全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(7): 1075−1083 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2006CB101700), 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10Z188)和国家自然科
学基金重点项目(30730063)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 王天宇, E-mail: wangtianyu@263.net; 杨德光, E-mail: ydgl@tom.com
第一作者联系方式: E-mail: lyslys1984@yahoo.com.cn **共同第一作者
Received(收稿日期): 2010-01-05; Accepted(接受日期): 2010-03-04.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01075
玉米泛素延伸蛋白基因 ZmERD16的克隆、序列特征和表达分析
陆月赏 1,2 刘颖慧 2,3,** 张登峰 2 石云素 2 宋燕春 2 王天宇 2,*
杨德光 1,* 黎 裕 2
1东北农业大学农学院, 黑龙江哈尔滨 150030; 2中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081; 3河北北方学院, 河北张家口 075000
摘 要: 在前期研究中发现一个玉米苗期早期应答干旱的 EST序列与拟南芥泛素延伸蛋白 ERD16序列同源性很高。
本研究根据拟南芥 AtERD16 序列, 应用同源克隆技术分离出玉米泛素延伸蛋白基因, 命名为 ZmERD16。ZmERD16
的开放阅读框为 390 bp, 编码 129个氨基酸, 等电点 pI为 9.94, 分子量为 14.7582 kD。ZmERD16蛋白包含 1个泛素
单体蛋白, 其后融合了 53个氨基酸的核糖体多肽, 属于泛素延伸蛋白亚族。ZmERD16具有 4个外显子 3个内含子的
基因组结构, 其启动子区域具有多个干旱、病害、水杨酸、乙烯、真菌等胁迫响应应答元件。蛋白结构预测显示
ZmERD16无跨膜结构, 定位于细胞质和细胞核中。利用实时荧光定量 PCR对 ZmERD16的组织表达特异性和在不同
胁迫条件下的表达谱分析表明, ZmERD16在各组织中均表达, 其表达量受盐、脱水、PEG、低温、高温、茉莉酸甲酯
和水杨酸等多种胁迫信号诱导。推测 ZmERD16可能参与玉米的多种胁迫信号传导和逆境应答进程。
关键词: 玉米; 泛素延伸蛋白; 克隆; 逆境胁迫; ZmERD16
Identification and Expression Analysis of ZmERD16: a Ubiquitin Extension
Protein Gene in Maize (Zea mays L.)
LU Yue-Shang1,2, LIU Ying-Hui2,3,**, ZHANG Deng-Feng2, SHI Yun-Su2, SONG Yan-Chun1, WANG
Tian-Yu2,*, YANG De-Guang1,*, and LI Yu2
1 College of Agronomy, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sci-
ences, Beijing 100081, China; 3 Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China
Abstract: Ubiquitin extension protein is a fusion protein of an ubiquitin monomer followed by a ribosomal protein with 52–53
animo acids or 76–78 amino acids. Ubiquitin extension proteins have been paid attention that they play important roles in re-
sponding to stresses and regulating certain developmental processes in plants. We describe here the isolation, sequence character-
istics and expression analysis of ZmERD16 gene encoding a homologue of ubiquitin extension protein. ZmERD16 includes a 390
bp open reading frame (ORF) encoding an ubiquitin monomer followed by 53 animo acids, with a predicted molecular mass of
14.7582 kD and pI of 9.94. The genomic DNA and the promoter region of ZmERD16 were obtained by PCR method. The ge-
nomic DNA was composed of four exons and three introns. Promoter had some motifs that were related to light, stress, defense,
development, auxin and other stresses. The tissue-specific expression analysis suggested that ZmERD16 was constitutively ex-
pressed in maize different tissues. Quantitative real-time RT-PCR results showed ZmERD16 was a multiple stresses inducible
gene, induced by various stresses, such as salt, dehydration, cold, heat, PEG, methy jasmonat (MJ), and salicylic acid (SA), but
not by ABA and 2,4-D. These results suggested that ZmERD16 might play an important role in various signal transduction path-
