全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(3): 556562 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家农业行业标准制(修)订项目(2130109)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王步军, E-mail: wangbj@mail.caas.net.cn, Tel: 010-82105798
第一作者联系方式: E-mail: aoccgt@caas.net.cn, Tel: 010-82108740
Received(收稿日期): 2011-07-23; Accepted(接受日期): 2011-10-15; Published online(网络出版日期): 2012-01-04.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120104.1649.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00556
测定玉米中伏马毒素的免疫亲和层析净化高效液相色谱法
李为喜 1 郑床木 2 武 力 1 李 欣 1 李静梅 1 宋敬可 1
杨秀兰 1 王步军 1,*
1 中国农业科学院作物科学研究所 / 农业部谷物品质监督检验测试中心, 北京 100081; 2中国农业科学院农业质量标准与检测技术研
究所, 北京 100081
摘 要: 伏马毒素(Fumonisins)是串珠镰刀菌繁殖产生的一类真菌毒素。玉米在生长和储存过程中极易受到伏马毒素
的侵染。流行病学研究结果表明, 受到伏马毒素污染的玉米及其制品可导致马白脑软化症、猪肺水肿综合症, 还可诱
发人类食管癌和胎儿神经管畸形等疾病。本研究建立了应用免疫亲和柱净化高效液相色谱测定玉米中伏马毒素 B1
和 B2 的方法, 同时, 运用统计学方法对该法进行了准确性和再现性评价。结果表明, FB1 和 FB2 线性范围分别为
0.06~5.00 μg mL1和 0.04~2.50 μg mL1, 回收率分别为 76.6%~93.8%和 77.9%~93.4%, FB1和 FB2方法定量限分别为
0.09 mg kg1和 0.06 mg kg1, 实验室内重复性测定的变异系数均低于 5%, 实验室间再现性测定的变异系数低于 6%。
上述结果说明该方法的线性、准确度、精密度、灵敏度及同一实验室重复性和多家实验室的再现性评价结果优良, 适
合作为伏马毒素的测定方法。应用该方法对 310份玉米进行了伏马毒素的测定, 结果表明, 大田、存储玉米伏马毒素
总量范围分别为 0.20~9.06 mg kg1和 0.21~6.10 mg kg1, 建议应加强玉米中伏马毒素污染水平监控, 保证人畜健康。
关键词: 玉米; 伏马毒素; 高效液相色谱; 免疫亲和柱
Determining Fumonisins in Corn by High Performance Liquid Chromato-
graphy with Immunoaffinity Column Cleanup
LI Wei-Xi1, ZHENG Chuang-Mu2, WU Li1, LI Xin1, LI Jing-Mei1, SONG Jing-Ke1, YANG Xiu-Lan1, and
WANG Bu-Jun1,*
1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Cereal Quality Supervision and Testing Center, Ministry of Agriculture, Bei-
jing 100081, China; 2 Institute of Quality Standards & Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing
100081, China
Abstract: Fumonisins are mycotoxins produced mainly by Fusarium verticillioides. It is frequently found that corn is contami-
nated by fumonisins during its growth and storage. Epidemic study demonstrated that corn and corn-based products contaminated
by fumonisins can cause equine leukoencephalomalacia and swine pulmonary oedema, also induce oesophageal cancer and neural
tube defects of mankind. In this paper, a high performance liquid chromatography (HPLC) method with immunoaffinity column
cleanup was established to determine the fumonisins B1 (FB1) and B2 (FB2) in corn. Meanwhile, the accuracy and reproducibility
of the method were evaluated by statistical technique. The results showed that the linear ranges of FB1 and FB2 were 0.06–5.00 μg
mL1 and 0.04–2.50 μg mL1, the recovery ranges were 76.6–93.8% and 77.9–93.4%, respectively. The quantification limit of FB1
and FB2 was 0.09 mg kg1 and 0.06 mg kg1, respectively. The coefficient of variation within-laboratory repeatability was below
5%, and that between-laboratories reproducibility was below 6%. Research results indicated that this method possessed good line-
arity, accuracy, precision, sensitivity, repeatability within a laboratory and among laboratories. Therefore, this method was proved
to be suitable for determination of fumonisins in corn. Applying this method, fumonisins in 310 specimens of corn were deter-
mined. Results showed that total fumonisins (B1+ B2) ranged from 0.20 to 9.06 mg kg1 for field corn, and from 0.21 to 6.10 mg
kg1 for stored corn. It is proposed that monitoring fumonisins’ level in corn should be reinforced to protect the health of man and
livestock.
Keywords: Corn; Fumonisins; HPLC; Immunoaffinity column
第 3期 李为喜等: 测定玉米中伏马毒素的免疫亲和层析净化高效液相色谱法 557


