全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(7): 1253−1263 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-22-ZJ0103), 重庆市蚕桑重大科技专项(CSTC, 2009AA1024)和国家自然青年科
学基金(31101769)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 余茂德, E-mail: yumd@163.com, Tel: 023-68250191
第一作者联系方式：E-mail: noscjoey@yahoo.cn
Received(收稿日期): 2011-06-13; Accepted(接受日期): 2012-04-28; Published online(网络出版日期): 2012-05-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120511.1816.030.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01253
桑树花青素合酶基因的克隆与信息学分析
张琼予 李 军 赵爱春 王茜龄 金筱耘 李镇刚 余茂德*
家蚕基因组生物学国家重点实验室 / 西南大学生物技术学院, 重庆北碚 400715
摘 要: 花青素合酶 ANS 是花青素合成过程中的一个关键限速酶。本文利用同源克隆、RT-PCR 从桑椹中克隆出花
青素合酶(MaANS)基因, 并进行生物信息学分析和组织特异性表达分析。通过染色体步移法获得的 MaANS基因的 5′
端和 3′端, 获得基因全长 1 535 bp, 由 2个外显子和 1个内含子组成,包含完整 CDS区域为 1 077 bp, 编码 358个氨基
酸, 与来源于草莓、甘薯、苹果、沙梨的 ANS基因同源性均达到 80%以上。MaANS编码的蛋白质属于 2-酮戊二酸双
加氧酶家族。MaANS 在进化树中的位置与草莓最近,与苹果、沙梨次之。组织表达分析表明, MaANS 基因在幼叶和
成熟果实中高水平表达, 表明该基因的表达具有组织特异性, 为研究桑树果色的形成原因和表达调控奠定了基础。
关键词: 桑树; 花青素合酶(ANS); 克隆; 信息分析; 组织表达
Molecular Cloning and Information Analysis of ANS Genes Encoding Antho-
cyanin Synthases from Mulberry (Morus alba)
ZHANG Qiong-Yu, LI Jun, ZHAO Ai-Chun, WANG Xi-Ling, JIN Xiao-Yun, Li Zhen-Gang, and YU Mao-De*
State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology / College of Biotechnology, Southwest University, Beibei 400715, China
Abstract: Anthocyanidin synthase (ANS, leucoanthocyanidin oxygenase) is one of the critical enzymes in the biosynthesis of the
anthocyanin. Anthocyanidin synthase gene fragment (designated as MaANS) was isolated from mulberry fruit (Moru alba) by
RT-PCR based on homology cloning and genome walking technology. MaANS with the 5′ and 3′ was cloned by genome-walking.
The full-length genomic sequence of MaANS is 1 535 bp, which consists of two exons and one intron. The coding region length
was 1 077 bp, and their deduced protein consisted of 358 amino acid residues. Multiple alignments revealed that the nucleic acid
of MaANS shared above 80% identity with that of Fragaria × ananassa, Ipomoea batatas, Malus domestica, and Pyrus pyrifolia.
Structural analysis showed that the MaANS protein might belong to the 2 OG and Fe(II)-dependent oxygenase family. Phyloge-
netic tree analysis revealed that MaANS was the most close with Fragaria × ananassa, then Malus domestica and Pyrus pyrifolia.
Reverse transcription-PCR (RT-PCR) analyses of MaANS transcripts showed that it was abundantly expressed in the young leaves
and ripened fruit. All research made an essential foundation for pathway and regulation of gene expression in anthocyanin bio-
synthesis in mulberry fruit.
Keywords: Mulberry; Anthocyanin synthase; Cloning; Information analysis; Tissues expression
桑树(Morus alba)是重要的经济作物, 其叶可以
饲养家蚕, 其果可以供人们食用。尤其是桑椹(果)
含有丰富的营养成分及香醇甘甜的口感而赢得人们
的喜爱。决定桑椹果色的花青素(Anthocyanins)是次
生代谢过程中产生的类黄酮物质, 为植物中的水溶
性天然色素, 使植物呈现红、紫、深蓝、浅粉等颜
色[1]。花青素主要的生理功能是它能清除自由基, 具
有抗氧化的作用, 研究证明其抗氧化能力比 VE 高
50倍, 比 VC高 20倍[2-3], 同时具有改善人视力的功
能, 在提高整体视觉和夜视上有一定功效[4-6]。目前
报道花青素含量最丰富的植物为蓝莓和桑椹, 高丛
蓝莓浆果中花色素的含量为 73~430 mg 100 g–1 [7];
桑椹中花青素含量可达到 221 mg 100 g–1 [8]。为此,
研究桑树中控制桑椹花青素合成的关键酶基因结构
及生物学信息具有重要意义。
花青素合酶(anthocyanidin synthase, ANS, 又称
1254 作 物 学 报 第 38卷

