全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(8): 1445−1450 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30700492), 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA100102), 国家科技支撑计划项目(2006BAD01A02),
引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目[2006-G2(B)], 公益性行业科研专项(NYHYZX07-002), “泰山学者”建设工程, 山东省农业良
种工程项目资助。
第一作者联系方式: E-mail: songjmsd@sina.com
Received(收稿日期): 2008-12-29; Accepted(接受日期): 2009-03-17.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01445
小麦胚乳 14-3-3蛋白的表达及其与淀粉体淀粉合成酶的互作
宋健民 1 戴 双 1 李豪圣 1 刘爱峰 1 程敦公 1 楚秀生 1 Ian J TETLOW2
Michael J EMES2
1山东省农业科学院作物研究所, 山东济南 250100; 2 University of Guelph, Guelph, N1G 2W1, Canada
摘 要: 从小麦胚乳中克隆了 14-3-3 基因 , 并将其分别插入 pET29c 和 pET41c 质粒 , 用热激法转化大肠杆菌
BL21-CodonPlus (DE3)-RP, 得到高效表达的蛋白, 但融合蛋白主要以包涵体的形式存在。可溶性的融合蛋白可直接
通过 S-蛋白琼脂糖树脂纯化。包涵体经 8 mol L−1尿素溶解变性, 稀释复性后, 结合到 S-蛋白琼脂糖树脂上, 也得到
纯化的融合蛋白。复性后的融合蛋白对蔗糖合酶活性表现抑制作用, 说明包涵体 14-3-3 融合蛋白恢复活性。将结合
14-3-3 融合蛋白的 S-蛋白琼脂糖树脂作为诱饵与小麦胚乳淀粉体提取液进行亲和杂交, 与 14-3-3 蛋白特异互作的淀
粉合成酶结合到 S-蛋白琼脂糖树脂上, Western 检测结果表明, 淀粉体淀粉合酶 I (SSI)、淀粉合酶 II (SSII)、淀粉分
支酶 Iia (SBEIIa)、淀粉分支酶 Iib (SBEIIb)和 ADP焦磷酸化酶大亚基 (SH2)与 14-3-3蛋白存在互作, 而淀粉分支酶
I (SBEI)、淀粉磷酸化酶(SP)、D-酶(DE)和 ADP焦磷酸化酶小亚基(BT2)不能与 14-3-3蛋白结合, 说明小麦胚乳 14-3-3
蛋白对淀粉体淀粉合成具有一定的调控作用。
关键词: 小麦 14-3-3蛋白; 表达; 淀粉合成酶; 蛋白互作
Expression of a Wheat Endosperm 14-3-3 Protein and Its Interactions with
Starch Biosynthetic Enzymes in Amyloplasts
SONG Jian-Min1, DAI Shuang1, LI Hao-Sheng1, LIU Ai-Feng1, CHENG Dun-Gong1, CHU Xiu-Sheng1, Ian J
TETLOW2, and Michael J EMES2
1 Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China; 2 University of Guelph, Guelph, N1G 2W1, Canada
Abstract: Wheat endosperm starch is the major determinant of grain yield and processing quality. The quality and quantity of
starch are controlled by a number of starch biosynthetic enzymes. 14-3-3 proteins, involved in many biological processes, are
ubiquitous and important regulators in all eukaryotic cells from yeast to mammals and plants. Protein-protein interactions between
a wheat endosperm 14-3-3 protein and starch biosynthetic enzymes from amyloplast were investigated in this study. A 14-3-3 gene
was cloned from developing wheat endosperm and inserted into plasmid vectors pET29c and pET41c. The recombinant vectors
were transformed into Escherichia coli strain BL21-CodonPlus (DE3)-RP and expressed at very high level. The fusion protein
existed mainly as an insoluble inclusion body after extraction by BugBuster Protein Extraction Reagent. The soluble fusion pro-
tein was purified by bounding to S-protein agarose, while the inclusion body should be dissolved in 8 mol L−1 urea and refolded
firstly. Sucrose synthase activity was observed to be inhibited by exogenous recombinant 14-3-3 protein in a dosage-dependent
manner, which suggested the refolded protein was successfully activated and could be used in the following research. The purified
recombinant 14-3-3 protein was bound to S-protein agarose as a biochemical bait, and then incubated with wheat amyloplast ex-
tract. Proteins interacting specifically with the 14-3-3 protein and remaining on the resin were analyzed by SDS-PAGE and West-
ern blot. These assays showed that starch synthase I (SSI), starch synthase II (SSII), starch branching enzyme IIa (SBEIIa), starch
branching enzyme IIb (SBEIIb), and ADP glucose pyrophosphorylase large subunit (SH2) interacted with 14-3-3 protein, whereas
1446 作 物 学 报 第 35卷

SBEI, starch phosphorylase (SP), D-enzyme (DE), and ADP glucose pyrophosphorylase small subunit (BT2) did not bind with the
14-3-3 protein. The results suggest a role for the wheat endosperm 14-3-3 protein in regulation of grain starch biosynthetic en-
zymes.
