继华, E-mail: tangjihua1@163.com, Tel: 0371-63558127
第一作者联系方式: E-mail: wuxin1658@163.com, Tel: 0378-3162244
Received(收稿日期): 2010-01-02; Accepted(接受日期): 2010-05-23.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01786
玉米花丝活力的遗传分析
吴 欣 1,2 崔子田 1 胡彦民 1 刘宗华 1 李绍伟 2 王建文 2 汤继华 1,*
1 河南农业大学农学院, 河南郑州 450002; 2开封市农林科学研究院, 河南开封 475004
摘 要: 花丝活力长短在一定程度上影响着玉米制种产量和杂交种产量, 对玉米生产具有重要意义。为阐明玉米花
丝活力的遗传机理, 本研究利用来自优良玉米杂交种农大 108的一套 203个重组近交系群体, 通过 1年 3点的田间试
验对玉米花丝活力进行了遗传分析, 结果发现同一基因型的花丝活力在不同环境中存在较大的差异。利用复合区间
作图法定位了 8个不同位点的 QTL, 分布在玉米第 3、第 5、第 6、第 7和第 8染色体上, 单个 QTL可解释花丝活力
表型变异的 11.06%~20.82%, 该研究为玉米花丝活力的选择提供了一定的理论依据。
关键词: 玉米; 花丝活力; QTL; 分析
Genetic Analyses of Silk Vigor in Maize
WU Xin1,2, CUI Zi-Tian1, HU Yan-Min1, LIU Zong-Hua1, LI Shao-Wei2, WANG Jian-Wen2, and TANG
Ji-Hua1,*
1 College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2 Institute of Food Crops, Kaifeng Academy of Agricultural and
Forestry Sciences, Kaifeng 475004, China
Abstract: Silk vigor is an important trait that effects hybrid seed production and hybrid production in maize. For dissecting the ge-
netic basis of silk vigor, a set of 203 recombinant inbred lines (RIL) population, which derived from the elite hybrid Nongda 108
(Huang C × Xu 178), were evaluated at three environments. The results showed that silk vigor of genotype had significant distinct at
different environments. Eight different QTL were detected for silk vigor using composite interval mapping method, and located on
chromosomes 3, 5, 6, 7, and 8, with 11.06%–20.82% phenotypic contribution of silk vigor, this study can aid to seed vigor selection
in maize breeding.
Keywords: Maize; Silk vigor; QTL; Analysis
花丝活力是指玉米花丝在吐出后一定时间内接受花
粉并能受精结实的能力[1]。在玉米开花散粉期, 如果遇到
阴雨寡照或高温干旱等不良气候的影响, 花丝活力短的
杂交种往往不能正常接受花粉而受精造成玉米果穗结实
不良, 在一定程度上影响玉米产量。此外, 在玉米杂交种
子生产过程中, 由于父母本生育期往往存在一定的差异,
常利用错期播种或其他人工调控的方法使父母本花期相
遇, 按照制种过程中一般的“母等父”原则, 母本的花丝活
力长, 接受花粉的时间长, 结实率高, 对保证制种产量具
有重要作用[2-4]。
鉴于玉米花丝在种子生产过程中的重要作用, 前人
曾利用不同遗传背景的玉米自交系或杂交种对花丝活力
进行了大量研究, 发现花丝活力的长短受空气湿度、温
度、土壤水分含量等多种因素的影响, 不良环境条件如高
