全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(11): 2024−2033 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由广西自然科学基金创新团队项目(2011GXNSFF018002), 国家国际合作项目(2008DFA30600, 2009DFA30820), 广西科技攻关
项目(桂科能0815011, 桂科产1123008-1)和广西农业科学院创新团队项目(桂农科2011YT01)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 李杨瑞, E-mail: liyr@gxaas.net; 杨丽涛, E-mail: litaoyang61@yahoo.com
第一作者联系方式: E-mail: lcn560@163.com
Received(收稿日期): 2012-04-27; Accepted(接受日期): 2012-07-05; Published online(网络出版日期): 2012-09-10.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120910.1345.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.02024
甘蔗 ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析
李长宁 1,2 农 倩 1 谭秦亮 1 Manoj Kumar SRIVASTAVA 2 杨丽涛 1,2,*
李杨瑞 1,2,*
1 广西大学农学院 / 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广西南宁 530005; 2中国农业科学院甘蔗研究中心 / 农业部广
西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室 / 广西作物遗传改良生物技术重点实验室 / 广西甘蔗遗传改良重点实验室 , 广西南宁
530007
摘 要: ATP柠檬酸裂解酶(ACL)为细胞质中乙酰辅酶 A合成途径的关键调控酶, 在生物体正常生长发育中有重要作
用。本研究通过 Race和电子克隆技术获得编码甘蔗 ACL蛋白 2个亚基的基因 SoACLA-1和 SoACLB-1, 其编码框长
度分别为 1 272 bp和 1 827 bp, 编码 423个和 608个氨基酸, 推测的氨基酸序列与其他物种具有高度相似性, 都优先
与禾本科植物聚于同一进化分支。2个基因在 ATP-grasp功能域、柠檬酸结合位点、组氨酸磷酸化位点和 ATP结合、
CoA结合、磷酸化区域等, 序列高度保守。实时荧光定量 PCR结果表明, 2个基因均受外源 ABA、水分胁迫、水分
胁迫加ABA处理诱导表达, 且叶中表达量显著高于根系, 其中又以水分胁迫处理下的表达量最高, 2个基因表现出协
同表达模式。SoACLA-1和 SoACLB-1的表达与 ABA、ROS含量具有相关性, 说明它们可能参与了 ABA调控的植物
对逆境胁迫反应的代谢过程。
关键词: 甘蔗; ATP柠檬酸裂解酶; 克隆; 脱落酸; 表达
Cloning and Expression Analysis of ATP-Citrate Lyase Genes from Sugarcane
LI Chang-Ning1,2, NONG Qian1, TAN Qin-Liang1, Manoj Kumar SRIVASTAVA 2, YANG Li-Tao1,2,*, and LI
Yang-Rui1,2,*
1 Agricultural College / State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, Guangxi University, Nanning 530005,
China; 2 Sugarcane Research Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improve-
ment (Guangxi), Ministry of Agriculture / Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Laboratory / Guangxi Key Laboratory of Sugar-
cane Genetic Improvement, Nanning 530007, China
Abstract: Acetyl-CoA plays an important role in the cytosol of plant cells for the synthesis of a diverse set of phytochemicals, and
the cytosolic acetyl-CoA is from the reaction of citrate and CoA catalyzed by ATP-citrate lyase (ACL) coupled with the hydrolysis
of ATP. In this study, two genes encoding two distinct subunits of ACL were identified from sugarcane (Saccharum officinarum)
by RACE and insilico cloning technigues, named SoACLA-1 and SoACLB-1, which contained 1272 and 1827 bp open reading
frames, and encoded 423 and 608 amino acids, respectively. Sequence analysis indicated that both amino acids sequences showed
high homology with ACLs from other species and were close clustered with ACLs from gramineous plants in the phylogenetic
tree constructed by MEGA5.0 software using a Neighborhood-Joining bootstrap method. Both sequences showed high conserva-
tion in the ATP-grasp domain, citrate binding site, active binding site of histidine phosphorylated by ATP, potential ATP-binding,
phosphorylated site and CoA-binding site when compared with ACLs from other species. Quantitative real-time PCR results indi-
cated that SoACLA-1 and SoACLB-1 were both induced by the treatment of control+ABA, water stress, water stress +ABA, and
their expression levels were higher in leaves than in roots, with the highest express level in water stress treatment, SoACLA-1 and
SoACLB-1 showed a synergetic expression pattern. The expression of SoACLA-1 and SoACLB-1 was close correlated with the
ABA and ROS contents, indicating that ACL maybe involved in stress responsive metabolic process triggered by ABA in plants.