leucoanthocyanidin dioxygenase, LDOX, EC 1.14.11.
19), 是花青素合成途径中的关键限速酶之一, 它催
化无色花色素包括无色天竺葵素、无色翠雀素和无色
矢车菊素分别转化为有色天竺葵素(pelargonidin)、
翠雀素(delphinidin)和矢车菊素(cyanidin)[9]。花青素
合酶 ANS基因首先采用转座子标签技术从玉米中分
离出来[10], 之后又先后从金鱼草和矮牵牛中分离出
来 [11-12], 后又从紫苏 (Perilla frutescens)[13]、苹果
(Malusx pumila)[14]、银杏(Ginkgo biloba)[15]、越橘
(Vaccinium myrtillus)[16]、甘薯(Ipomoea batatas)[17]、
棉花 (Gossypium hirsutum)[18]、莴苣 (Lactuce in-
dica)[19]、洋葱(Allium cepa)[20]和拟南芥(Arabidopsis
thaliana)[21]等植物中分离得到。
多年来国内外主要集中于模式植物的花青素生
理功能和合成途径中关键酶基因的克隆及功能分析,
而关于木本植物中花青素代谢途径的研究相对较少,
桑椹中花青素含量颇高, 可作为研究木本植物花青
素代谢途径的较佳材料。本文拟克隆桑椹花青素合
酶基因并对其进行生物信息学研究、系统进化分析
以及组织表达特异性分析, 以期为桑椹果色形成原
因和表达调控的分子机制研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
材料取自于西南大学桑树种质资源圃中的嘉陵
30 桑椹, 该品种为西南大学生物技术学院桑树资源
与育种研究室近期育成, 并通过重庆市品种审定的
果叶兼用人工多倍体桑品种。选取成熟桑椹, 用液
氮速冻后保存于–80℃冰箱中备用。
质粒载体 pMD19 simple vector、Taq DNA聚合
酶、反转录酶 M-MLV、T4 DNA 连接酶均购自
TaKaRa公司, 胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自
Omega公司。基因组提取试剂盒 Plant mini kit购自
QIAGEN 公司。试验所用限制性内切酶购自
Fermentas 公司。引物(表 1)由南京金斯瑞公司合成,
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 DH5a购自上海生物
工程公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 引物设计与合成
在 GenBank 数据库中进行检索, 根据已经报道
的其他植物的 ANS 基因保守序列 , 通过 ClustalX
2.0.12 (http://www.clustal.org/)软件进行氨基酸的多
序列比对, 根据比对结果找到保守区域, 利用软件
Primer 5.0 (http://www.primer-e.com/)设计兼并引物
F1、R1, 根据已经报道的接头序列[22]GenomeWalker
Adaptor1、Adaptor2设计接头引物 AP1、AP2, 根据
F1与 R1扩增获得的 MaANS基因组序列设计上、下
游步移特异引物 ANS_up GSP1、ANS_up GSP2、
ANS_down GSP1、ANS_down GSP2, 根据获得的
MaANS 基因全长序列设计 RT-PCR 引物 ANS-F 和
ANS-R, 以及基因全长克隆引物 ANS-2F和 ANS-2R,
序列中加粗的碱基为起始密码子 ATG 及终止密码
子 TAA。根据已经报道的肌动蛋白基因 MaACT3序
列(GenBank 登录号为 HQ163775.1)设计 ACT3-F 和
ACT3-R (表 1)。

表 1 本研究中使用的引物
Table 1 Primers used in our study
引物名称 Primer 序列 Sequence (5′–3′)
F1 GA(G/C)TGGGGTGT(G/C)ATGCA
R1 GCAAA(A/G)GTGCG(A/T)GG(A/T)GG
ANS-F TTGTGGGCAGCTTGAGTG
ANS-R GAGATCCTCACCTTCTCCTTG
Adaptor1 GTAATACGACTCACTATAGGGCACG
CGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT
Adaptor2 NH2-ACCAGCCC-PO4
AP1 TCTGTGAGGTCACGTCCAGC
AP2 TTGCCTTGGACTACGAGCAGG
ANS_up GSP1 GTGTCTTGGGCCAAATGGAC
ANS_up GSP2 CACAAGCATTGTTTGCGAGC
ANS_down GSP1 CAAGGAGAAGGTGAGGATCT
ANS_down GSP2 TGCGAACCGCCAAAGGAGAA
ACT3-F CTCCGTTTGGATCTTGCAG
ACT3-R TCTCATGGATACCAGCAGTT
ANS-2F ATGGTGATCTCTGTGGCTCCA
ANS-2R TTATTTGGAAATTCTGTTGCT

