全 文 ：武汉植物学研究 2001, 19( 3) : 177～180
Journal of Wuhan Botanical Research
栽培稻与疣粒野生稻杂种 F1代的
基因组原位杂交鉴定
贾东亮　 舒理慧　 宋运淳　 覃　瑞　 祝莉莉　 何光存

(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉　430072)
摘　要: 生物素标记的疣粒野生稻总 DNA 作探针, 未标记的栽培稻总 DNA 封阻, 对栽培稻
与疣粒野生稻杂种 F 1体细胞染色体进行基因组原位杂交( Genom ic in s itu hybr idization,简
称 GISH)分析。F ITC 检测表明,杂种细胞中来自疣粒野生稻的染色体有较多的黄色或黄绿
色荧光信号, 来自栽培稻的染色体只检出很少的信号。每条疣粒野生稻染色体上信号点所占
的总的区域只是染色体的一小部分, 表明疣粒野生稻染色体与栽培稻染色体的 DNA 序列大
部分是同源的。
关键词: 基因组原位杂交; 疣粒野生稻; 药用野生稻
中图分类号: Q943　文献标识码: A　文章编号: 1000-470X ( 2001) 03-0177-04
Identif ication of Hybrid of Oryza sativa×O. meyeriana
Using Genomic in situ Hybridization
JIA Dong-Liang , SHU Li-Hui, SONG Yun-Chun, QIN Rui,
ZHU Li-Li, HE Guang-Cun
( K ey Laboratory of MED f or Plant Dev elop mental Biology, W uhan Unive rsity, Wuhan　430072, China)
Abstract: With biot in-labelled total g enom ic DNAs from Chinese w ild rice,
Ory z a mey eriana as probe and 4-fold unlabelled to tal g enom ic DNA from culti-
vated rice, O . sativ a IR36 as blocking, g enom ic in situ hybridizat ion w as applied
to somat ic chromosome preparat ions of O. sati va×O . meyeriana F1 hybrid.
When detected w ith ant i-biot in-FITC, O . meyeriana chromosomes gave g ree-
nish-yellow f luorescence w hile cult iv ated r ice chromosomes f luo resced red w ith
PI counterstain. The area of signal on each w ild chromosome was small. It sug-
gested that a g reat part o f DNA sequence in O. meyeriana is homologous to cul-
tiv ated rice.
Key words : Genom ic in situ hybridizat ion; Oryz a mey eriana; Ory z a of f icinal is


收稿日期: 2000-11-14,修回日期: 2001-01-11。
基金项目:国家“九五”科技攻关项目(编号: 96-002-02-01-1)和国家教委优秀青年教师基金资助项目。
作者简介:贾东亮( 1970- ) ,男,在读硕士生,研究方向为植物分子遗传学。
通讯作者。
　　稻属( Ory z a)包括 20个野生种, 染色体组型包括 AA、BB、CC、BBCC、CCDD、EE、
FF、GG和 HHJJ[ 1]。野生稻具有丰富的遗传多样性和多种重要特性[ 2 4] ,是栽培稻遗传改
良的丰富基因资源。利用野生稻的工作虽然已取得了一些进展[ 2, 5 7] ,但由于致病生物的
致病性与品种的抗病抗虫性具有共进化的关系,所以水稻的抗病抗虫育种研究仍需要源
源不断地导入新的抗性基因。疣粒野生稻具有抗稻瘟病、极强的抗白叶枯病性和很好的
耐旱性和耐荫性, 是提供新的抗性基因的理想材料。疣粒野生稻和药用野生稻同为原产我
国的野生稻, 目前对药用野生稻的研究较多[ 2, 8 10] ,而疣粒野生稻的利用研究却少有报
道。本实验室将栽培稻与疣粒野生稻的有性杂交后所得的幼胚经组织培养后出现带绿芽
点的愈伤组织,再经过几个月的干燥诱导分化出现了再生植株并移栽成功。在此基础上,
我们对其基因组进行了原位杂交鉴定分析。
1　材料与方法
表 1　实验中所采用的几种材料
Table 1　T he Ory za species and the hybr ids used
in t his exper iment ( 2n= 2x= 24)
名　称　　　　　　　　　　
N ame　　　　　　　　　　 基因组构型Genome
栽培稻
Cult ivated r ice
IR36
O . sat iv a IR36
AA
野生稻
Wild rice
疣粒野生稻
O .m ey eriana
GG
原产云南
Yunnan origin
* 种间杂种
In terspecif ic hyb rid
IR36×疣粒野生稻 F1
O . sat iv a IR36×O. meyer iana F1 AG
* 杂种是以栽培稻作母本,野生稻作父本获得的。
* T he hybr id w as obtained from the cross betw een O . sativ a IR36,
as female and O. meyeriana as male.