伏马毒素(Fumonisins)是由串珠镰刀菌(Fusarium verti-
cillioides)产生的一类水溶性代谢物。毒理学及流行病学研
究表明, 伏马毒素具有神经毒性、肺毒性、致癌性等[1-3],
可导致马白脑软化症、猪肺水肿综合症, 还可诱发人类食
管癌和胎儿神经管畸形等疾病。玉米容易受串珠镰刀菌侵
染而被伏马毒素污染[4-5]。玉米是世界主要农作物, 是谷
物食品和饲料的主要来源之一, 因此, 研究玉米伏马毒素
的测定方法对保证人畜健康具有重要意义。到目前为止,
自然界已发现 28 种伏马毒素类似物, 玉米中以伏马毒素
B1(FB1)和伏马毒素 B2(FB2)为主[6-8]。伏马毒素的测定主要
包括以下方法: (1)薄层色谱法(TLC)。FB1和 FB2在硅胶 G
板上展开后, 用甲氧基苯甲醛或水合茚三酮在 120℃条件
下显色,根据标准品和试样中 FB1、FB2比移值(Rf)和斑点面
积定性、定量测定[9]。该法操作简单, 成本低, 对设备和检
验人员要求低, 但其随机误差大, 操作费时, 且灵敏度和
选择性较差。(2)酶联免疫法(ELISA)。主要包括直接竞争
吸附法和间接竞争吸附法, 两种方法的检测范围相当, 但
灵敏度不同[10-11]。样品前处理简单, 不需昂贵设备, 检测
灵敏度较高 , 但因抗原抗体反应亲和程度不同容易产生
检测假阳性, 定量测定准确性不高, 因此应用受到一定程
度限制。(3)气相色谱-质谱法(GC-MS)。首先将伏马毒素
结构中的极性羧羟基基团通过化学反应转变为非极性的
甲基硅烷化基团, 然后通过毛细管气相色谱-质谱仪定性
定量检测 , 早期有学者采用该方法检测伏马毒素 [12], 但
由于衍生转化效率不高、操作耗时, 现已应用不多。(4)
高效液相色谱法(HPLC-FLD)。首先从样品中提取伏马毒
素, 经净化后与含有荧光性质的邻苯二甲醛(OPA)形成具
有荧光特性的衍生物, 然后通过反相液相色谱-荧光检测
器检测。净化是其关键步骤, 前人多采用固相萃取柱(SPE)
和强阴离子交换柱(SAX)的净化方法[13], 但效果不佳, 杂
质干扰多, 导致灵敏度低并易造成假阳性测定结果。
本研究以免疫亲和层析(Immunoaffinity column)净化,
经邻苯二甲醛(OPA)衍生后通过反相液相色谱-荧光检测
器对伏马毒素 B1和伏马毒素 B2同时测定, 在净化过程中,
伏马毒素通过抗原和抗体吸附和解吸特异反应 , 最大程
度去除了杂质, 净化效果最佳, 使灵敏度得到提高。同时,
依据方法学和统计学的基本原理对建立的方法进行准确
性、重复性、定量限及再现性评价, 为方法的应用提供了科
学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
选取 2009年河北、吉林和四川大田种植的玉米样品
159个及牲畜养殖场或饲料厂储存玉米样品 151个。每个
省选取 3个地区, 每个地区分别抽取约 30~40个大田和储
存玉米样品。遵循国家标准 GB/T 5491-1985《粮食、油料
检验扦样、分样法》随机取样。
1.2 仪器和设备
高效液相色谱仪(LC-20A, 日本岛津); 荧光检测器
(RF-10Axl, 日本岛津 ); 振荡器 (213KZ, 德国 Hofmann);
粉碎机(1093, 瑞典 Foss); 空气压力泵(中检维康); 氮吹仪
(BF-2000M, 北京八方世纪)。
1.3 试剂与耗材
1.3.1 试剂和标准溶液 伏马毒素 FB1 和 FB2 标准品
购自美国 Sigma公司。称取 8 g氯化钠、1.2 g磷酸氢二钠、
0.2 g磷酸二氢钾和 0.2 g氯化钾, 溶于 990 mL水中, 用盐
酸调节 pH 7.0, 用水定容至 1 L, 即磷酸盐缓冲液。称取
邻苯二甲醛(OPA)10 mg, 溶于 2 mL甲醇, 用 0.05 mol L1
四硼酸钠定容至 100 mL, 加入 50 μL 2-巯基乙醇, 混匀,
过 0.45 μm 滤膜, 即衍生液。分别称取 FB1、FB2标准品
10.0 mg, 分别用 50%乙腈溶解、定容至 100 mL, 即标准
储备液; 再配制 FB1、FB2混合标液, 浓度分别为 50.0 μg
mL1、25.0 μg mL1; 用 50%甲醇配制系列标准工作液, 其
中 FB1系列浓度为 0.06、0.10、0.20、0.50、1.0、2.5 和
5.0 μg mL1, FB2系列浓度为 0.04、0.10、0.25、0.50、1.25
和 2.50 μg mL1。
1.3.2 耗材 免疫亲和柱为 Fumoni-Test 小柱, 柱容量
不小于 10 μg, 购自美国 VICAM公司; 玻璃纤维滤纸, 直
径 11 cm, 购自美国 Whatman公司。
1.4 试样制备及处理
1.4.1 试样制备与提取 将样品粉碎并通过 0.4 mm孔
径试样筛, 称取粉碎试样 25 g (精确至 0.01 g)置 150 mL
锥形瓶中, 加入 4 g氯化钠和 80%甲醇溶液 50 mL, 置振
荡器上振荡 30 min, 静置 5 min, 以中速定性滤纸过滤,
移取 10.0 mL滤液于 50 mL容量瓶中, 用磷酸盐缓冲液定
容至刻度, 混匀, 经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清, 收集
滤液。
1.4.2 净化与洗脱 将免疫亲和柱连接于 10 mL 玻璃
注射器下。移取 10.0 mL上述提取滤液, 注入玻璃注射器
中, 将空气压力泵与玻璃注射器连接, 调节压力使溶液以
每秒 1 滴至 2 滴的流速通过免疫亲和柱。加入 10 mL 磷
酸盐缓冲液淋洗亲和柱, 直至有空气通过亲和柱, 弃去全
部流出液。加入 1.5 mL甲醇, 以每秒 1滴的流速洗脱, 收
集洗脱液, 以氮气吹干, 加入 80%甲醇溶液 1.5 mL溶解。
1.4.3 衍生及测定 取净化液或标准工作液 200 μL,
加入 600 μL衍生液, 在涡旋混合器上混匀, 2 min内进样
分析, 以保留时间定性, 外标法定量。
1.5 色谱测定条件
C18反相柱为 5 μm, 4.6 mm×150 mm; 流动相为甲醇+
磷酸二氢钠溶液(0.1 mol L1)=77+23, 用磷酸调节 pH 值
至 3.3; 流速为 0.8 mL min1; 检测波长为激发波长 335
nm、发射波长 440 nm; 进样量为 20 μL。
558 作 物 学 报 第 38卷