1.3 桑树总 RNA提取
取 50 mg桑椹新鲜组织于预冷的研钵中加液氮
迅速研磨成粉末状, 参照 TaKaRa公司 RNA抽提试
剂盒说明书操作提取总 RNA, 最后用 50 μL DEPC
水溶解 RNA, 0.8%琼脂糖变性凝胶电泳检测后, 紫
外分光光度计测定浓度。以总 RNA为模板, 以 Oligo
d(T)18 为引物, 利用 M-MLV 反转录酶合成 cDNA
第 1链, 置–80℃保存备用。
1.4 MaANS核心片段的克隆
采用 Reverse Transcriptase M-MLV第 1链 cDNA
合成试剂盒(TaKaRa)合成 cDNA。以合成的 cDNA
第 1链为模板, 扩增 MaANS基因保守序列。PCR反
应体系(25 μL): 10×PCR buffer (含 Mg2+) 2.5 μL,
10 mmol L–1 dNTP混合物 1 μL, 10 mmol L–1上下游
引物各 1 μL, 5 U μL–1 Taq DNA聚合酶 0.2 μL, RT混
合物 1 μL, ddH2O 17.3 μL。PCR扩增程序为: 94℃预
变性 4 min; 94℃变性 30 s, 53℃退火 30 s, 72℃延伸
第 7期 张琼予等: 桑树花青素合酶基因的克隆与信息学分析 1255