ways of stresses in plant.
Keywords: Maize; Ubiquitin extension protein; Clone; Stress; ZmERD16
泛素是一类广泛存在于所有真核生物中, 具有 76
个氨基酸残基的保守小蛋白[1]。它可用来标记生物体
内需要降解的蛋白, 促使底物蛋白被特异性识别并迅
速降解。这种标记作用是非底物特异性的, 在蛋白降
解过程中具有重要的枢纽作用[2]。泛素介导的 26S 蛋
白酶体降解途径(ubiquitin-dependent proteolytic path-
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way)是已知的最重要的蛋白质降解途径[3]。
泛素基因属于多基因家族, 在生物体内以融合
基因的形式存在[4]。真核生物中编码泛素的基因可
分为两类, 一类是多个泛素单体头尾相连组成的多
聚泛素基因(polyubiquitin genes); 另一类是泛素单
体的 C-末端与核糖体多肽组成的泛素延伸蛋白
(C-terminal extension genes 或 ubiquitin-extension
proteins)。泛素延伸蛋白又可分为两类, 一类 C末端
与 52~53个氨基酸的核糖体 L40 (ribosomal L40)多
肽融合, 即 ubiquitin/L40泛素延伸蛋白; 另一类是C
末端与 76~78 个氨基酸的核糖体 S27a (ribosomal
S27a)多肽融合, 即 ubiquitin/S27a泛素延伸蛋白。泛
素延伸蛋白的研究最早是在酵母[5]中, 后在人类、线
虫、拟南芥和水稻等物种中均克隆出编码该类蛋白
的基因[6-7]。酵母中泛素延伸蛋白的作用是增加核糖
体出入细胞核的效率[8]; 线虫咽部泛素延伸蛋白 C-
末端的核糖体多肽对植物根部多核体的形成有调节
作用[9]。现有研究发现, 泛素介导的蛋白酶体通路与
植物逆境条件下异常蛋白的降解关系密切[10-11]。
Kiyosue 等[12]的研究表明 ubiquitin/L40 泛素延
伸蛋白参与了植物抵抗干旱胁迫的过程, 他们在干
旱处理 1 h的拟南芥中获得了 16个对干旱胁迫信号
快速应答的基因并命名为ERD基因(early responsive
to dehydration), 其中包括一个泛素延伸蛋白
AtERD16, AtERD16 不受 ABA 的诱导, 可通过降解
掉异常蛋白而对植物细胞起保护作用。本实验室在
前期研究中发现一个玉米苗期早期应答干旱的 EST
序列, 与拟南芥 AtERD16 序列同源性很高。本研究
根据拟南芥 AtERD16基因序列从玉米中克隆得到泛
素延伸蛋白基因 ZmERD16, 通过对 ZmERD16 的组
织表达特性和对各种非生物胁迫及激素胁迫响应情
况的研究, 以期获取玉米中泛素延伸蛋白在逆境条
件下的表达特征, 同时为玉米抗逆分子育种提供新
的候选基因和理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料与处理
玉米自交系 CN165, 是原中国农业科学院作物
品种资源研究所培育的抗旱自交系, 及玉米杂交种
“中玉 4号”的亲本。
选取萌芽一致的幼苗移栽到装有蛭石的盒子中,
每盒种 4株, 人工气候室条件为每天 16 h光照、温
度 28℃、相对湿度 60%。于三叶期开始进行胁迫处
理到特定时间取样[13]。非生物胁迫处理分别为 4℃
冷处理、42℃热处理、滤纸上脱水处理、20% PEG
6000渗透胁迫处理、200 mol L−1 NaCl处理, 处理 0、
1、2、5、10、24 h后分别取样(根和茎叶分开保存);
激素胁迫处理分别为 100 μmol L−1脱落酸(ABA)、生
长素(2,4-D)、水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MJ)喷洒叶
面。处理 0、1、2、5、10 h后取地上茎叶, 每个样
品重复 3次。取样后液氮速冻并于−70℃保存备用。
组织表达谱中的材料包括正常生长条件下幼
苗、三叶期的根、茎叶以及成株玉米吐丝期的穗位
叶、雄穗、雌穗、未成熟胚、花丝。所有样品均以
液氮速冻后−70℃保存备用。
1.2 ZmERD16 基因的克隆, 启动子、基因组序
列扩增
根据已报道的拟南芥 AtERD16 (TAIR:AT3G5-
2590)序列, 通过 NCBI 的 BLAST 比对(http://blast.
ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和 MaizeSequence 数据库
(http://www.maizesequence.org/version.html)中查询 ,
确定玉米的同源序列 , 据此设计特异引物进行
RT-PCR 扩增; 其正向引物为 5′-AAGGGGCGGGT
ACGTCAAGATGCAG-3′, 反向引物为 5′-GACG
CAAACCATGCAAGGAACCGAT-3′。PCR 程序为
94℃预变性 5 min; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 min,
32个循环; 最后 72℃延伸 10 min。PCR产物经 1.0%
琼脂糖凝胶电泳检测后, 切下目标条带, 回收后通
过 T/A法与 pMD18-T Simple Vector (TaKaRa, 中国
大连)连接, 转化大肠杆菌 TOP10。最后经测序确定
CN165自交系的 ERD16基因编码序列。
利用DNAMAN软件设计 ZmERD16的基因组和
启动子特异性引物。基因组序列扩增引物正向为 5′-
AAGGGGCGGGTACGTCAAGATGCAG-3′、反向为
5′-GGAAGAGCCACAATACGACAT-3′; PCR 程序
为 94℃预变性 5 min; 94℃ 45 s, 58℃ 45 s, 72℃ 150
s, 33个循环; 最后 72℃延伸 10 min。将 PCR产物连
接到 pMD18-T Simple Vector上, 测序, 重复 3次。
将获得的 ZmERD16 的基因组序列在 Maize-
Sequence数据库中查询, 得到该基因组上游约 2 500
bp 的启动子序列 , 以此序列设计引物 , 正向为
5′-CTCCCAAGTCCAAAGACA-3′, 反向为 5′-AAAT
GGATGCGTACAATAC-3′; PCR程序为 94℃预变性
5 min, 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 2 min, 33个循环,
最后 72℃延伸 10 min。将 PCR产物连接到 pMD18-T
Simple Vector上, 测序, 重复 3次。
第 7期 陆月赏等: 玉米泛素延伸蛋白基因 ZmERD16的克隆、序列特征和表达分析 1077