Keywords: Wheat 14-3-3 protein, Expression, Starch biosynthetic enzymes, Protein-protein interaction
14-3-3 蛋白是一种普遍存在于各种真核生物、
序列高度保守的非常重要的小分子调节蛋白, 对细
胞循环、信号传导、抗逆、细胞凋亡、转录调节、
细胞代谢等多种生理过程均有重要的调节作用[1]。
癌细胞中超过 200 种蛋白与 14-3-3 存在互作[2]。在
大麦叶片中发现 150 种蛋白受 14-3-3 的调控[3], 在
大麦胚乳中也检测到 54种蛋白受 14-3-3的调节[4]。
淀粉是植物中储量最丰富的碳水化合物, 也是
人类最重要的食物来源, 人类摄取的热量 80%源于
淀粉。另外, 淀粉的工业用途非常广泛, 需求量巨
大。淀粉广泛存在于植物各器官中, 但最主要的是
种子、球茎等储藏器官, 世界淀粉产量的 90%以上
来自谷物胚乳。淀粉约占小麦籽粒干重的 65%以上,
对籽粒产量起决定作用。同时, 淀粉的结构和组成、
理化特性对小麦食品和工业加工品质有重要影响 ,
而淀粉的合成主要受各种淀粉合成酶的控制[5]。
14-3-3 蛋白对淀粉代谢也有显著的调节作用 ,
许多淀粉合成酶与 14-3-3蛋白存在互作。反义抑制
淀粉粒结合的 14-3-3 蛋白导致叶片中淀粉的累积,
推测可能是 14-3-3蛋白与淀粉合酶(SS)III发生互作
[6]。转基因马铃薯中 14-3-3 蛋白含量下降, 蔗糖磷
酸合成酶、淀粉合成酶活性升高, 淀粉、蔗糖水平
也相应升高[7] ,说明 14-3-3 蛋白可能对淀粉合成有
调控作用。在大麦胚乳中 , 检测到 54 种蛋白与
14-3-3存在互作, 其中 16种为参与碳水化合物代谢
的酶 , 包括淀粉粒束缚淀粉合成酶(GBSS)、SSI、
SSII、淀粉分支酶(SBE)IIa, 而且这种互作是依赖磷
酸化的[4]。本文对克隆的小麦胚乳 14-3-3 基因在大
肠杆菌中进行了表达, 并对淀粉体中与其互作的淀
粉合成酶进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料种植
大田种植冬小麦(Triticum aestivum L.)品种济麦
20, 常规田间管理。选择花期一致和生长状况相近
的植株挂牌标记, 开花后 13~15 d 收获灌浆的籽粒,
小心用镊子去掉基部和顶部发育较慢的小穗和中部
小穗的中间籽粒, 只保留中部 5~7 个小穗两侧发育
较好的籽粒, 提取淀粉体。
1.2 淀粉体的分离和纯化
参考 Tetlow 等[8]的方法分离和纯化淀粉体, 每
80~100 g鲜籽粒作为一组。完整的淀粉体加预冷的
裂解缓冲液(100 mmol L−1 Tricine/KOH, pH 7.8, 1
mmol L−1 Na2-EDTA, 1 mmol L−1 DTT, 5 mmol L−1
MgCl2, 1单位蛋白酶抑制剂)裂解, 于 4℃下 14 000×
g离心 5 min除去淀粉粒, 上清液经 120 000×g离心
15 min 去除质体膜和其他杂质, 液氮迅速冷却后,
于−70℃保存备用。
1.3 蔗糖合成酶活性测定
参考 Zeng等[9]的方法测定酶活性。
1.4 14-3-3蛋白的表达
对克隆的小麦胚乳 14-3-3基因酶切后分别连接
到 pET29c(含 S-Tag)和 pET41c(含 His、S、GST-Tags)
上, 用热激法转化感受态的大肠杆菌 BL21-Codon-
Plus (DE3)-RP(Novagen), 涂含卡那霉素的 LB 琼脂
板, 37℃培养过夜, 挑取单克隆菌落于含 50 μg mL−1
卡那霉素的液体 LB培养基中, 37℃、250 r min−1振
荡培养至 A600约 0.6, 加入 IPTG 至终浓度 1 mmol
L−1, 继续培养 3 h。4℃ 4 000×g离心 20 min收集培
养细胞。将沉淀用 1×PBS悬浮, 4℃下 4 000×g离心