1. 1　实验材料
实验材料见表 1。所有材
料的稻株均于武汉大学遗传
研究所的网室中盆栽。
1. 2　用幼胚诱导愈伤的培养
基及其条件
1/ 2 N 6培养基, pH= 5. 6。
在24～26℃条件下诱导愈伤
组织, 在白炽光下诱导再生植
株。
1. 3　根尖体细胞染色体制片
在 Yan 等的方法 [ 11]上略
加改进。取生长旺盛的F1植株根尖在卡诺固定液中2 h以上, 充分水洗, 1%纤维素酶
( YAKU LT Biochemicals CO., LT D. Japan)和1%果胶酶( YAKU LT Biochemicals CO.,
LTD. Japan) 28℃酶解4 h,卡诺液固定。火焰干燥法制片, 镜检后- 20℃下保存备用。
1. 4　基因组 DNA提取及探针制备
疣粒野生稻和栽培稻的总 DNA 提取参照 Murry 等的方法[ 12]。疣粒野生稻 DNA 经
高压灭菌处理后打断至 500 bp 左右, Bio tin-11-dUT P 缺刻平移法标记(标记试剂盒购自
华美公司)。标记好的探针经Sepherose CL-6B 凝胶离心柱纯化后使用。封阻用的栽培稻
总 DNA 经高压灭菌处理 5 min,打断成 200～300 bp的小片段。
1. 5　原位杂交
参照 Leitch 等的方法[ 13]略加改进。60℃烘片 1 h, 4
g/ mL 的 RNase 37℃温育 1 h,
70%甲酰胺 70℃变性 3 m in, - 20℃的 70%、95%和 100%的乙醇中脱水, 每次 5 m in, 空
气中充分晾干。杂交液( 50%去离子甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、2×SSC、10
g 鲑鱼精
DNA、10% SDS、标记探针 100 ng 及 4～8
g 封阻DNA) 100℃变性 10 m in, 置于冰水中
10 min以上, 加 50
L 杂交液于制片上, 92℃烘箱中 20 m in, 37℃保湿皿中杂交过夜。
178 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 19卷　
1. 6　杂交后的洗脱与检测
杂交后的制片依次在 20%甲酰胺、2×SSC、1×SSC、1×PBS中洗脱。再依次加入 10

g/ mL FITC-Av idin( Sigma ) , 5
g/ mL Ant i-avidin( Sigma ) , 10
g / mL FITC-Avidin,
37℃各 30 min, 50
g/
L PI复染, OLYMPUS BX-60荧光显微镜下观察并拍照。
2　结果与讨论
2. 1　组织培养及形态学的分析
中国疣粒野生稻与栽培稻的亲缘关系很远,一直未有二者杂交成功的报道。本实验室
通过远缘杂交幼胚拯救先后获得了带绿芽点的愈伤组织(图版Ⅰ: 1)、幼苗(图版Ⅰ: 2)和成
体植株(图版Ⅰ: 3)。形态观察表明,栽培稻与疣粒野生稻杂交后所得的植株生长旺盛、茎
杆粗壮,抗逆性强,表现出明显的野生稻亲本的特性,从形态上可以判定为真杂种。根尖细
胞染色体计数结果表明其染色体数目为 24,根据亲本的染色体组型推断, 杂种的染色体
组型应为AG。因此,对杂种根尖染色体进行了以疣粒野生稻 DNA 为探针的原位杂交分
析。
2. 2　染色体数目和来源的鉴定
在绿色( G)激发光下,染色体发明亮的红色荧光(图版Ⅰ: 4) , 可清晰地观察到细胞分
裂各个时期的染色质或染色体。在该绿色激发光的波长下,虽不能区分野生稻和栽培稻染
色体,但能迅速找到分裂相,显示染色体的形态和数目,并与其他波长下观察到的染色体
进行比较。在蓝色( B)激发光下,经 PI 复染,染色体呈桔红色, 探针上藕联的绿色FITC 与
桔红色荧光互作,发出黄色或黄绿色荧光,即杂交信号;分裂相中有 12条染色体上有较多