90 s, 共 30个循环; 72℃延伸 10 min; 4℃保存。反应
结束后用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物。用
Omega凝胶回收试剂盒回收 PCR扩增产物, 回收产
物连接到 pMD19-T Simple Vector上, 连接产物转化
到大肠杆菌 DH5α感受态细胞中, 并进行 Amp抗性
和 X-gal/IPTG蓝白斑筛选。随机挑选 10个阳性单菌
落进行 LB液体培养, 强碱法提取质粒[23]。质粒经检
测后送金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。
1.5 MaANS基因两端序列的克隆
桑树基因组DNA的提取采用改进的 SDS法[24]。
取 200 mg幼嫩组织于预冷的研钵中, 加入液氮研磨
成粉状, 加入 1 mL的提取缓冲液(0.4 mol L–1 NaCl;
10 mmol L–1 Tris-HCl, pH 8.0; 2 mmol L–1 EDTA, pH
8.0)混匀, 加入 20% SDS 100 μL, 10 mg mL–1的蛋白
酶 K 8 μL, 充分混匀; 55℃保温 45 min以上; 加入
750 μL–1 6 mol L–1 NaCl充分混匀; 在 4℃用 10 000×
g离心力离心 30 min, 取上清; 加入 0.7倍的异丙醇,
充分混匀, 于–20℃静置 1 h; 用灭菌牙签挑出白色
絮状物, 70%的乙醇洗 2次, 自然干燥; 加入适量 TE
溶解, 取 2 μL用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测, 并用
紫外分光光度计检测 DNA的浓度。
桑树基因组酶切。用产生平末端的 5 个限制性
内切酶 Dra I、PshB I、Pvu II、Sma I和 Hae III在
100 μL体系中完全酶切大约 2 μg基因组 DNA。
酶切纯化: 每管加入与酶切体系等体积的 1∶1
比例的苯酚∶氯仿, 充分混匀; 13 000×g离心 5 min,
轻轻吸取上清; 加入 1/10 上清体积的 NaAc (3 mol
L–1, pH 5.2), 2.5 倍体积无水乙醇, 充分混匀, 室温
静置 10 min; 15 000×g (换算成离心力)、4℃离心 10
min, 弃上清; 加入 6倍体积 80%乙醇, 20 000×g、4℃
离心 5 min, 弃上清; 尽量吸干液体, 自然干燥, 最
后将沉淀溶于 20 μL TE (pH 7.5)中。
酶切纯化后的基因组DNA与Adaptors连接: 从
每管酶切纯化后的基因组中取 4 μL DNA于 0.5 mL
离心管, 依次加入以下组分: GenomeWalker Adap-
tors 1.9 μL, 10×连接缓冲液 1.6 μL和 T4 DNA 0.5 μL,
16℃水浴过夜(16 h), 70℃水浴 5 min停止反应, 每
管加入 72 μL TE (pH 7.5), 低速涡漩 5~10 s, –20℃保
存 , 构建成步移需要的与特异接头(GenomeWalker
Adaptor)连接的相应限制性内切酶的 5个 DNA“库”。
GenomeWalker文库步移 PCR克隆MaANS的 3′
端和 5′端。共进行两轮基因组步移, 分别从 5 个接
头连接的 DNA“库”取 2 μL做模板, 第 1 轮 PCR 体
系: 10×buffer (含Mg2+) 2.5 μL, 2.5 mmol L–1 dNTPs 1
μL, AP1接头引物 1 μL, GSP1特异引物 1 μL, 5 U
μL–1 Taq酶 0.2 μL。扩增条件: 94℃ 4 min; 94℃ 30 s,
50℃ 30 s, 72℃ 2.5 min, 共 30个循环; 72℃ 10 min;
4℃保存。第 2 轮 PCR 体系: 第 1 轮反应产物 1 μL
做模板, 10×buffer (含 Mg2+) 2.5 μL, 2.5 mmol L–1
dNTPs 1 μL, AP2 1 μL, GSP 2 1 μL, 5 U μL–1 Taq酶
0.2 μL。扩增条件: 94℃ 4 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s,
72℃ 2.5 min, 共 30个循环; 72℃ 10 min; 4℃保存。
每管取 3 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。
将第 2 轮扩增产物的检测条带切胶回收 , 与
pMD19-T连接, 转化大肠杆菌 E. coli DH5α感受态
细胞, 在含 Amp+的 LB 抗性平板上进行筛选, 随机
挑取 10 个白色菌落, 强碱法提取质粒[23], 经检测后
送金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。
1.6 桑树MaANS全长的获得以及生物信息学分析
将桑树 MaANS 核心区基因组序列与获得的 3′
端和 5′端序列进行拼接, 通过 NCBI 的 BlastX 比对
发现包含完整的MaANS编码区, 并由此设计基因全
长克隆引物 ANS-2F和 ANS-2R, 通过对 cDNA及基
因组的扩增分别获得 MaANS 的 CDS 区域以及基因
组片段。结合 NCBI上已经报道的植物 ANS基因, 分
析本实验获得的 MaANS基因的序列结构。运用核酸
序列分析软件 Genetyx version 7、BioEdit 和 NCBI
数据库分析基因片段的核心结构域, MEGA4分析桑
树中的花青素合酶基因与其他植物之间的进化关系,
利用在线软件 SOPMA[25]和 QMEAN[26-27]预测花青
素合酶的二级结构和三级结构。
1.7 花青素合酶基因组织特异性表达分析
根据本实验获得的MaANS全长序列, 设计引物
ANS-F和ANS-R (表 1), 扩增片段大小为 500 bp, 以
已经克隆得到的桑树肌动蛋白 MaACT3[28]为内参,
通过 RT-PCR检测 MaANS基因在根、茎、叶、果实
等组织中的表达情况。
2 结果与分析
2.1 桑树花青素合酶基因(MaANS)的克隆
按照 TaKaRa的 RNA抽提试剂盒说明书提取桑
椹的总 RNA。经过电泳检测(图 1), 28S rRNA和 18S
rRNA 的亮度比接近 2∶1, 总 RNA 波长在 260 nm
和 280 nm处吸光度比值为 2.0, 表明提取的总 RNA
完整性较好、纯度较高, 可用于后续反应。根据 ANS
保守序列设计的兼并引物 F1和 R1, 以总 RNA反转
录得到的 cDNA为模板进行 PCR扩增最终得到预期
1256 作 物 学 报 第 38卷

大小的条带(图 2), 片段长约 800 bp。随机挑取 10
个阳性克隆测序, 经序列比对其中包括了 3个不同的
ANS 基因片段, 但片段之间仅存在单碱基替换, 因
此可能是同一个基因 , 在此命名为 MaANS, 并在
NCBI上注册, 登录号为 JF499384。



图 1 桑椹总 RNA电泳检测
Fig. 1 Detection of total RNA of mulberry fruit
M: Trans 2000; 1~2: 嘉陵 30桑椹总 RNA。
M: Trans 2000; 1–2: total RNA of Jialing 30.



图 2 MaANS扩增产物电泳图谱
Fig. 2 Detection of DNA fragments of MaANS
M: Trans 2000; 1~3: MaANS基因核心片段 PCR产物。
M: Trans 2000; 1–3: PCR products of MaANS gene core sequence.