15 min, 弃上清液, 再用 1×PBS 洗涤一次沉淀。洗
涤后的沉淀经 BugBuster 蛋白提取试剂盒(Novagen)
裂解细胞, 4℃下 16 000×g离心 20 min, 可溶性的重
组蛋白保留在上清液中, 不溶性的重组蛋白沉淀下
来, 电泳检测, 操作方法参考 BugBuster蛋白提取试
剂盒说明书。
1.5 14-3-3融合蛋白的纯化与亲和杂交层析柱的
制备
参考说明书, 采用 S-蛋白纯化试剂盒(Novagen)
纯化融合蛋白 , 与亲和杂交层析柱的制备结合进
行。可溶性的重组蛋白直接结合到 S-蛋白琼脂糖树
脂上 , 洗去非特异性结合的杂质即可得到只有
14-3-3 融合蛋白结合的亲和层析柱。包涵体里的重
组蛋白先经 8 mol L−1尿素变性液溶解后, 逐步缓慢
稀释降低尿素浓度至 2 mol L−1, 然后逐滴滴到复性
缓冲液中复性, 加入 S-蛋白琼脂糖树脂温育结合,
第 8期 宋健民等: 小麦胚乳 14-3-3蛋白的表达及其与淀粉体淀粉合成酶的互作

1447


洗去杂质得到亲和层析柱。
1.6 亲和杂交检测(Pulldown)
取结合 14-3-3融合蛋白的 S-蛋白琼脂糖树脂 100
μL, 加 1.5% BSA 500 μL旋转温育封闭 1 h, 弃去多余
的 BSA, 加入 250 μL淀粉体提取液, 室温下旋转混合
2 h使14-3-3蛋白与互作的淀粉合成酶充分作用, 加入
200 μL稀盐冲洗缓冲液(20 mmol L−1 Tris-HCl, pH 7.5,
150 mmol L−1 NaCl, 0.1% Triton X-100)洗去非特异性
结合的蛋白/酶, 与14-3-3特异结合的淀粉合成酶与S-
蛋白琼脂糖树脂一起保留在层析柱内, 加入 200 μL冲
洗缓冲液和 100 μL SDS上样缓冲液, 95℃下煮 7 min
则结合的蛋白从 S-蛋白琼脂糖树脂分离下来, 电泳检
测。同样, 以 100 μL未结合 14-3-3蛋白的 S-蛋白琼脂
糖树脂作空白。
1.7 SDS-PAGE和Western blot
蛋白通过 SDS-PAGE 分离, 用考马斯亮蓝染色
或银染; Western检测将 SDS-PAGE分离的蛋白转印
到硝酸纤维膜(Bio-Rad)上, 1.5% BSA封闭, 然后用
相应的抗体检测[8]。
1.8 淀粉合成酶的抗体制备
S-Tag抗体购自 Novagen。淀粉合成酶抗体根据
相应酶 N端氨基酸序列制备[8,10-13]。
1.9 蛋白含量测定
采用 Bio-Rad 蛋白试剂盒测定重组蛋白和淀粉
体提取液蛋白质含量, 操作方法参考说明书。
2 结果与分析
2.1 14-3-3融合蛋白的表达、纯化
小麦胚乳 14-3-3 基因插入 pET29c 和 pET41c 质
粒后, 在大肠杆菌 BL21-CodonPlus (DE3)-RP 中均得
到大量表达(图 1)。根据基因测序得到的氨基酸序列计
算, 14-3-3蛋白的分子量为 29 kD左右, 加上表达质粒
中的标签蛋白, 在 pET29c (S-Tag)中表达的融合蛋白
分子量约为 30 kD, 在 pET41c (GST、His和 S-Tag)中
的表达产物约为 60 kD, 与 SDS-PAGE 检测的结果一
致。提取质粒, 对插入 14-3-3基因序列的质粒 DNA进
行测序, 结果也表明 14-3-3基因正确地插入表达质粒。
S-Tag大小只有 1 kD左右, 对 14-3-3融合蛋白结构和

图 1 14-3-3重组蛋白在大肠杆菌中的表达
Fig. 1 Expression of recombinant 14-3-3 protein in E. coli
A: SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色; B: S-tag抗体 Western blot。箭头所指为表达的重组蛋白。M: 蛋白质分子量标准; 1~3质粒为 pET29c,
4~6质粒为 pET41c; 1、4: 空质粒(对照); 2、5: 可溶性的重组蛋白; 3、6: 不溶性的重组蛋白。