2 结果与分析
2.1 标准溶液和试样色谱图
由图 1可以看出不同浓度 FB1、FB2标准品的保留时
间重复性良好, 峰型对称; 由图 2 和图 3 可见, FB1、FB2
能够达到基线分离 , 免疫亲和层析净化去杂质的效果优
良, 可以保证定量分析的准确度。
2.2 标准曲线的绘制
按照上述色谱条件, 将标准工作液衍生后注入液相
色谱仪, 以色谱峰面积为纵坐标、FB1、FB2质量浓度为横
坐标绘制标准曲线(图 4 和图 5)。可见, FB1、FB2线性范
围分别为 0.06~5.00 μg mL1和 0.04~2.50 μg mL1, 相关系
数(R2)分别为 0.9993、0.9995, 说明 FB1、FB2标准溶液衍
生后线性关系良好。
2.3 方法准确度评价
选定 1个玉米空白试样, 进行 3个不同水平的添加,
按照上述测定方法测定并计算 FB1、FB2的回收率(表 1),
从而考察方法的准确性。FB1在 0.40、1.2和 1.5 mg kg1
三个水平的添加回收率分别为 76.6%、89.4%和 93.8%,
FB2在 0.20、0.60 和 1.0 mg kg1三个水平的添加回收率
分别为 77.9%、90.7%和 93.4%, 上述结果说明本方法测