温、干旱等逆境胁迫可以明显的降低花丝活力 [5-10]。
Anderson等[11]研究发现玉米籽粒结实性的降低与花丝吐
丝后的时间和花丝活力强弱有直接关系, 在花丝吐出后
第 8 和第 10 天授粉时结实率快速下降; 在控制授粉时间
的情况下花丝生长速率和花丝活力的遗传变异可以引起
籽粒结实性的变化。Bassetti 和 Westgate[12-13]描述了玉米
吐丝和花丝活力的动态变化与基因型有关, 不同基因型
之间存在明显的差异。
尽管在杂交种生产过程中, 玉米花丝活力的长短在
正常气候条件下对产量不会造成很大的影响, 而在杂交
种子生产过程中具有花丝活力长的自交系, 对保证制种
产量, 回避田间不良气候条件下对花丝活力的影响具有
重要作用[3]。前人对玉米花丝活力的研究主要集中在不同
环境条件的影响方面, 并证实了不同基因型之间花丝活
力存在一定的差异, 但是截至目前还没有关于玉米花丝
活力遗传机理的研究报道。本研究以优良玉米杂交种农大
108的一套重组近交系群体为基础材料, 通过 1年 3点田
间试验对玉米花丝活力进行了遗传分析, 以期为玉米育
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种和大田生产提供一定的参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用我国生产上曾经推广面积最大的优良玉米杂交
种农大 108 (黄 C×许 178)为基础材料, 通过“单粒传”的方
法构建了一套包含 203个家系的 F7代重组自交系群体。
1.2 花丝活力的田间鉴定
2005年夏播在河南农业大学科教园区(河南郑州)分
别种植农大 108的 2个亲本黄 C和许 178, 并在吐丝后 5、
7和 8 d采用饱和授粉的方式对 2个亲本花丝活力进行了
测定。
重组近交系的田间鉴定试验于 2006年夏分别在南阳
地区农业科学研究所(河南南阳)、河南农业大学科教园区
(河南郑州)和浚县农业科学研究所(河南浚县)进行, 播种
日期分别 6月 5日、6月 10日和 6月 12日。采用随机区
组设计, 2次重复, 单行区, 行长 4 m, 行距 0.67 m, 株距
0.27 m, 每行 15株, 密度 56 250株 hm2。
在玉米花丝吐出前每行选连续 10株用雌穗袋将果穗
套上, 为保证试验的准确性, 每个单株只保留一个雌穗,
单株记载每一株的吐丝日期, 在花丝吐出后第 8天进行人
工饱和授粉 , 以保证每个花丝均有授精结实的机会 , 收
获后统计每穗的结实数。花丝活力用吐丝后第 8天的结实
率表示, 结实率(%)=(单穗结实数/穗行数×每行应结籽粒
数)×100。
1.3 遗传连锁图的构建及 QTL分析
在 2006年初, 室内种植亲本黄 C和许 178及重组自
交系群体, 在 5~6叶时采用改良的 SDS方法提取 DNA。
利用来源于玉米数据库(http://www.maizegdb.org/)的 862
对 SSR 引物对双亲多态性进行了筛选, 选用其中 256 对
双亲间存在多态性的标记对群体的基因型进行了分析 ,
利用 Mapmaker/Exp Version3.0b构建遗传连锁图[14]。目标
性状的 QTL 分析采用 WinQTLCart2.5[15]复合区间作图法
(Composite Interval Mapping, CIM)[16], 在 0.05显著水平
上通过 1 000 次排列测验(permutation test)给定每一性状
的显著性阈值(LOD 值), 超过给定 LOD 值即认为存在一
个 QTL[17]。
2 结果与分析
2.1 亲本花丝活力的表现
2005年夏在郑州点对黄 C和许 178分别在吐丝后的
5、7和 8 d进行饱和授粉, 调查不同授粉时期的结实率。
试验结果表明, 黄 C在吐丝后 5 d的授粉结实率为 20.24%,
7 d的结实率降到 7.13%, 8 d的结实率仅为 3.47%。许 178
在吐丝后第 5天的授粉结实率接近 30%, 7 d的结实率降
到 11.01%, 第 8 天时结实率只有 2.36%。Bassetti 和
Westgate[13]的研究结果同样证明了玉米在吐丝后第 8 天
开始丧失活力。因此选择花丝吐出后第 8天作为重组近交
系群体花丝活力的评价时期。
2.2 RIL群体花丝活力的田间表现
2006 年夏分别在郑州、南阳和浚县对 203 个重组近
交系群体的花丝活力进行了测定 , 方差分析结果表明 ,
花丝活力在 3个试点间存在极显著差异, 而且不同基因型
之间也表现出极显著的差异(表 1), 说明玉米花丝活力非
常容易受到环境条件的影响。