A: coomassie staining after SDS-PAGE; B: Western blotting with S-tag antibody. Recombinant 14-3-3 proteins are shown by arrows.
M: protein molecular weight marker; 1–3 pET29c as vector; 4–6 pET41c as vector. 1 and 4: empty vector (control); 2 and 5: soluble recom-
binant protein; 3 and 6: insoluble recombinant protein.

功能影响非常小, 因此下面的研究都以 pET29c 中表
达的 30 kD融合蛋白作为试验材料。
尽管融合蛋白在大肠杆菌中得到了大量表达 ,
但约 80%融合蛋白是不溶性的(图 1), 以包涵体的形
式存在。而包涵体中的融合蛋白是没有活性的, 只
有将其溶解后, 进行复性才有可能得到具有活性的
蛋白, 从而进行相应的研究。
14-3-3 融合蛋白的纯化与亲和层析柱的制备结
合进行, 将可溶性的表达蛋白直接与 S-蛋白琼脂糖
树脂温育, 则携带 S-Tag 的融合蛋白与树脂特异性
结合, 其他杂质则从层析柱上洗脱下来, 得到了纯
化的融合蛋白(图 3泳道 1), 银染结果表明纯度非常
高。将纯化的融合蛋白从电泳胶上切下, 质谱分析
表明, 14-3-3基因正确插入到表达质粒中, 融合蛋白
得到正确表达。
2.2 14-3-3复性融合蛋白的活性检测
蔗糖合酶是参与蔗糖合成的关键酶, 有证据表
明 14-3-3 蛋白对其有调控作用, 至于是促进还是抑
制作用, 到目前为止还没有统一的实验结果, 推测
可能是由于结合位点的不同所致[14-15]。为了检测复
1448 作 物 学 报 第 35卷

性后的融合蛋白是否恢复活性, 参考前人的研究探
讨了 14-3-3蛋白对蔗糖合酶活性的影响(图 2)。可以
看出, 随着反应体系中 14-3-3融合蛋白体积的增加,
蔗糖合酶活性呈明显下降的趋势 , 但反应体系中
14-3-3融合蛋白体积超过 100 μL后, 酶活性下降幅
度显著缩小, 可能底物已经基本饱和。而 BSA对酶
活性没有影响, 说明复性后的蛋白具有活性, 可以
用于与淀粉合成酶互作的研究。

图 2 14-3-3复性蛋白对蔗糖合酶活性的影响
Fig. 2 Effect of refolded 14-3-3 recombinant protein on
sucrose synthase activity
2.3 14-3-3蛋白与淀粉合成酶的互作
从花后 13~15 d 的籽粒提取完整的淀粉体, 然
后从中提取淀粉体淀粉合成酶。将提取液通过结合
14-3-3 重组蛋白的层析柱进行亲和杂交, 电泳进行
Western检测(图 3)。结果表明, BSA(空白)不能和淀
粉合成酶结合(泳道 2), 但是一些淀粉合成酶结合在
14-3-3重组蛋白层析柱上(泳道 3), 说明 14-3-3蛋白
与淀粉合成酶之间存在互作。分别用 9 种淀粉体淀
粉合成酶抗体进行了检测, 发现 SSI、SSII、SBEIIa、
SBEIIb和 ADP焦磷酸酶大亚基(SH2)与 14-3-3蛋白
存在互作, 而 SBEI、SP、DE和 AGPase小亚基(BT2)
不能结合到 14-3-3重组蛋白层析柱上(数据未给出)。
3 讨论
蛋白的体外表达目前已成为研究蛋白结构、互
作的基本方法。由于操作简单、方便、成本低廉和
便于大规模培养, 大肠杆菌表达体系成为蛋白表达
的首选。与其他表达体系一样, 融合蛋白的溶解性
一直是困绕蛋白表达的瓶颈, 据统计大肠杆菌中表
达的融合蛋白仅有 13%~23%是可溶性的, 尽管改变

图 3 14-3-3重组蛋白与淀粉合成酶的互作
Fig. 3 Interaction between recombinant 14-3-3 protein and starch biosynthetic enzymes