图 1 FB1 (1.0、2.5和 5.0 mg L1)、FB2 (0.5、1.25和 2.5 mg L1)标样色谱图
Fig. 1 Chromatogram of FB1 (1.0, 2.5, and 5.0 mg L1) and FB2 (0.5, 1.25, and 2.5 mg L1) standard solutions



图 2 玉米试样中 FB1和 FB2色谱图
Fig. 2 Chromatogram of FB1 and FB2 in corn samples


图 3 玉米空白试样色谱图
Fig. 3 Chromatogram of FB1 and FB2 in corn blank samples
第 3期 李为喜等: 测定玉米中伏马毒素的免疫亲和层析净化高效液相色谱法 559




图 4 FB1标准工作液线性关系图
Fig. 4 Correlation chart of FB1 standard solution


图 5 FB2标准工作液线性关系图
Fig. 5 Correlation chart of FB2 standard solution

表 1 方法添加回收率试验结果
Table 1 Results of fortified recovery test
类别
Type
组分
Component
添加水平
Spiked level (mg kg1)
测定值
Result (mg kg1)
测定均值
Average result (mg kg1)
回收率
Recovery (%)
平均回收率
Average recovery (%)
0.0000 – FB1
–
0.0000
0.0000
–
–
0.0000 –
空白
Blank
FB2
–
0.0000
0.0000
–
–
0.3228 80.7
0.2978 74.5
FB1 0.40
0.2987
0.3064
74.7
76.6
0.1700 85.0
0.1508 75.4
添加水平 1
Level 1
FB2 0.20
0.1470
0.1559
73.5
77.9
1.0399 86.7
1.0900 90.8
FB1 1.2
1.0881
1.0730
90.7
89.4
0.5478 91.3
0.5607 93.4
添加水平 2
Level 2
FB2 0.60
0.5235
0.5440
87.2
90.7
1.3907 92.7
1.3992 93.3
FB1 1.5
1.4313
1.4071
95.4
93.8
0.9377 93.8
0.9147 91.5
添加水平 3
Level 3
FB2 1.0
0.9492
0.9339
94.9
93.4
–: 未添加或未计算。–: Not fortified or not calculated.

定伏马毒素的准确度高, 稳定性良好。
2.4 实验室内重复性评价
通过多次重复实验验证方法的精密度。在同一实验
室内按照上述方法对随机选定的 3个试样进行 7次平行测
定, 并通过狄克逊(Dixon)准则检验是否存在异常值[14]。
从表 2可以看出, 统计分量 f0和 f7的数值均小于 Dixon准
则的查表值 f(0.05,7), 说明 3 个试样中伏马毒素 FB1、FB2
的测定值通过Dixon准则检验均为非异常值, 表明方法的
精密度良好, 满足色谱分析方法的要求。
2.5 方法定量限
进样量为 10 μL, 以 10 倍信噪比计算 FB1和 FB2检
出浓度分别为 0.06 μg mL1和 0.04 μg mL1(图 6)。本方法
最终定容液即洗脱液的体积为 1.5 mL, 称量样品为 25.00
g, 总稀释倍数为 25, 通过计算得 FB1和 FB2定量限分别
560 作 物 学 报 第 38卷