表 1 玉米花丝活力的联合方差分析表
Table 1 Combined variance analysis of silk vigor in three Sites
变异来源
Variance
SS df MS F
地点 Site 1.17 2 0.59 37.84**
基因型 Genotype 5.48 141 0.04 2.51**
地点×基因型 Site × genotype 3.30 177 0.02 1.21
**表示达到 0.01显著水平。** Significant at P<0.01.

从表 2可以看出, 尽管两个亲本和杂交种在 3个地点
间的花丝活力存在一定的差异, 但花丝活力的趋势非常
一致, 即许 178在各试点的花丝活力均高于黄 C, 而杂交
种农大 108的花丝活力较高, 说明花丝活力同其他性状一
样具有较强的杂种优势。比较 2005和 2006年郑州点黄 C
和许 178花丝活力的表现, 同样可以看出同一自交系在不
同年份间花丝活力仍然存在较大的差异, 进一步证实了
花丝活力非常容易受到环境条件的影响。
RIL 群体的花丝活力在 3 个试点间均表现出连续变
异 , 但变异范围在不同地点间存在一定的差异 , 如在南
阳点 RIL 群体花丝活力的平均值为 14%, 郑州点 RIL 群
体花丝活力的平均值为 27%, 浚县点 RIL 花丝活力的平
均值只有 12%; 同时郑州点 RIL群体的变异范围较大, 而
浚县点 RIL群体花丝活力的变异范围相对较小。
2.3 遗传连锁图谱的构建
在 862对 SSR引物中共筛选到亲本间有明显差异的
引物 256 对, 通过对 RIL 群体进行基因型分析。利用
Mapmaker/Exp Version3.0b软件在 LOD>2.5的条件下, 构

表 2 RIL 群体花丝活力(%)的田间表现
Table 2 Performance of silk vigor (%) in RIL population
亲本 Parent RIL 群体 RIL population 地点
Site
F1 黄 C Huang C 许 178 Xu 178 Mean Min. Max. Ske. Kur. Std.
河南南阳 Nanyang, Henan 85% 0 15% 14% 0% 58% 0.97 0.35 0.13
河南郑州 Zhengzhou, Henan 67% – 33% 27% 1% 67% 0.59 0.02 0.16
河南浚县 Xunxian, Henan 56% 2% 20% 12% 0% 47% 0.88 0.93 0.09
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建一张含 217 个 SSR 标记的连锁遗传图谱, 覆盖玉米的
10 条染色体, 总长度为 2 438.2 cM, 标记间平均长度为
11.2 cM。
2.4 玉米花丝活力的 QTL分析
由于各试点之间花丝活力存在异质性, 以单个试点
两个重复的平均值作为输入数据, 利用复合区间作图法
在 P<0.05显著水平下共定位了 10个玉米花丝活力的QTL
(表 3和图 1), 其中有 2个 QTL在 2个试点中同时检测到,
因此共有 8 个不同位点的 QTL, 分布在玉米第 3、第 5、
第 6、第 7和第 8条染色体上。
在南阳点共检测到 3 个 QTL, 其中位于第 6 染色体
上的两个 QTL qSV6a和 qSV6b可分别解释花丝活力表型
变异的 11.06%和 12.55%, 使花丝活力分别增加 5%左右,
由来自于黄C的基因位点起增效作用; 而位于第 8染色体
上的 qSV8可解释花丝活力表型变异的 11.54%, 由来自许
178的基因位点起增效作用。

表 3 在 3 个试点间检测到的玉米花丝活力 QTL
Table 3 QTL identified for silk vigor at three sites
地点
Site
QTL 连锁标记
Flanking-marker
A R2 (%) LOD
河南南阳 Nanyang, Henan qSV6a bnlg1188–phi077 0.05 11.06 2.75
qSV6b bnlg249–umc2314 0.05 12.55 3.38
qSV8 umc2046–umc1974 0.05 11.54 3.46

河南郑州 Zhengzhou, Henan qSV3a bnlg1144–bnlg1647 0.07 18.31 3.89
qSV5a umc1221–umc1155 0.08 20.82 3.79
qSV5b bnlg1711–umc2209 0.06 11.63 3.01
qSV6a bnlg1188–phi077 0.07 14.12 3.40

河南浚县 Xunxian, Henan qSV3b umc1174–umc1495 0.03 11.09 2.90
qSV6b bnlg249–umc2314 0.04 12.00 3.05
qSV7 umc1401–bnlg1380 0.04 13.88 3.29
A: 加性效应值; R2: 贡献率。A: additive action; R2: contribution.

在郑州点检测到的 4 个 QTL 中, qSV3b、qSV5a 和
qSV6a由来自黄 C的基因位点起增效作用, 可分别解释花
丝活力表型变异的 18.31%、11.63%和 14.12%, 使花丝活
力增加 7%、6%和 7%; 而 qSV5b 由来自许 178 的基因位

图 1 检测到玉米花丝活力的 QTL 染色体位点
Fig. 1 Chromosomal loci of QTL detected for silk vigor in maize