M: 蛋白质分子量标准; 1: 14-3-3重组蛋白结合到 S-蛋白琼脂糖树脂上; 2: BSA亲和层析(空白对照);
3: 14-3-3重组蛋白亲和层析; 4: 小麦胚乳淀粉体提取液。
M: protein molecular weight marker; 1: recombinant 14-3-3 bound to S-protein agarose; 2: BSA pulldown (control); 3: recombinant 14-3-3
protein pulldown; 4: wheat amyloplast extract.
第 8期 宋健民等: 小麦胚乳 14-3-3蛋白的表达及其与淀粉体淀粉合成酶的互作

1449


培养条件可以在一定程度上提高表达蛋白的溶解性,
但也有相反的报道, 所以彻底解决溶解性问题很困
难[16]。本研究在大肠杆菌中表达了小麦胚乳 14-3-3
蛋白, 但主要以包涵体的形式存在。前人也进行了
14-3-3 蛋白的体外表达, 但研究用的融合蛋白多是
可溶性的, 溶解性如何没有报道。我们也尝试了改
变培养条件, 如降低温度、调整培养时间、改变 IPTG
诱导浓度和起始点、培养基中添加葡萄糖、更换大
肠杆菌菌株等, 但效果不大。研究表明, 与小分子伴
侣蛋白共表达可以有效地提高融合蛋白的溶解性[16-17],
我们更换了表达质粒, 与 pET29c质粒相比, pET41c
质粒中增加了 GST-Tag。虽然有学者认为该标签可
以提高表达蛋白的溶解性[16-17], 但本试验中效果不
明显(图 1)。这可能与 14-3-3蛋白的来源有关, 前人
表达的 14-3-3 蛋白多数来源于动物, 也有一部分来
源于某些植物, 但来源于小麦的尚未见报道。
14-3-3 蛋白是广泛存在于各类真核生物的重要
调节蛋白, 几乎参与了所有生命过程的调节。不同
的学者用不同的方法研究了 14-3-3蛋白与植物蛋白
/酶之间的互作, 包括免疫共沉淀、酵母双杂交系统、
化学交联等 [14-15,18], 本文展示了一种不同的亲和杂
交方法。免疫共沉淀是一种比较传统和经典的蛋白
互作检测方法, 结果具有高度特异性, 但获得某些
蛋白高特异性和亲和力的抗体比较困难, 因而限制
了其应用。酵母双杂交系统具有高通量的特点, 但
容易产生假阳性信号。化学交联剂对检测比较弱和
临时性的互作比较有效, 但交联剂本身有时会对互
作产生影响[19]。与其他方法相比, 该方法具有操作
简便、结果准确的特点, 但也有不足。如当冲洗液
中盐的浓度升高时, 有可能将结合或互作较弱的蛋
白洗掉, 而浓度太低又会导致信号噪音, 因此操作
过程中控制盐的浓度非常重要。
Alexander等[4]通过亲和层析方法发现 14-3-3蛋
白与 GBSS、SSI、SSII 和 SBEIIa 存在互作, GBSS
存在于淀粉粒上, 负责直链淀粉的合成, 我们也用
GBSS抗体进行了检测, 没有发现信号, 原因可能是
该时期淀粉体中不存在 GBSS 或其含量非常少。
Kosar-Hashemi等[21]研究表明, 花后 13~15 d, GBSS
在淀粉体中主要以与淀粉粒结合的形式存在, 而可
溶性的 GBSS 只存在于籽粒发育的早期。另外, 本
研究发现 SBEIIb和 SH2也与 14-3-3蛋白存在互作,
这在以前的研究中没有报道。14-3-3 与其调控的蛋
白作用一般是依赖磷酸化的[1,4,15], Tetlow 等[8,13]发
现小麦叶绿体和淀粉体中 SSI、SSII、SBEI、SBEII
和淀粉磷酸化酶可以形成依赖磷酸化的蛋白复合体,
玉米中也发现了类似的情况[20], 这从另一个方面说
明它们与 14-3-3之间存在互作关系。
4 结论
从小麦胚乳中克隆了 14-3-3 基因, 并分别插入
pET29c 和 pET41c 质粒, 转化大肠杆菌, 得到高效
表达。融合蛋白主要以包涵体的形式存在, 可溶性
的融合蛋白可以通过 S-蛋白琼脂糖树脂纯化。纯化
复性后的融合蛋白对蔗糖合酶活性表现抑制作用 ,