Keywords: Sugarcane; ATP-citrate lyase; Cloning; ABA; Expression
第 11期 李长宁等: 甘蔗 ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析 2025


乙酰辅酶 A (Acetyl-CoA)作为关键的代谢中间
产物联结着至少 5个亚细胞单位中的生理生化进程,
在生物体正常生长发育中扮演着重要角色。质体中,
acetyl-CoA 为脂肪酸 [1]和硫代葡萄糖苷 [2]等的合成
前体; 线粒体中 acetyl-CoA 与三羧酸循环(TCA)偶
联, 合成 ATP 和氨基酸骨架; 微体中 acetyl-CoA 主
要来自脂肪酸 β-氧化, 可作为能量来源; 细胞核和
胞质中 acetyl-CoA 作为乙酰基供体参与组蛋白和转
录因子甲基化修饰, 在真核生物的染色体结构调节
和基因表达调控中发挥重要作用 [3-5]。此外 , 胞质
acetyl-CoA可通过羧化、缩合和乙酰化作用, 参与众
多物质合成, 调节生物体各项生理活动[6-8]。有报道
证实, 胞质 acetyl-CoA 对玉蜀黍赤霉菌(Gibberella
zeae)有性和无性世代的转换有影响[9]。
由于 acetyl-CoA不能自由通过细胞质膜, 因此,
它的产生和积累在各细胞器中独立进行, 但又不能
完全割裂[10-12], 如胞质代谢中, ATP 柠檬酸裂解酶
(ATP-citrate lyase, ACL)催化柠檬酸和 CoA 生成草
酰乙酸和 acetyl-CoA, 而柠檬酸为线粒体内 TCA循
环中间产物且通过线粒体膜上的载体向胞质中转运
供应, ACL活性强弱对胞质 acetyl-CoA积累至关重
要。研究表明, ACL有同聚肽(homomeric)和杂聚肽
(heteromeric) 2 种结构, 在一些菌类和哺乳动物中
ACL 由单个基因编码, 其余生物体中则分别由不同
基因编码的 A (ACLA)和 B (ACLB) 2个亚基组成[13]。
拟南芥(Arabidopsis thaliana) AtACLA由 AtACLA-1、
AtACLA-2 和 AtACLA-3 基因编码, 且都位于第 1 染
色体上; AtACLB 则由 AtACLB-1 和 AtACLB-2 基因
编码, 前者位于第 3 而后者位于第 5 染色体上[13]。
拟南芥 ACL 是一种 A4B4 结构的异源八聚体蛋白,
AtACLA和 AtACLB分子量约为 45 kD和 65 kD, 全
蛋白分子量约为 500 kD, 研究证实, 通过 ACL催化
生成, 是胞质中 acetyl-CoA 来源唯一途径[13]。拟南
芥 AtACLA-1 反向遗传转化研究表明, 其活性的抑
制可导致植株微型化、细胞体积缩小、质体畸形、
叶片表面蜡质沉积和脂肪酸含量减少, 淀粉、花青
素超量积累, ACLA和 ACLB表达量和 ACL活性降
低, 表型变化程度与 ACL 抑制程度正相关, 并引起
相关胁迫基因的响应[14], 这表明ACL对植物正常生
长发育必不可少, 并在应对逆境胁迫反应中发挥重
要作用。
近年来, 对植物 ACL 的研究, 集中在其活性与
油脂积累的关系[15-17], 而对植物激素、逆境胁迫条
件下该基因的应答研究鲜见报道。作为重要的糖料
作物, 对甘蔗代谢调控的研究越来越多 [18-20], 然而
对甘蔗 ACL基因目前尚无报道, 本研究拟克隆编码
甘蔗(Saccharum officinarum) ACL 两个亚基的基因,
并探索其的进化保守性和表达特性, 为进一步研究
该酶的调控机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料与处理
选用甘蔗品种桂糖 21 (GT21), 将蔗种以单芽方
式种植于泥沙混合培养基质上, 3周后, 选取长势一
致植株移栽至含 Hoagland 营养液的桶中(pH 6.0),
桶规格约为 21 cm × 19 cm (直径×高), 每桶盛 5 L营
养液且每 3 d更换一次, 为防止根系缺氧, 使用充气
泵每隔 1 h充气一次, 每次 10 min, 待长势恢复后进
行处理, 分别设: 对照(control, C); 对照+ABA (con-