桑树基因组 DNA经限制性内切酶 Dra I、PshB
I、Pvu II、Sma I和 Hae III酶切, 苯酚氯仿抽提纯化
后, 电泳检测表明, 基因组 DNA 完全被消化, 并呈
弥散状态, 符合构建 GenomeWalker文库的要求。根
据已经获得的 MaANS片段, 分别设计了上、下游的
4 条基因特异性引物 upGSP1、upGSP2、downGSP1
和 downGSP2。以桑树基因组 Genome Walker 文库
作为模板进行 2 轮 PCR 扩增, 分别克隆 5′端和 3′端
序列。经过琼脂糖凝胶电泳分析, 第 2 轮 PCR 时 5′
端获得约 500 bp的特异性扩增条带(图 3), 3′端获得
约 1 100 bp的特异性扩增条带(图 4)。用 PCR产物凝
胶回收试剂盒对第 2轮 PCR获得的两端特异性扩增
条带回收纯化, 并连接到 pMD-19T载体上, 转化 E.
coli DH5α感受态细胞, 在含有 Amp抗性的 LB平板
上培养, 获得白色菌落。随机选择 10个白色菌落于
液体培养基中扩增, 强碱法提取质粒, 经检测后送
金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。将桑树
MaANS核心区基因组序列与获得的 3′端和 5′端序列
经 Sequencher 4.2分析软件进行拼接, 并通过 NCBI
的 Blastx预测获得基因全长为 1 535 bp, 有 1个内含
子, 2个外显子, 编码区为 1 077 bp, 共编码 358个氨
基酸, NCBI登录号为 JF499385。根据获得的全长序
列设计引物扩增 cDNA及基因组片段(图 5), 并将片
段连接到 PMD-19T载体上测序, 测序结果与预测的
序列完全相同。
2.2 桑树花青素合酶基因(MaANS)的信息学分析
将MaANS的全长序列上传到NCBI上进行Blast
比对, 结果表明, 该基因目的片段与其他植物材料



图 3 MaANS 5′端染色体步移第 2轮 PCR
Fig. 3 Second round PCR amplification result of genome
walking of 5′ terminal from MaANS
M: Trans 2000; 1~5: 分别为以 Hae III、Dra I、PshB I、Pvu II和
Sma I酶切的 DNA“库”为模板的 5′端第 2轮 PCR扩增产物。
M: Trans 2000; 1–5: the second round PCR product of 5′ terminal
using enzyme digested DNA libraries templates, the enzymes used
from line 1 to 5 were Hae III, Dra I, PshB I, Pvu II, and Sma I.



图 4 MaANS 3′端染色体步移第 2轮 PCR
Fig. 4 Second round PCR amplification result of genome
walking of 3′ terminal from MaANS
M: Trans 2000; 1~5: 分别为以 Hae III、Dra I、PshB I、Pvu II和
Sma I酶切的 DNA“库”为模板的 3′端第 2轮 PCR扩增产物。
M: Trans 2000; 1–5: The second round PCR product of 3′ terminal
using enzyme digested DNA libraries templates, the enzymes used
from line 1 to 5 were Hae III, Dra I, PshB I, Pvu II, and Sma I.
第 7期 张琼予等: 桑树花青素合酶基因的克隆与信息学分析 1257


中的 ANS 基因具有较高的同源性, 其中与草莓(Fra-
garia × ananassa, AY695817)、甘薯(Ipomoea batatas,
GU598212)、苹果(Malus × domestica, AF117269)、
沙梨 (Pyrus pyrifolia, GU390546)、杨树 (Populus
trichocarpa, XM_002304416)、陆地棉 (Gossypium
hirsutum, DQ122182)的 ANS基因序列同源性分别为
94%、83%、87%、90%、95%和 96%, 表明花青素
合酶基因序列在进化上具有较高的保守性。
所获得的桑树 ANS基因核心片段长度为 779 bp,
花青素合酶基因作为植物花青素合成途径中的关键



图 5 MaANS全长扩增结果
Fig. 5 Amplification result of full-length of MaANS
M: Trans 2000; 泳道1和2为全长CDS; 泳道3和4为基因组全序列。
M: Trans 2000; Lanes 1 and 2: CDS sequence; Lanes 3 and
4: genome sequence.