对淀粉体淀粉合成具有一定的调控作用。
References
[1] Aitken A. 14-3-3 proteins: A historic overview. Semin Cancer
Biol, 2006, 16: 162−172
[2] Pozuelo-Rubio M, Geraghty K M, Wong B H, Wood N T,
Campbell D G, Morrice N, Mackintosh C. 14-3-3-affinity purifi-
cation of over 200 human phosphoproteins reveals new links to
regulation of cellular metabolism, proliferation and trafficking.
Biochem J, 2004, 379: 395−408
[3] Schoonheim P J, Veiga H, da Costa Pereira D, Friso G, van Wijk
K J, de Boer A H. A comprehensive analysis of the 14-3-3 inter-
actome in barley leaves using a complementary proteomics and
two-hybrid approach. Plant Physiol, 2007, 143: 670−683
[4] Alexander R D, Morris P C. A proteomic analysis of 14-3-3
binding proteins from developing barley grains. Proteomics,
2006, 6: 1886−1896
[5] Tetlow I J. Understanding storage starch biosynthesis in plants: A
means to quality improvement. Can J Bot, 2006, 84: 1167−1185
[6] Sehnke P C, Chung H J, Wu K, Ferl R J. Regulation of starch
accumulation by granule-associated plant 14-3-3 proteins. Proc
Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 765−770
[7] Zuk M, Weber R, Szopa J. 14-3-3 protein down-regulates key
enzyme activities of nitrate and carbohydrate metabolism in po-
tato plants. J Agric Food Chem, 2005, 53: 3454−3460
[8] Tetlow I J, Wait R, Lu Z, Akkasaeng R, Bowsher C G, Esposito S,
Kosar-Hashemi B, Morell M K, Emes M J. Protein phosphoryla-
tion in amyloplasts regulates starch branching enzyme activity and
protein-protein interactions. Plant Cell, 2004, 16: 694−708
[9] Zeng Y, Wu Y, Avigne W T, Koch K E. Differential regulation of
sugar-sensitive sucrose synthases by hypoxia and anoxia indicate
complementary transcriptional and posttranscriptional responses.