1.3 总 RNA提取和实时荧光定量 PCR分析
按照 TRNzol-A+(TIANGEN公司)试剂说明书提
取玉米材料总 RNA, 经 DNaseI (TaKaRa, 中国大连)
消化去除 DNA 后 , 参照 M-MLV 逆转录酶
(Invitrogen, USA)试剂盒操作说明以随机引物 Oligo
dT进行反转录合成第一链 cDNA。
使用 ABI PRISM7000 实时定量扩增仪及试剂
盒 SYBR Premix Ex Taq Kit (TaKaRa, 中国大连)进
行实时荧光定量 PCR 检测。20 μL 反应体系含
SYBRTM Premix Ex Taq 10 μL, 正反向引物 (10
μmol L−1)各 0.4 μL, cDNA模板 1 μL, ddH2O 8.2 μL。
反应程序为 95℃预变性 90 s; 95℃ 5 s, 60℃ 15 s,
72℃ 20 s, 共 40个循环, 每个样品 3次重复。PCR
扩增引物为 5′-CGGACCAGCAGCGACTAAT-3′和
5′-GCATAGCACTTGCGGCAGA-3′; 以玉米 GAPDH
(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)为参照
看家基因 , PCR 引物为 5′-CCCTTCATCACCAC
GGACTAC-3′和 5′-AACCTTCTTGGCACCACCCT-
3′。按照基因相对表达分析 2–ΔΔCt 方法 [14]分析
ZmERD16的相对表达量及其标准差。
1.4 生物信息学分析
序列的查找、比对、同源性比较由 NCBI 和
MaizeSequence 的 BLAST 程序完成; 基因组序列和
基因上游序列检索均由 NCBI 和 MaizeGDB (http://
www.maizegdb.org/)的 BLAST 程序完成; 氨基酸一
级结构(等电点和分子量)预测由 ExPASy 在线程序
(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)完成。
基因组外显子和内含子预测由 GSDS 在线程序
(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php?input=seq)完成;
启动子顺式作用元件分析在 PlantCARE 网站(http://
bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/
search_CARE.html)完成; 用 TMHMM在线程序(http://
www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和WOLFP-SORT (http:
//wolfpsort.org/)完成亚细胞定位预测; 用 TM-HMM
在线程序 (http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)
预测蛋白质跨膜区结构; 同源性比对和进化树分析
分别由 Clustalx1.83、Genedoc和 DNAMAN软件完
成。
2 结果与分析
2.1 ZmERD16基因的同源克隆和序列特征分析
根据拟南芥 AtERD16基因序列同源克隆玉米的
泛素延伸蛋白基因, 命名为 ZmERD16 (GenBank 登
录号为DQ244967.1)。ZmERD16的开放阅读框为 390
bp, 编码 129个氨基酸(图 1), 即泛素的 76个氨基酸
后融合了 53个氨基酸的核糖体 L40蛋白。编码蛋白
的等电点 pI为 9.94, 相对分子量为 14.7582 kD。对
ZmERD16进行蛋白结构预测, 结果未发现跨膜区的
存在, 推测 ZmERD16编码蛋白为非膜蛋白; 亚细胞
结构预测将其定位于细胞质和细胞核中。