表 2 实验室内精密度评价结果
Table 2 Results of precision test in laboratories
编号
Type
组分
Component
测定结果
Results (mg kg1)
平均值
Average results (mg kg1)
检验统计量
Statistical results
狄克逊判断
Statistical estimation
2.48 2.67 2.61
2.69 2.64 2.52
FB1
2.55
2.60 f0=0.125
f7=0.292
f(0.05,7)=0.569
f0f71.19 1.33 1.30
1.21 1.24 1.30
试样 1
Sample 1
FB2
1.23
1.26 f0=0.154
f7=0.386
f(0.05,7)=0.569
f0f70.41 0.42 0.45
0.45 0.39 0.40
FB1
0.48
0.43 f0=0.105
f7=0.362
f(0.05,7)=0.569
f0f70.14 0.13 0.14
0.14 0.12 0.12
试样 2
Sample 2
FB2
0.14
0.13 f0=0.240
f7=0.301
f(0.05,7)=0.569
f0f72.04 2.03 2.18
2.03 2.05 2.23
FB1
2.21
2.11 f0=0.213
f7=0.334
f(0.05,7)=0.569
f0f70.41 0.41 0.43
0.41 0.42 0.43
试样 3
Sample 3
FB2
0.45
0.42 f0=0.224
f7=0.197
f(0.05,7)=0.569
f0f7


图 6 FB1、FB2检出浓度为 0.06 μg mL1和 0.04 μg mL1时的标样色谱图
Fig. 6 Chromatogram of 0.06 μg mL1 FB1 and 0.04 μg mL1 FB2 standard solutions

为 0.09 mg kg1和 0.06 mg kg1。
2.6 实验室间重复性和再现性评价
通过不同实验室间相同试样不同添加水平的回收率
测定试验, 考察方法在实验室间的重复性和再现性。选定
一个玉米空白试样, 分别添加 2个水平的 FB1、FB2, 分发
给 5家实验室, 完成添加回收率的测定试验。参加比对试
验的实验室分别为国家食品质量监督检验测试中心(北
京)、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、
农业部作物品种资源监督检验测试中心、中国农业科学院
饲料研究所分析测试中心、农业部谷物品质监督检验测试
中心。按照国家标准[15]的规定对实验室间测定数据统计
分析(表 3)。可以看出, 参与比对的 5 家实验室通过柯克
伦检验、格拉布斯检验判定均为非异常, 回收率测定值在
80%~120%范围内, 重复性变异系数、重复性限和再现性
变异系数、再现性限在合理范围内, 表明本方法实验室间
重复性和再现性评价结果良好。
3 讨论
3.1 伏马毒素测定方法的建立
免疫亲和层析净化是一种用于分离、纯化抗原的色
谱技术, 其基本原理是将抗体键合到固定载体, 然后将含
有特异性抗原分子的样品提取液通过键合固定载体, 抗
原、抗体通过发生相互反应而达到分离、纯化抗原分子的
目的。近年来免疫亲和层析净化技术在伏马毒素、黄曲霉
毒素、单端孢霉烯等真菌毒素研究和应用领域不断扩展和
深入。本文采用该技术建立了高效液相色谱法测定玉米中
伏马毒素 B1和 B2的方法, 得出 FB1和 FB2线性范围分别
为 0.06~5.00 μg mL1和 0.04~2.50 μg mL1, 回收率分别为
76.6%~93.8%和 77.9%~93.4%, FB1和 FB2方法定量限分别
为 0.09 mg kg1和 0.06 mg kg1, 实验室内重复性变异系数
第 3期 李为喜等: 测定玉米中伏马毒素的免疫亲和层析净化高效液相色谱法 561