图 6 MaANS基因编码序列及其推导编码的氨基酸
Fig. 6 Code sequences and deduced amino acid of MaANS
酶基因, 目前已在草莓(Fragaria × ananassa)中克隆
出 2 条同源序列[29], 在野薯(Ipomoea trifida)中克隆
出 19条同源序列[30], 在大豆(Glycine max)中克隆出
2 条同源序列(AAR26525 和 AAR26526)。这些序列
的高度相似性, 表明不同物种花青素生物合成由相
似因子介导与控制。用 Clustalx、Genedoc分析不同
来源的ANS氨基酸序列发现不同物种虽然序列不完
全相同, 但是其序列之间仍具有较多的高度保守序
列或相同的活性中心(图 7)。由图中可见, ANS的高
度保守区域包含典型的 2-酮戊二酸双加氧酶的保守
功能域, 其中氨基酸残基 His(H)、Asp(D)是与 Fe2+
的结合位点 , Arg(R)和 Ser(S)与 2-酮戊二酸结合
(RXS基序), 底物结合位点有 Tyr(Y)、Ile(I)、Phe(F)、
Glu(E)、Thr(T)、Val(V)、Lys(K)、Leu(L)[21,31], 这几
个位点在不同物种中的 ANS序列中高度保守(图 7)。
2.3 花青素合酶进化分析
从NCBI下载桑树花青素合酶基因同源基因 23条,
分别来自拟南芥(Arabidopsis thaliana, NP_194019)、
马 铃 薯 (Solanum tuberosum, ADP37440)、 茄 子
(Solanum melongena, ACJ02088)、甘蓝 (Brassica
oleracea, AAO73440)、芜菁 (Brassica rapa, ABY
89681)、紫罗兰(Matthiola incana, AAB82287)、甘薯
(Ipomoea batatas, ADE08370)、裂叶牵牛(Ipomoea
hederacea, AAP82029)、小麦 (Triticum aestivum,
BAE98276)、水稻(Oryza sativa, CAA69252)、洋石竹
(Dianthus caryophyllus, AAB39995)、霞草(Gypsophila
elegans, AAP13054)、胡萝卜(Daucus carota, AAD
56580)、大豆(Glycine max, ABY51685)、紫花苜蓿
(Medicago truncatula, ABU40983)、沙梨(Pyrus com-
munis, ABB70119)、苹果(Malus × domestica, AAZ
79374)、草莓(Fragaria × ananassa) AAU12369、可
可 (Theobroma cacao, ADD51356)、甜 橙 (Citrus
sinensis, AAT02642)、毛果杨(Populus trichocarpa,
XP_002304452)、荞麦(Fagopyrum esculentum, ADT
63066)、龙眼(Dimocarpus longan, ACK76231)。
利用 MEGA4.0 软件构建花青素合酶的系统进
化树(图 8), 进化树构建采用 UPGMA法。从图中可
以看出, 这些物种的 ANS 蛋白亲缘关系都非常接近,
可分为 3 大类群。第 I 大类以草本植物为代表类群,
有 6个亚类分别是由霞草和洋石竹归为石竹科; 芸薹
属的甘蓝、芜菁, 紫罗兰属的紫罗兰以及拟南芥属
的拟南芥归为十字花科 ; 胡萝卜单独归为伞形科 ;
苜蓿属的紫花苜蓿和大豆属的大豆归为豆科; 番薯
属的甘薯和牵牛属的裂叶牵牛归为旋花科; 最后一
1258 作 物 学 报 第 38卷



图 7 桑树与其他植物材料 ANS氨基酸序列比对
Fig. 7 Sequence multialignment of the MaANS with anthocyanidin synthases from other plants
▼: Fe2+结合位点; ●: 2-酮戊二酸结合位点。
▼: Fe(II) atom binding sites; ●: 2OG binding sites.
第 7期 张琼予等: 桑树花青素合酶基因的克隆与信息学分析 1259




图 8 UPGMA法构建 ANS蛋白质系统进化树
Fig. 8 Phylogenetic tree of MaANS and other plant ANSs generated by the UPGMA method

个亚类是由茄属的马铃薯和茄子归为茄科。第 II 大
类主要以木本植物为代表类群, 首先乔木植物可可
与龙眼聚在同一节点, 后与杨柳科毛果杨、芸香科
甜橙聚为一小类, 再与蔷薇科的沙梨、苹果、草莓
聚为一类, 这类与桑科的桑树聚为一亚类, 最后这
个亚类与蓼科荞麦归为第 II 大类。禾本科单子叶植
物小麦和水稻归为第 III类。可见, ANS蛋白可以将
科、属等级植物区分开来。本研究获得的桑树 ANS
氨基酸与草莓的进化关系最近, 其次与同为木本植
物的苹果、沙梨, 然后与甜橙、毛果杨、可可、龙
眼的进化关系较近。笔者认为这可能是因为桑椹与
草莓同为浆果类, 所得到的 ANS蛋白拥有相同的功
能 , 其进化关系近; 而苹果、沙梨属于梨果类 , 其
ANS 蛋白质的进化距离相对于草莓远, 从这一实验
结果, 暗示 ANS 基因的系统进化关系主要体现在果
实形成类别的分化差异上。
2.4 桑树 ANS 氨基酸序列的二级和三级结构预
测和分析
蛋白质的二级结构式指氨基酸残基形成的 α-螺
旋、β-转角、β-折叠片、延伸链、无规则卷曲以及基
序等组件。用 SOPMA[25]对桑树 ANS氨基酸序列的
二级结构进行预测(图 9)。结果表明, MaANS蛋白质
二级结构的主要元件是 α-螺旋(32.96%)和不规则螺
旋 (45 .53%), 其次是延伸链 (15 .36%)和 β -转角
(6.15%)。与草莓、苹果、拟南芥、毛果杨、葡萄、
大豆、甘薯、沙梨和甜橙的 ANS氨基酸序列二级结
构比较, 桑树 MaANS 含有较少的 α-螺旋和较多的
延伸链结构(表 2)。因为在MaANS的一级结构中, 含
有较多的 Ser、Arg 和 Tyr 残基, 这几种氨基酸均能
破坏螺旋结构, 而 Val、Ile 残基则是强烈的 β-折叠
延伸形成子。ANS蛋白属于 2-酮戊二酸双加氧酶家
1260 作 物 学 报 第 38卷