图 1 ZmERD16基因的 ORF序列及编码氨基酸序列
Fig. 1 The ORF sequence and deduced amino acid sequence of ZmERD16

PCR扩增获得 ZmERD16的基因组序列 3 252 bp,
包含 3个内含子, 4个外显子, 外显子的大小分别为
106、190、64、30 bp (图 2)。通过数据库查询, 发
现该基因位于第 2条染色体的长臂。

图 2 ZmERD16基因组的内含子和外显子结构
Fig. 2 The intron and exon structure of ZmERD16
黑框代表外显子。The exons are shown in black-shaded boxes.
2.2 同源性比对和进化树分析
图 3表明, ZmERD16与高粱、水稻、拟南芥、
葡萄、蓖麻、大豆、青蒿、苜蓿、黑杨、芸薹、衣
藻、酵母、线虫、人类、果蝇、家蚕和草地贪夜蛾
等物种的 ubiquitin/L40 泛素延伸蛋白的氨基酸相似
性均较高。原生动物四膜虫、水稻、玉米、高粱及
昆虫类的家蚕和蛾的泛素单体的 76 个氨基酸后融
合了 53个氨基酸(ubi-53), 而果蝇、酵母、人等的泛
素单体后融合了 52个氨基酸(ubi-52), 推测 ubi-52
与 ubi-53 两类泛素延伸蛋白可能是由不同的分子进
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化途径产生的[15]。不同真核生物物种中泛素延伸蛋
白的前 76个编码泛素单体的氨基酸是高度保守的 ,
特别是参与泛素-蛋白复合体形成的 4 个功能位点
Lys-29、Lys-48、Lys-63和 Gly-76是绝对保守的[16]。
后 52~53 个氨基酸编码的核糖体多肽的序列包含一
个富含碱基氨基酸的序列(第 122~128 个氨基酸)和
一个锌指结构(第 96~115 位), 在不同进化地位的物
种间也相当保守。据 ubiquitin/L40 泛素延伸蛋白序
列的高度保守推测这类蛋白在真核生物中具功能一
致性。

图 3 玉米 ZmERD16和其他生物物种的泛素延伸蛋白序列的比对
Fig. 3 Comparison of ZmERD16 and other eukaryotes’ homologous proteins

为进一步研究植物泛素延伸蛋白的进化关系 ,
选用 NCBI 中已登录的 12 个植物物种的 ubiquitin/
L40泛素延伸蛋白作进化树分析, 结果见图 4。除水
稻(Oryza sativa)、葡萄(Vitis vinifer)和黑杨(Populus
trichocarpa)存在多个氨基酸序列稍有不同的泛素延
伸蛋白外, 其他物种均聚为一类。由聚类分析可见所
聚类的植物分为单子叶植物、双子叶植物和绿藻 3类,
这与生物进化具有高度的相关性, 因此该蛋白为进化
中非常保守的蛋白, 推测其具有重要的功能。
2.3 ZmERD16基因的表达谱分析
在正常生长条件下, ZmERD16在玉米不同时期
和不同组织中均表达(图 5), 但在雌穗、雄穗、幼胚、
花丝和穗位叶等器官中表达量最高, 在幼叶和根中
表达量相对较低。雌穗、雄穗、幼胚、花丝均属玉
米生殖器官, 推测 ZmERD16 可能参与调控与生殖
生长相关的代谢过程。
为检测泛素延伸蛋白基因与各种非生物胁迫和
激素处理的相关性 , 以荧光定量 P C R 方法对
ZmERD16 基因在多种非生物胁迫和激素胁迫下的
表达动态进行了分析。ZmERD16基因在地上部和根
部受诱导表达的情况如图 6, 以基因表达倍数 2作为
基因受诱导表达的标准[14]。结果发现, 在 PEG、盐、
第 7期 陆月赏等: 玉米泛素延伸蛋白基因 ZmERD16的克隆、序列特征和表达分析 1079