trol+ABA, CA, 叶面喷施 100 μmol L–1 ABA); 水分
胁迫[water stress, WS, 营养液中含 25% (M/V)的
PEG-6000]; 水分胁迫+ABA (WS+ABA, WSA, 干旱
处理同时叶面喷施 100 μmol L–1 ABA)。喷施至叶面
湿透无滴水, 在处理后的 0、3、6、9、12和 24 h采
集叶样(+1叶)和幼嫩根系分装速冻于液氮中, 于–80
℃冰箱中保存用于后续试验。
1.2 测定项目与方法
采用酶联免疫吸附法测定甘蔗内源脱落酸
(ABA)含量 , 试剂盒购于中国农业大学 , 按其说明
书操作 ; 使用羟胺氧化法测定超氧阴离子自由基
( O−2& )产生速率[21]; 使用 Trizol (Invitrogen)试剂提取
甘蔗总 RNA; 使用 Formentas (K1622)和 Clontech
(634923)公司试剂盒合成 cDNA 第一链, 产物分别
用于实时荧光定量 PCR和基因全长获取。
1.2.1 SoACL 扩增 以 NCBI 中与拟南芥
AtACLA-1 相似性极高的甘蔗 EST 序列(CA185038)
为模板 , 设计引物 F: 5′-GGCTCCAATCACGACC
TTC-3′和 R: 5′-TGCTGCCCAACCTTTCTG-3′, 分别
结合 RACE (Clontech)试剂盒提供的接头引物 UPM,
通过 3′-及 5′-RACE PCR 反应以获得 SoACLA-1 的
3′-和 5′-末端序列。反应体系含 2×GoldStar Best
MasterMix (康为世纪, 北京) 25 μL、cDNA 2 μL、10
μmol L–1正反向引物各 1 μL、以 ddH2O补齐 50 μL。
反应程序为 95℃预变性 10 min; 95℃变性 30 s; 60℃
退火 30 s; 72℃延伸 2 min, 36个循环; 72℃最后延伸
10 min。3′-和 5′-RACE产物经拼接后, 在其编码框
2026 作 物 学 报 第 38卷

首尾设计引物 F: 5′-ATGGCGCGCAAGAAGATCC-3′
和 R: 5′-TTATGCTGCAGCCATGATGC-3′进行扩增
以验证序列准确性。采用电子克隆方法获得甘蔗
SoACLB-1 基因完整编码框, 重叠群(contig)判断标
准为序列间重叠碱基数大于 40且相似性大于 95%。
拼接所用 EST为 CA069900、CA071659、CA073108、
CA075867、CA078429、CA078959、CA086717、
CA098387、CA098982、CA109515、CA121969、
CA155678、CA155967、CA156105、CA156346、
CA156371、CA157078、CA157261、CA170609、
CA173000、CA173286、CA175436、CA177470、
CA178822、CA187240、CA189917、CA195483、
CA199862、CA202864、CA205030、CA213250、
CA214346、CA219929、CA220789、CA223821、
CA231005、CA234164、CA238314、CA241410、
CA243668、CA248206、CA251812、CA253200、
CA256249、CA258755、CA259445、CA262645、
CA269073、CA284753 和 CA289719, 拼接完毕后,
在其首尾处设计引物 F: 5′-ATGGCAACTGGCCAA
CTTTTT-3′和 R: 5′-TCACTTGGTGTACAGGACAT
CCTC-3′进行扩增验证序列准确性 , 反应体系和程
序同上。回收、纯化所有 PCR产物, 连接 pMD18-T
载体(TaKaRa)后转化 DH5α (Trans Gen)感受态细胞,
筛选阳性克隆, 提取质粒 DNA验证后, 由生工生物
工程(上海)公司测序。
1.2.2 生物信息学分析 选用 BlastP搜索蛋白质
相似性; 由 ExPASy (http://expasy.org/tools/)分析蛋
白质基本理化性质; 由 MEGA5.0 程序(http://www.