表 3 实验室间重复性和再现性评价结果
Table 3 Results of repeatability and reproductive test among different laboratories
类别 Type FB1 FB2
添加水平 Level (mg kg1) 0.4 1.2 0.2 0.6
测定平均值 Average results (mg kg1) 0.3480 1.070 0.1748 0.5454
平均回收率 Average recovery (%) 87.0 89.2 87.4 90.9
参加实验室数 No. of laboratories 5 5 5 5
可接受结果的试验室数 Accepted laboratories 5 5 5 5
重复性标准偏差(Sr) Repeatable SD (mg kg1) 0.0152 0.0483 0.0087 0.0249
重复性变异系数 Repeatable CV (%) 4.36 4.51 4.97 4.56
重复性限(r) [r=2.8×Sr] Repeatable limit (mg kg1) 0.0425 0.135 0.243 0.0696
再现性标准偏差(SR) Reproducible SD (mg kg1) 0.0175 0.0558 0.0101 0.0287
再现性变异系数 Reproducible CV(%) 5.03 5.21 5.74 5.26
再现性限(R) [R=2.8×SR] Reproducible limit (mg kg1) 0.0490 0.156 0.0281 0.0804
柯克伦检验统计量 Statistic of Cochran 0.354 0.611 0.403 0.435
柯克伦检验临界值 Critical value of Cochran 0.684 (5%)
0.788 (1%)
柯克伦检验判定结论 Judgement of Cochran 接受 Accepted 接受 Accepted 接受 Accepted 接受 Accepted
格拉布斯检验统计量(单值) Statistic of Grubbs (single) 1.604 (低值)
0.765 (高值)
1.110 (低值)
1.269 (高值)
1.311 (低值)
1.032 (高值)
1.517 (低值)
1.023 (高值)
格拉布斯检验临界值(单值) Critical value of Grubbs (single) 1.715 (5%)
1.764 (1%)
格拉布斯检验(单值)判定结论 Judgement of Grubbs (single) 接受 Accepted 接受 Accepted 接受 Accepted 接受 Accepted
格拉布斯检验统计量(双值) Statistic of Grubbs (double) 0.0255 (低值)
0.6224 (高值)
0.1609 (低值)
0.2238 (高值)
0.0522 (低值)
0.3775 (高值)
0.1679 (低值)
0.3175 (高值)
格拉布斯检验临界值(双值) Critical value of Grubbs (double) 0.0090 (5%)
0.0018 (1%)
格拉布斯检验(双值)判定结论 Judgement of Grubbs (double) 接受 Accepted 接受 Accepted 接受 Accepted 接受 Accepted

均低于 5%, 实验室间再现性变异系数低于 6%。统计数据
表明该方法的线性、准确度、精密度、同一实验室重复性
和多家实验室的再现性评价结果优良, 可作为国家或行业
标准方法实施, 从而为玉米的伏马毒素污染水平监控提供
了技术支撑。
3.2 玉米中伏马毒素污染状况初步分析
伏马毒素化学性质稳定, 即使在 100℃高温下蒸煮
30 min 也不能破坏其结构, 玉米在生长和存储过程中均
可受到伏马毒素污染。应用本文确定的方法对采集的 159
份大田玉米, 151 份储存玉米进行了伏马毒素 B1和 B2的
检测。结果表明, 大田玉米中检出 FB1的阳性样品为 112
份, 检出 FB2的阳性样品为 77份, FB1和 FB2同时检出的
样品 77 份, 检出率达到了 48.4%, 伏马毒素总量(FB1 与
FB2 之和)检出值范围为 0.20~9.06 mg kg1, 含量范围与
Massimo等[16]研究结果一致。储存玉米中检出 FB1的阳性
样品为 112份, 检出 FB2的阳性样品为 89份, FB1 和 FB2
同时检出的样品 89份, 检出率达到了 58.9%, 伏马毒素总
量检出值范围为 0.21~6.10 mg kg1, 含量范围与Radostina
等[5]、柳其芳等[17]研究结果一致。由此可见, 玉米中伏马
毒素的污染较为普遍。建议尽快制定我国玉米中伏马毒素
限量指标, 加强污染水平监控, 同时, 应加快相关栽培措
施研究、加大抗性品种的推广以抑制玉米镰刀菌的繁殖,
从而减少伏马毒素的污染, 保证人畜的健康。
致谢: 感谢以下单位在实验室比对试验中提供了热情的
帮助: 国家食品质量监督检验测试中心(北京)、中国农业
科学院农业质量标准与检测技术研究所、农业部作物品种
资源监督检验测试中心和中国农业科学院饲料研究所分
析测试中心。
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