的杂交信号点, 使它们显出较多的黄色或黄绿色, 显然,它们结合了较多的疣粒野生稻探
针,从同源性考虑,应当认定为来自疣粒野生稻的染色体;而另 12条染色体只有少数带有
少量的信号点,基本上仍显红色,同样根据同源性分析,它们则是来自栽培稻的染色体(图
版Ⅰ: 5)。因此杂种 F 1代中疣粒野生稻和栽培稻来源的染色体就被清楚地区分开了。
2. 3　染色体上信号点分布特征的分析
每条疣粒野生稻染色体上信号点所占的总的区域只是该染色体的一小部分, 大部分
区域都没有信号点或只有较弱的信号点。而没有信号点或信号点较弱的区域被栽培稻
DNA 所封阻,未杂交上或只杂交上较少的探针,这部分区域占了染色体的较大部分,应当
包含大量与栽培稻染色体同缘的 DNA 序列。据此可以推断, 疣粒野生稻染色体与栽培稻
染色体的DNA 序列大部分是同源的。但 Aggarw al等[ 1]的研究也表明,疣粒野生稻的基
因组具有其独特性,与稻属其他已知的基因组相比有很大的不同, 是高度分化的。因此,在
育种过程中栽培稻×疣粒野生稻就存在更大的生殖障碍, 二者的杂种及其回交后代就更
难形成。
信号点在染色体的着丝点附近较为集中,着丝点以远的部位也有分布。而着丝粒区一
般是异染色质, 是卫星序列( Satell ite)分布的密集区[ 14] ,这些DNA序列通常是易变的, 较
为不保守的,信号在这个区域多于其它区域表明疣粒野生稻与栽培稻之间的重复序列和
卫星序列有更多的不同,而其它活性基因分布的区域里的DNA序列则更为保守。另外,野
生稻染色体上的信号点都是散在的, 没有发现纯粹发黄色或黄绿色荧光的成片区域。
179　第 3期　　　　　　　 贾东亮等:栽培稻与疣粒野生稻杂种 F1 代的基因组原位杂交鉴定
在我们的研究中发现了部分栽培稻的染色体上带有少量信号点,这是由于用了较低
的封阻比例( 1∶4)的缘故,所以在运用 GISH 这一方法对不同物种间或不同物种的杂种
后代的基因组分析过程中, 封阻 DNA 的浓度对假阳性信号的排除具有十分重要的作用。
2. 4　GISH在本实验中的作用
植物基因组原位杂交自 Schw arzacher 等 [ 15]在 1989年正式提出以来,得到迅速发展,
使与 GISH 相结合的荧光原位杂交( F ISH )技术在植物分子细胞生物学方面显示出了强
大的生命力。栽培稻与野生稻,特别是与如疣粒野生稻等与栽培稻亲源关系较远的野生稻
之间获得杂种的难度较大, 成功率较低, 杂交后代中常混杂有大量的假杂种,因此对杂种
中外源染色体(片段)的准确鉴定就显得十分重要。这不仅有助于了解野生稻基因转移过
程中异种遗传物质之间的相互作用及其交换重组规律,而且有助于了解特定染色体(片
段)以及特定 DNA 序列的功能及作用,对野生资源基因利用的理论和实践具有重要意
义。在过去,通常应用形态标记、细胞学标记和生化标记鉴别异源染色体,而 GISH 与以上
方法相比,有更加直观、灵敏和可靠的优点。我们的 GISH 结果表明:杂交后代中分别来源
于野生稻和栽培稻的染色体能清楚地被区分开,说明 GISH 是确定不同亲本染色体是否
同时存在,识别杂种真伪的有效办法。这种技术的运用在水稻远缘杂交育种中的前景十分
广阔。
致谢: 本实验室廖兰杰老师参加了栽培稻与疣粒野生稻有性杂交与组织培养的部分工作, 在此表
示衷心感谢。
参考文献:
[ 1 ]　Aggarw al R K, Brar D S, Khush G S . Tw o n ew genomes in the Oryz a complex ident if ied on the baisis of molec-
ular d ivergence analysis u sing total genomic DNA hybr idization .M ol G en G enet, 1997, 254: 1 2.