Plant Physiol, 1998, 116: 1573−1583
[10] Li Z, Rahman S, Kosar-Hashemi B, Mouille G, Appels R, Morell
M K. Cloning and characterization of a gene encoding wheat
starch synthase I. Theor Appl Genet, 1999, 98: 1208−1216
[11] Rahman S, Regina A, Li Z, Mukai Y, Yamamoto M, Ko-
1450 作 物 学 报 第 35卷

sar-Hashemi B, Abrahams S, Morell M K. Comparison of
starch-branching enzyme genes reveals evolutionary relation-
ships among isoforms. Characterization of a gene for starch-
branching enzyme IIa from wheat D genome donor Aegilops
tauschii. Plant Physiol, 2001, 125: 1314−1324
[12] Regina A, Kosar-Hashemi B, Li Z, Pedler A, Mukai Y, Yama-
moto M, Gale K, Sharp P J, Morell M K, Rahman S. Starch
branching enzyme IIb in wheat is expressed at low levels in the
endosperm compared to other cereals and encoded at a
non-syntenic locus. Planta, 2005, 222: 899−909
[13] Tetlow I J, Beisel K G, Cameron S, Makhmoudova A, Liu F,
Bresolin N S, Wait R, Morell M K, Emes M J. Analysis of pro-
tein complexes in wheat amyloplasts reveals functional interac-
tions among starch biosynthetic enzymes. Plant Physiol, 2008,
146: 1878−1891
[14] Toroser D, Athwal G S, Huber S C. Site-specific regulatory in-
teraction between spinach leaf sucrose-phosphate synthase and
14-3-3 proteins. FEBS Lett, 1998, 435: 110−114
[15] Moorhead G, Douglas P, Cotelle V, Harthill J, Morrice N, Meek
S, Deiting U, Stitt M, Scarabel M, Aitken A, MacKintosh C.
Phosphorylation-dependent interactions between enzymes of
plant metabolism and 14-3-3 proteins. Plant J, 1999, 18: 1−12
[16] Esposito D, Chatterjee D K. Enhancement of soluble protein ex-
pression through the use of fusion tags. Curr Opin Biotech, 2006,
17: 353−358
[17] Waugh D S. Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol,
2005, 23: 316−320
[18] Pnueli L, Gutfinger T, Haraven D, Ben-Naim O. Tomato SP-inter-
acting proteins define a conserved signaling system that regulates
shoot architecture and flowering. Plant Cell, 2001, 13: 2687−2702
[19] Miernyk J A, Thelen J J. Biochemical approaches for discovering
protein–protein interactions. Plant J, 2008, 53: 597−609
[20] Hennen-Bierwagen T A, Liu F, Marsh R S, Kim S, Gan Q, Tet-
low I J, Emes M J, James M G, Myers A M. Starch biosynthetic
enzymes from developing maize endosperm associate in multi-
subunit complexes. Plant Physiol, 2008, 146: 1892−1908
[21] Kosar-Hashemi B, Li Z, Larroque O, Regina A, Yamamori M,
Morell M K, Rahman S. Multiple effects of the starch synthase II
mutation in developing wheat endosperm. Funct Plant Biol, 2007,
34: 431−438