图 4 不同植物物种中泛素延伸蛋白的聚类分析
Fig. 4 Phylogenetic analysis of ubiquitin extension proteins in different plant taxa
选用 GenBank中已登录的 13个植物物种的 ubiquitin/L40泛素延伸蛋白, 利用 ClustalX1.83和 DNAMAN软件作进化树分析。
The tree was constructed from an amino acid sequence matrix according to alignment of ubiquitin/L40 ubiquitin extension protein using
ClustalX1.83 and DNAMAN. Sequences of amino acids of these ubiquitin extension proteins were from GenBank.


图 5 以实时荧光定量法分析 ZmERD16在不同组织中的表达
情况
Fig. 5 Expression of ZmERD16 in various tissues of maize by a
fluorescence-quantitative RT-PCR assay
1: 幼叶; 2: 成熟根; 3: 幼根; 4: 雌穗; 5: 雄穗; 6: 幼胚; 7: 花丝;
8: 穗位叶。将雌穗中 ZmERD16的表达水平作为其他组织的相
对参照, 定义为 1, 误差线以标准偏差(SD)表示。
1: seedling shoots; 2: roots; 3: seedling roots; 4: female ear; 5:
tassels; 6: immature spikes; 7: silk; 8: ear leaves. The transcript
level in female ear was used as the calibrator and was given as 1.
All the values are means±SD (n = 3), and SD is shown as error bar.

脱水、低温、高温、SA和MJ等不同处理下, ZmERD16
基因的表达受到不同程度的影响。盐处理 1 h,
ZmERD16在根部已显著上调表达, 处理 2 h达到最
高, ZmERD16在地上部盐处理 1 h上调, 80%达到最
高, 2 h后开始下调; 脱水处理 1 h, ZmERD16在地上
部已显著上调表达, 处理 5 h达到最高, 在根部无显
著变化; 4℃冷处理 1 h, ZmERD16在地上部显著下
调表达, 随后上调, 处理 2 h后开始下调表达, 至 24
h达到显著下调水平, 根部无显著变化; 42℃热处理
10 h, ZmERD16在地上部显著上调表达, 持续到 24
h, 在根部直到处理 24 h 才显著上调表达; 在 PEG
处理下, 根部 ZmERD16只在处理 2 h时检测到显著
上调表达; 在 MJ 处理下, 地上部 ZmERD16 在处理
10 h显著上调表达, 达到最高水平; 在 SA激素处理
下, 地上部 ZmERD16在处理 5 h达到显著上调表达,
随后开始下降; 然而在 ABA 和 2,4-D 处理下, 均未
检测到玉米幼苗地上部 ZmERD16 表达量的显著变
化。由以上结果表明 ZmERD16 基因在玉米幼苗期
的地上部和根中均有一定的基础表达, 在玉米幼苗
响应不同胁迫反应进程中具有不同的应答模式, 同
时可以推断 ZmERD16 基因可能参与玉米幼苗的多
种逆境胁迫反应进程。
1080 作 物 学 报 第 36卷


图 6 以实时荧光定量 PCR法分析玉米幼苗中 ZmERD16基因在不同胁迫下的表达情况
Fig. 6 Expression of ZmERD16 in maizes seedlings under various stresses by a fluorescence-quantitative RT-PCR assay
0 h表示未经处理, 其基因的表达水平作为其他处理时间的相对标准, 定义为 1。
The transcript level at time 0 h (untreated) was used as the calibrator and was given as 1.