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点起增效作用, 可解释花丝活力表型变异的 20.82%, 该
位点是一个主效的 QTL。
在浚县点同样检测到 3 个 QTL, 均由来自黄 C 的位
点起增效作用, 其中 qSV7 具有较大的表型贡献率, 可解
释花丝活力表型变异的 13.88%, 使花丝活力增加 4%。在
3个试点间检测到的花丝活力 QTL中, qSV6a在南阳点和
郑州点同时检测到, 而 qSV6b 在南阳点和浚县点同时检
测到, 说明这两个 QTL 可以在不同环境条件下影响着花
丝活力的表现。
3 讨论
由于自交衰退的原因自交系的花丝活力对外界环境
条件更加敏感, 因此自交系的花丝活力往往比杂交种更
短。在玉米制种过程中, 如何使父本的散粉高峰期和母本
的吐丝高峰期相遇是决定制种成败的关键 [18-19], 尽管种
子生产者经常根据亲本生育期的长短调整播期以达到使
双亲花期相遇的目的, 但是错期时间过长容易出现父母
本“大苗欺小苗”现象, 导致一个亲本的生长势更弱, 从而
在一定程度上影响制种产量。此外在杂交种子生产过程中
往往采用 1∶5或 1∶6的父母本行比, 田间花粉量并不如
杂交种生产中的田间花粉量充足, 母本花丝接受花粉的
时间往往存在一定的差异, 由于父本的花粉量不能保证
母本花丝在同一时间内进行授粉, 受田间花粉浓度的影
响, 花丝活力短的自交系可能会造成部分花丝不能受精
结实的现象。如果母本具有较长的花丝活力, 则接受花粉
的时间相对较长, 可以在一定程度上减少由于花期不遇
或田间花粉量浓度不足所造成的不良影响, 从而保证玉
米杂交种子的制种产量。
本研究结果表明, 玉米花丝活力非常容易受到环境
条件的影响, 该结论与前人研究结果相同。尽管一个玉米
杂交制种产量的高低会受到诸如散粉期、散粉周期、吐丝
期、吐丝周期等各方面因素的影响[20-22], 而花丝活力亦是
制约其制种产量的因素之一 [23]; 其次 , 对于在开花期易
遭受自然灾害的玉米生产及制种基地(如开花期低温、连
续阴雨)而言, 花丝活力持续时间长, 可以减轻甚至避免
自然灾害对制种产量产生的负面影响。所以花丝活力持续
时间长, 对保证玉米的丰产、稳产有着重要的作用。
前人大量研究证明了玉米花丝活力不但受环境影响
较大, 而且不同基因型之间的玉米花丝活力存在较大的
差异[24]。本研究结果同样证明了玉米花丝活力不但容易
受到环境条件的影响, 而且不同基因型之间存在明显的
差异, 同时存在着明显的杂种优势。此外重组近交系群体
在 3个环境中均表现出显著的超亲遗传现象, 说明在育种
过程中可以通过对控制花丝活力的 QTL 进行聚合, 选育
出花丝活力长的优良玉米自交系。但是在 3个环境中所定
位的 QTL, 只有 2个 QTL (qSV6a和 qSV6b)在 2个环境中
同时检测到, 说明玉米花丝活力的 QTL 多数为环境特异
表达的 QTL, 即多数是基因型与环境互作的 QTL。同时
在本研究中定位的 10 个 QTL 中, 由 8 个 QTL 的增效作
用来自于亲本黄 C, 而在 3个试点中亲本许 178的花丝活
力明显的高于黄 C, 而从理论上检测到的 QTL 应该多数
来自于许 178, 出现这种现象的原因可能是黄 C来自我国
的地方种质资源 , 尽管自身花丝活力相对较短 , 由于自
身对环境条件的适应性, 多数 QTL 可能在 3 个试点的环
境条件下得到了有效的表达而被检测到; 而许 178 选自
美国优良玉米杂交种 78599, 含有部分热带种质, 控制花
丝活力的多数基因可能在温带条件下不能得到有效的表
达而未能检测到, 造成了检测到的 QTL 来自于许 178 的
相对较少。
此外, 尽管本研究所选用的 3 个试点均位于河南省,
但是 3个试点的生态条件仍然存在一定的差异, 导致玉米
花丝活力表现出明显的差异, 通过分析 3个试点的气象资
料, 发现高温影响可能是导致 3个试点花丝活力存在差异
的主要原因。
References
[1] Bassetti P, Westgate M E. Senescence and receptivity of maize
silks. Crop Sci, 1993, 33: 275278
[2] Li J-C(李金才), Cui Y-H(崔彦宏), Dong H-R(董海荣), Wang
Y-Z(王艳哲), Zhang L-H(张丽华). The advances on the growth
and development and the fertilization capability of maize (Zea
mays L.) silk. J Hebei Agric Univ (河北农业大学学报), 2002,
25(1): 8689
[3] Zhang W-Q(张维强), Shen X-Y(沈秀瑛), Dai J-Y(戴俊英). The
effects of drought to pollen, silk vigor and kernel formation. J
Maize Sci (玉米科学), 1993, 1(2): 4548 (in Chinese)
[4] Peterson D P. Duration of receptiveness in corn silks. Agron J,
1949, 34: 369371
[5] Cárcova J, Otegui M E. Ear temperature and pollination timing
effects on maize kernel set. Crop Sci, 2001, 41: 18091815
[6] Hall A J, Vilella F, Trapani N, Chimenti C. The effects of water
stress and genotype on the dynamics of pollen-shedding and
silking in maize. Field Crops Res, 1982, 5: 349363
[7] Otegui M E, Andrade F H, Suero E E. Growth, water use, and
kernel abortion of maize subjected to drought at silking. Field
Crops Res, 1995, 40: 8794
[8] Otegui M E. Kernel set and flower synchrony within the ear of
maize: II. Plant population effects. Crop Sci, 1997, 37: 448455
[9] Schoper J B, Lambert R J, Vasilas B L. Pollen viability, pollen
shedding, and combining ability for tassel heat tolerance in maize.
Crop Sci, 1987, 27: 2731
[10] Schoper J B, Lambert R J, Vasilas B L. Maize pollen viability
and ear receptivity under water and high temperature stress. Crop
Sci, 1986, 26: 10291033
[11] Anderson S R, Lauer M J, Schoper J B, Shibles R M. Pollination
timing effects on kernel set and silk receptivity in four maize hy-
1790 作 物 学 报 第 36卷