族, 与在类黄酮合成途径中同属此家族的黄酮醇合酶
具有保守的同源性[32]。本文利用 Qmean Server [26-27]
在线分析软件预测了MaANS的三维结构(图 10), 其
X 射线总分辨率可达到 0.765 (0~1 之间结果可靠),
发现其蛋白质的 211~309肽段含有 2 OG-Fe(II)加氧
酶家族基因的结构域, 在 213~309 肽段行使双加氧
功能, 因此 MaANS 蛋白属于 2-酮戊二酸双加氧酶
家族 , 与前人的研究报道相符 , Matsuda 等 [33]、
Shimada等[34]和Wilmouth等[21]分别分析了 2 OG-Fe
(II)加氧酶家族基因的活性位点, 研究发现在 AtANS
H236、D238、H292、Y221、R302 和 S304 这几个
活性位点大部分是由无规则卷曲组成。
2.5 MaANS基因组织特异性表达分析
花青素合酶基因的表达受到植物的整体代谢控
制, 花青素的积累与许多因素相关, 如合成底物、合
成途径中的其他关键酶、内源激素、叶绿素和类胡
萝卜素、外界环境因子等。在本研究中, 通过 RT-PCR
分析了桑树的 MaANS 基因在不同组织的表达情况
(图 10)。由图中看出花青素合酶基因在桑树的成熟
果实和幼叶中均检测到高丰度表达信号, 而在根、
茎和成熟叶片中均未检测到表达。其原因可能是幼
叶期间叶绿体的数量较少, 光合速率低, 而在紫外
线等外界环境的诱导下, 引发了花青素的合成途径[35],
花青素合酶基因的表达量升高, 使花青素的含量增
多, 致使桑树的幼叶呈现出紫红色, 尤其是结果率
高的广东桑(M. atropurpurea Roxb.)中的大多数品种
枝条顶端的幼叶, 大多为红褐色。随着幼叶的成熟,
叶绿体增多, 叶绿素含量增加, 吸收了大量的红光,
降低了光敏色素的调控效率[36], 从而降低了花色苷
合成途径中酶的合成或活化[37], 导致花青素的合成
减少, 所以成熟的桑树叶片均为绿色。随着果实的
成熟, 果内的花青素合酶基因大量表达, 花青素大
量合成累积, 致使桑椹由绿色向紫红色, 再向紫黑
色转变。这与苹果果皮呈色的研究结果比较接近 ,

表 2 不同植物 ANS基因蛋白质二级结构主要构成组件比例
Table 2 Constituted the main components of protein secondary ratio of ANS gene among different plants (%)
组件名称 Component name 物种名称
Species α-螺旋 Alpha helix β-转角 Beta turn 延伸链 Extended strand 无规则卷曲 Random coil
桑树 Morus alba 32.96 6.15 15.36 45.53
草莓 Fragaria × ananassa 32.43 5.02 19.31 43.24
苹果 Malus × domestica 33.59 5.02 19.31 42.08
拟南芥 Arabidopsis thaliana 31.73 6.43 19.68 42.17
毛果杨 Populus trichocarpa 33.33 6.02 22.49 38.15
葡萄 Vitis vinifera 33.73 6.02 21.29 38.96
大豆 Glycine max 34.14 5.22 19.28 41.37
沙梨 Pyrus communis 32.82 6.56 20.08 40.54
甜橙 Citrus sinensis 34.17 5.04 17.09 43.70



图 9 MaANS二级结构预测图
Fig. 9 Secondary structure of MaANS
h: α-螺旋; e: β-折叠延伸链; t: β-转角; c: 无规则卷曲。
h: alpha helix; e: Extended strand; t: beta turn; c: random coil.
第 7期 张琼予等: 桑树花青素合酶基因的克隆与信息学分析 1261




图 10 MaANS蛋白质三维结构预测图
Fig. 10 3D structure of MaANS



图 11 MaANS组织特异性表达
Fig. 11 Expression analysis of MaANS genes in different tissues
1: 根; 2: 茎 3: 成熟果实; 4: 幼叶; 5: 成熟叶片。
1: roots; 2: stems; 3: ripened fruits; 4: young leaves; 5: mature leaves.