2.4 启动子区的胁迫相关顺式作用元件分析
根据 ZmERD16 在各种胁迫下的表达情况, 推测
其可能参与玉米逆境胁迫的应答反应。因此扩增了
ZmERD16基因起始密码子上游 2 189 bp的启动子序
第 7期 陆月赏等: 玉米泛素延伸蛋白基因 ZmERD16的克隆、序列特征和表达分析 1081


列, 利用 PlantCARE网站分析其顺式作用元件。结果
如表 1所示, ZmERD16基因起始密码子上游除含有多
个 CAAT-BOX、TATA-BOX等启动子典型元件外, 还
存在多个胁迫响应元件, 如 MBS (MYB binding site
involved in drought-inducibility)和 TC-rich repeats (de-
fense and stress response)等; 特异表达所必需的调控
元件, 如胚乳表达的调控元件 Skn-1-motif (GTCAT)和
分生组织表达的调控元件 CAT-box (GCCATC); 受光
诱导(light responsive element)、水杨酸诱导(salicylic
acid responsiveness)、乙烯诱导 (ethylene-responsive
element)、茉莉酸诱导(MeJA responsiveness)、真菌诱
导(fungal elicitor responsiveness)等受诱导顺式调控的
元件。启动子分析结果为 ZmERD16 可能参与玉米的
胁迫信号传导途径的推测提供了一定的理论依据。

表 1 ZmERD16启动子区顺式作用元件预测
Table 1 Prediction of cis-acting elements of the ZmERD16 promoter from maize
调控位点名称
Name of cis-acting element
序列
Sequence
作用
Function
CAAT-box CAATT cis-acting element in promoter and enhancer regions
TATA-box TTTTA core promoter element around -30 of transcription start
ARE TGGTTT cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction
MBS T/CAACTG MYB binding site involved in drought-inducibility
TC-rich repeats ATTCTCTAAC cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
CAT-box GCCACT cis-acting regulatory element related to meristem expression
Skn-1_motif GTCAT cis-acting regulatory element required for endosperm expression
CGTCA-motif CGTCA cis-acting regulatory element involved in the MeJA responsiveness
ERE ATTTCAAA ethylene-responsive element
MBSII AAAAGTTAGTTA MYB binding site involved in flavonoid biosynthetic genes regulation
Box-W1 TTGACC fungal elicitor responsive element
AT-rich sequence TAAAATACT element for maximal elicitor-mediated activation (2 copies)
TCA-element GAGAAGAATA cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness
TGACG-motif TGACG cis-acting element involved in the MeJA-responsiveness

3 讨论
本研究从玉米中克隆得到编码泛素延伸蛋白的
基因 ZmERD16。泛素延伸蛋白在多种生物中均被克
隆到, 通过氨基酸序列比对, 发现该类基因无论是
前 76个氨基酸的泛素结构域还是后 52~53个氨基酸
的核糖体 L40 多肽均具有高度保守的一致性。根据
这一特性, 进一步证实该类家族基因在不同物种中
的功能的一致性。Ubiquitin/L40泛素延伸蛋白 C末
端第 47~52 位的氨基酸序列-Pro-Lys-Lys-Lys-Val-
Lys-和病毒 SV40 的 T 抗原的核定位信号-Pro-Lys-
Lys-Lys-Arg-Lys-Val-非常类似, 可能是该蛋白的核
定位序列。泛素延伸蛋白的后 52~53 个氨基酸的核
糖体 L40 序列中, 除具有高比例的碱性氨基酸(K、
R)特性外 , 第 96~115 位氨基酸序列 Cys-X2-Cys-
X10-Cys-X4-Cys 符合典型的 Zn 指结构的序列, 为
Cys-X2-4-Cys-X2-15-Cys-X2-4-Cys/His-X[17], 该区域可
能形成指形构象的骨架与 DNA结合。推测该区域高
碱性氨基酸残基和 Zn 指结构是功能同源性所必需
的[18]。泛素延伸蛋白的进化树分析将植物物种按单
子叶、双子叶和绿藻分为 3 类, 说明其与物种进化
具有高度相关性。
泛素主要分布在真核细胞的细胞质和细胞核
中[19], 本研究中 ZmERD16 蛋白无跨膜结构, 亚细
胞定位在细胞质和细胞核中, 这与前人的研究结果
一致。在酵母[5]、拟南芥[7]等生物中 Ubiquitin/L40
泛素延伸蛋白基因的研究证实, 在分生组织中活跃
表达。本研究发现玉米中 ZmERD16 在各组织中均
有表达, 相对于根和幼叶, 在花丝、雌穗、雄穗、幼
胚等组织中表达更强。ZmERD16启动子中也存在多
个胚乳和分生组织特异表达的顺式作用元件。因此,
ZmERD16 可能在玉米的生殖生长过程和细胞分裂
旺盛的分生组织中发挥功能。
在各种生物、非生物胁迫条件下植物体内会发
生活性氧(reactive oxygen species, ROS)过度积聚 ,
活性氧攻击蛋白、核酸、脂肪等生物大分子产生过
多无功能蛋白, 无论在何种逆境胁迫下, 加强这些
垃圾蛋白的处理能力, 对于维持植物体的正常生长
1082 作 物 学 报 第 36卷