[ 2 ]　Jena K K,Khush D S. Int rogres sion of genes f rom Oryz a off icinal is Wel l ex Wat t to cult ivated rice, O . sat iv a L.
T heor App l Genet, 1990, 80: 737 745.
[ 3 ]　章琦,王春莲,施爱农,等.野生稻抗稻白叶枯病性( X anthomons oryz ae pv. oryz ae)的评价.中国农业科学, 1994,
27: 1 9.
[ 4 ]　T anks ley S D, McCouch S R. S eed b ank s an d molecular maps: U nlock ing gen et ic poten tial f rom the w ild . S ci-
ence , 1997, 277: 1 063 1 066.
[ 5 ]　殷晓辉,舒理慧,郑从义,等.野生稻愈伤组织的超低温保存和冻后再生植株的形成.武汉植物学研究, 1996, 14
( 3) : 247 252.
[ 6 ]　何光存,舒理慧,廖兰杰,等.疣粒野生稻体细胞超低温保藏与原生质体培养体系的确立.中国科学 C辑, 1998,
28( 5) : 444 449.
[ 7 ]　Brar D S ,Khush G S . Alien in tr og res sion in r ice.P lant Mol B iol. 1997, 35: 35 47.
[ 8 ]　胡文辉,舒理慧,宋运淳,等.基因组原位杂交鉴定栽培稻与广西药用野生稻杂交后代染色体构成.武汉植物学
研究, 2000, 18(2) : 81 84.
[ 9 ]　颜辉煌,程祝宽,刘国庆,等.栽培稻- 药用野生稻杂种 F1及回交后代的基因组原位杂交鉴定.遗传学报, 1999,
26( 2) : 157 162.
[ 10]　颜辉煌,胡慧英, 傅强,等.栽培稻与药用野生稻杂种后代的形态学和细胞遗传学研究.中国水稻科学, 1996, 10
( 3) : 138 142.
[ 11]　Yan H M, Song Y C, Li L J, et al . The ph ysical locat ion of genes cdc2 and prh1 in maize( Zea may s L . ) . H ered i-
tas, 1997, 126: 211 217.
[ 12] 　Mu rry M . Th ompson W F. Rapid is olat ion of h igh-molecular -weight plant DNA. Nuc leic A cid Res, 1980, 8:
4 321 4 325.
[ 13]　Leitch I J, Leitch A R, Heslop-Harris on J S . Ph ysical mapping of plant DNA sequen ces b y s imultaneous in si tu
hybridiz at ion of tw o dif ferent ly labeled fluores cent pr ob es .G enome , 1991, 34: 329 333.
[ 14]　孙乃恩,孙东旭,朱德熙,等.分子遗传学.南京:南京大学出版社, 1996. 41 42.
[ 15]　Schw arz acher T , Leitch A R, Bennet t M D, et al . In situ localiz at ion of p arental genomes in a w ide hybrid. A nn
Bot, 1989, 64: 315 324.
180 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 19卷