megasoftware.net/)分析系统进化树; 使用 ClustalW2
程序 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)
进行蛋白质多序列比对并通过 Espript (http://espript.
ibcp.fr/ESPript/ESPript/)进行渲染; 通过 NCBI CDD
(conserved domain databases)数据库分析蛋白质保守
结构域。
1.2.3 实时荧光定量 PCR 以甘蔗 GAPDH基因
(EF189713)为内参 , 其引物序列为 F: 5′-TGGTG
CTGACTATGTCGTGGA-3′, R: 5′-CATGGGTGCAT
CTTTGCTTG-3′; SoACLA-1 引 物 为 上 述 3′-和
5′-RACE PCR 引物组合; SoACLB-1 扩增引物为 F:
5′-CCCGTTTCGGTGGAGCAAT-3′, R: 5′-GGCGTG
AGGTTCCTGTCA-3′。反应体系含 10 μL 2×All-in-
One qPCR Mix (Gene Copoeia)、2 μL cDNA、4 μmol
L–1的正反向引物各 1 μL、6 μL双蒸水。程序为 95
℃预变性 10 min; 95℃变性 10 s, 60℃退火 20 s, 72
℃延伸 20 s, 40个循环。反应完成后进行融解曲线检
验, 采用 2−ΔΔCt法计算相对表达量。相同处理时间内
的指标用DPS软件以Duncan’s新复极差法(P≤0.05)
检验各处理平均数差异显著性。
2 结果与分析
2.1 SoACL基因克隆
测序结果表明, SoACLA-1 基因 3′-和 5′-RACE
产物长度分别为 1 223 bp (图 1-A)和 533 bp (图 1-B),
除去接头引物及重叠序列后, SoACLA-1 全长 cDNA
为 1 594 bp, 其 5′末端包含起始密码子且符合 Kozak
法则, 3′末端具典型 poly (A)加尾信号, 包含长度为
1 272 bp (图 1-C)的开放阅读框, 编码 423个氨基酸,
5′和 3′端非翻译区长度为 95 bp和 227 bp, 将该基因
在 NCBI上注册, 获得登录号 JQ292843。SoACLB-1
开放阅读框为 1 827 bp (图 1-D), 经测序与电子克隆
获得的 SoACLB-1序列相比, 二者长度一致, 编码的
608 个氨基酸 100%吻合, 证实电子克隆结果真实可

图 1 甘蔗 SoACL基因扩增产物电泳图
Fig.1 Electrophoresis results of amplified products of SoACL genes
A~B: SoACLA-1 3′-和 5′-RACE扩增结果; C~D: SoACLA-1和 SoACLB-1编码框扩增结果。
A and B: 3′- and 5′-RACE amplified results of SoACLA-1; C and D: open reading frame amplified results of SoACLA-1 and SoACLB-1.