发育和细胞正常代谢, 对于提高生物的抗逆能力都
是很重要的。已有报道泛素是一种逆境响应蛋白 ,
受干旱和热激的诱导, 本研究的实验结果提供了进
一步的证据。在抗旱玉米自交系 CN165 中 ,
ZmERD16的表达受到 PEG、盐、脱水、高温、SA、
MJ 等胁迫的影响显著上调表达, 推测 ZmERD16 参
与多种胁迫响应过程并发挥调控作用。ZmERD16的
PEG 处理结果与盐处理结果一致, 都在处理 2 h 达
到表达高峰, 这与前人研究结果一致, 属于早期响
应蛋白[12]。可用 ZmERD16 基因表达上调标记逆境
条件下的异常蛋白, 以便对这些无功能蛋白进行顺
利降解或正确处理, 推测这对于提高植物体的抗逆
性是有利的。ZmERD16的表达受 4℃低温的诱导显
著下调, 可能是由于泛素的合成代谢受到冷害影响,
导致该基因的转录水平降低。另外 ZmERD16 表达
不受ABA的影响, 推测 ZmERD16参与非ABA介导
的逆境响应途径。光是植物光合作用中碳代谢的重
要影响因子, 而 ZmERD16 的启动子区域具有多个
光响应元件(表 1)。当环境提供的光量子超过 CO2
同化的需要时, 光合作用过程中就会产生大量的活
性氧中间产物 , 这必然导致大量的垃圾蛋白积累 ,
因此增加泛素蛋白的表达对植物自身的生长发育具
有非常重要的作用[20]。因此推测 ZmERD16 可能参
与光逆境信号或者参与植物光合作用的碳代谢。此外
ZmERD16基因启动子区域还具有多个与干旱、病害防
御、水杨酸、乙烯、真菌等胁迫响应相关的元件, 进
一步为 ZmERD16应答逆境信号提供了依据。
目前泛素相关基因的研究大多数停留在基因结
构分析和表达谱分析阶段, 基因功能的鉴定与验证
工作较少。为进一步确定 ZmERD16 的过量表达与
抗逆性的关系 , 已将玉米泛素延伸蛋白基因
ZmERD16转化拟南芥和玉米, 期望通过提高泛素基
因表达量来加强对无功能蛋白质的处理能力, 研究
其抗逆性的变化, 以期为提高玉米的盐、旱等抗性
提供新的候选基因和理论依据。目前表型鉴定工作
正在进行中。另外, ubiquitin/L40泛素延伸蛋白基因在
不同抗逆性玉米材料中的差异表达可作为后续研究之
一, 进一步确证该家族基因的胁迫诱导表达特征。
4 结论
克隆了玉米的泛素延伸蛋白基因 ZmERD16, 它
具有泛素延伸蛋白共有的一些特征。其启动子序列
除含有多个 CAAT-BOX、TATA-BOX、光响应元件
等启动子典型元件外, 同时存在多种非生物胁迫和
生物胁迫响应元件; 它在玉米不同时期和不同组织
中呈组成型表达; ZmERD16的表达受 PEG、盐、脱
水、低温、高温、SA、MJ 等胁迫的影响发生显著
变化, 推测 ZmERD16 在玉米应对外界多种胁迫反
应中通过不同的应答模式发挥调控作用。
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