brids. Crop Sci, 2004, 44: 464473
[12] Bassetti P, Westgate M E. Emergence, elongation, and senescence
of maize silks. Crop Sci, 1993, 33: 271275
[13] Bassetti P, Westgate M E. Senescence and receptivity of maize
silks. Crop Sci, 1993, 33: 275278
[14] Lander E S, Green P, Abrahamson J, Barlow A, Daly M J, Lin-
coln S E, Etoh T. MAPMAKER: an interactive computer package
for constructing primary genetic linkage maps of experimental
and natural populations. Genomics, 1987, 1: 174–181
[15] Wang S, Basten C J, Zeng Z B. Windows QTL Cartographer 2.0.
Department of Statistics, North Carolina State University, Ra-
leigh, NC, 20012004
[16] Zeng Z B. Precision mapping of quantitative trait loci. Genetics,
1994, 136: 14571468
[17] Lander E S, Botstein D. Mapping Mendelian factors underlying
quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics, 1989, 12:
185199
[18] Cárcova J, Uribelarrea M, Borrás L, Otegui M E, Westgate M E.
Synchronous pollination within and between ears improves ker-
nel set in maize. Crop Sci, 2000, 40: 10561061
[19] Uribelarrea M, Cárcova J, Otegui M E, Westgate M E. Pollen
production, pollination dynamics, and kernel set in maize. Crop
Sci, 2002, 42: 19101918
[20] Struik P C, Doorgeest M, Boonman J G. Environmental effects on
flowering characteristics and kernel set of maize (Zea may L.).
Neth J Agric Sci, 1986, 34: 469484
[21] Cárcova J, Andrieu B, Otegui M E. Silk elongation in maize: re-
lationship with flower development and pollination. Crop Sci,
2003, 43: 914920
[22] Berke T, Rocheford T R. Quantitative trait loci for flowering,
plant and ear height, and kernel traits in maize. Crop Sci, 1995,
35: 15421549
[23] Khairallah M, Bohn M, Jiang C Z, Deutsch J A, Jewell D C,
Mihm J A, Melchinger A E, Gonzalez de Leon D, Hoisington D.
Molecular mapping of QTL for southwestern corn borer resis-
tance, plant height and flowering in tropical maize. Z Pflan-
zenzuecht, 1998, 117: 309318
[24] Hu Y-M(胡彦民), Wu X(吴欣), Li C-X(李翠香), Fu Z-Y(付志
远), Liu Z-H(刘宗华), Tang J-H(汤继华). Genetic analysis on
the related traits of florescence for hybrid seed production in
maize. J Nanjing Agric Univ (南京农业大学学报), 2008, 31(1):
1116 (in Chinese with English abstract)



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