苹果随着果实的成熟, 其果皮也逐渐失绿, 红色逐
渐增加, 花青素和叶绿素两者呈显著的负相关(r =
–0.88677) [38], 最后表现为红色。
3 讨论
花青素合酶 ANS 是花青苷合成途径中的关键
限速酶之一, 它催化无色花青素生成有色花青素再
进一步转化为花青苷, 花青苷是桑椹类黄酮化合物
中的重要组成部分。自从首次从玉米中分离出来[39],
科学家从遗传学、酶学和分子水平上对花青素生物
合成途径以及 ANS 基因进行了广泛研究 [40-42], 但
ANS基因的克隆在桑树中尚未见报道。
本研究利用同源克隆从桑椹中克隆了 ANS基因
片段 MaANS, 片段长度为 779 bp, 编码 259 个氨基
酸, 登录到 NCBI上注册(GI: 345019082)。通过染色
体步移克隆到 MaANS的 3′和 5′端序列, 并与获得的
核心区域基因组序列进行拼接, 设计全长克隆引物
得到基因全长 1 535 bp, 有 1个内含子, 2个外显子,
CDS为 1 077 bp, 编码 358个氨基酸。分析 MaANS
基因片段长发现, 其序列与草莓、甘薯、苹果、沙
梨的 ANS序列同源性均达到 80%以上, 是一个高度
保守的基因家族。构建 ANS系统进化树, 发现已克
隆到的 MaANS 的进化位置与草莓的果实最近, 其
次是苹果、沙梨等, 可能是因为桑树的果实与草莓
的果实同属于浆果类型所致, 并在被子植物种系发
生学组(APG)的被子植物APG III分类法中桑科现已
归属于蔷薇目 , 与草莓、苹果和沙梨同属于蔷薇
目[43]。因此从中克隆得到的 ANS蛋白质的结构和功
能更为相似, 并且 ANS在进化树中可以将科、属等
级分别开来, 可作为进化中的分类指标之一。
通过预测 MaANS 氨基酸的二级结构和三维结
构, 发现 MaANS 蛋白质二级结构的主要元件是 α-
螺旋 (33.52%)和不规则螺旋 (39%), 其次是延伸链
(17.04%)和 β-转角(5.87%), 与拟南芥、毛果杨、苹
果、葡萄、甘薯、大豆、沙梨、甜橙等物种的 ANS
蛋白质的二级结构成分相似, 并预测出 MaANS 三
维结构图。
通过对 MaANS 基因的组织表达分析发现 ,
MaANS 基因在幼叶和成熟果实中表现出高丰度表达,
在根、茎和成熟叶片中并未检测到表达。其原因可
能与不同发育时期的光照、叶绿素、胡萝卜素的降
解与合成等因素有关。更为重要的是, 从本次实验
结果, 认为 MaANS基因具有组织特异性表达效应。
作为类黄酮代谢途径的一部分, 花青素的代谢
引起了人们的广泛关注[44-45]。一个物种的花青素代
谢途径在遗传上决定了该物种的花色或果色, 然而
花色或果色从表型到基因型之间的诸多环节至今仍
然鲜为人知, 在花青素含量颇丰的桑椹中更是鲜有
关于代谢途径中基因的研究和报道。目前, 与花色
研究有关的大量的生物化学和分子遗传学工作是在
农作物、园艺品种和经典模式植物上取得突破的 ,
在自然界中有花色自发变异的物种却少有研究涉
及。桑椹的果色除了野生型的紫红色外, 也有自然
变异产生的白色。本文克隆到的 MaANS基因, 是桑
树花青素代谢途径中其中一个关键酶基因, 今后还
有待于从其他结构基因、调节基因以及环境因素等方
面进一步研究桑树花青素苷生物合成的调控机理, 从
进化的角度阐明桑树果色形成以及变异的分子机制。
4 结论
从桑树中克隆到 ANS基因, 获得基因全长 1 535
bp, 有 1个内含子, 2个外显子, CDS全长为 1 077 bp,
共编码 358 个氨基酸, 属于 2-酮戊二酸加氧酶家族
成员。该基因在幼叶和成熟果实中有高丰度表达 ,
亲缘关系与草莓最近, 与苹果、沙梨次之。该基因
是桑椹果色的形成的关键酶基因, 可作为调控果色
的候选基因之一。
1262 作 物 学 报 第 38卷

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