第 11期 李长宁等: 甘蔗 ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析 2027


靠, 该基因经注册获得登录号为 JQ923438。
2.2 蛋白序列生物信息学分析
BlastP比对结果表明, SoACLA-1和 SoACLB-1
与 AtACLA-1和 AtACLB-1的一致性/相似性分别为
81%/91%和 93%/98%, 均分别高于与拟南芥其他家
族成员相比的百分数。Expasy工具分析显示, 2种蛋
白预测分子量分别为 46.7 kD和 66.0 kD, 等电点分
别为 5.67 和 7.54。疏水性预测发现, SoACLA-1 第
338位甘氨酸疏水性最强, 分值最低的是第 7和第 9
位的精氨酸和络氨酸; SoACLB-1第 406位的半胱氨
酸疏水性最强, 最弱的是第 495位的天冬酰胺。2种
蛋白平均亲水系数分别为–0.119 和–0.040。ACL 多
序列比对结果表明(图 2), 在 ATP-grasp 功能域保守
氨基酸残基、柠檬酸结合位点和组氨酸磷酸化位点,

图 2 ACL蛋白序列多重比对
Fig. 2 Sequence alignment of ACL proteins
利用 ClustalW2进行氨基酸序列比对, 以 PDB数据库 HsACL为二级结构模板通过 ESPript渲染, 深色背景表示一致序列。下标箭头、
菱形和三角形的氨基酸分别为 ATP-grasp功能域保守残基、柠檬酸结合位点和组氨酸磷酸化位点, 下标 i、ii、iii的下画线区域分别代
表 ATP结合、磷酸化和 CoA结合区域。
SoACL is aligned with ACL proteins from Homo sapiens (Hs) and Arabidopsis thaliana (At). Alignment is performed using ClustalW2 and
color with ESPript, and dark backgrounds represent identical sequences. The arrows, diamond, and triangles below the residues show identity
for conserved in the ATP-grasp domain, citrate binding, and active site, respectively, with His phosphorylated by ATP; underline subscripted
by i, ii, and iii indicate potential ATP-binding, phosphorylated, and CoA-binding sites, respectively.
2028 作 物 学 报 第 38卷

ATP结合区域、磷酸化区域和 CoA结合区域等, 序
列均高度保守, 其余序列相似性也极高。比较有趣
的是, 蛋白为杂聚肽结构的拟南芥和甘蔗 ACL与同
聚肽结构人(Homo sapiens)的 ACL相比, A亚基和 B
亚基间比人的 ACL缺省 60个氨基酸残基。
进化关系分析的聚类结果表明(图 3), 杂聚肽结
构ACL蛋白的A亚基和 B亚基分别聚于一大类, 同
聚肽结构的 ACL聚于另一大类。SoACLA-1与同属
C4植物的玉米(Zea mays)的 ZmACLA聚于同一个小
的进化分支, 且与同属禾本科植物的高粱(Sorghum
bicolor), 水稻(Oryza sativa)和二穗短柄草(Brachy-
podium distachyon)的 ACLA 进化关系也较近。
SoACLB-1具有与 SoACLA-1类似的聚类关系。
2.3 O−2&产生速率和 ABA含量变化
CA、WS、WSA处理均导致甘蔗叶片及根系超
氧阴离子自由基( O−2& )产生速率显著上升(图 4), 但
趋势有所不同。在叶中(图 4-A), CA处理在 12 h O−2&
产生速率达到极值, 24 h后有所下降, 可仍比对照高
出 37.1%, WS 处理的O−2&产生速率在处理期间一直

图 3 ACL蛋白系统发生树
Fig. 3 Phylogenetic tree of ACL proteins
分支上的数字表示 Bootstrap验证中该分支可信度百分比, 蛋白名称前 2位为物种缩写, 全称见英文注释, 括号内为登录号。
The numeric values in each node represent percentage of homology amongst ACLs verified by bootstrap, the accession number of each pro-
tein is listed in the bracket, and first two characters before the protein names indicate abbreviations of species as follows: Ac: Aspergillus
clavatus; Ag: Anopheles gambiae; Am: Ailuropoda melanoleuca; Ao: Aspergillus oryzae; Ap: Acyrthosiphon pisum; At: Arabidopsis thaliana;
Bd: Brachypodium distachyon; Ci: Ciona intestinalis; Co: Capsaspora owczarzaki; Cp: Cavia porcellus; Cr: Chlamydomonas reinhardtii; Cs:
Camellia sinensis; Dd: Dictyostelium discoideum; Dg: Drosophila grimshawi; Dm: Drosophila melanogaster; Dp: Dictyostelium purpureum;
Ec: Equus caballus; Gm: Glycine max; Gu: Glycyrrhiza uralensis; Hs: Homo sapiens; La: Lupinus albus; Mb: Monosiga brevicollis; Mm: Mus
musculus; Mr: Megachile rotundata; Mt: Medicago truncatula; Oa: Ovis aries; Os: Oryza sativa; Ps: Picea sitchensis; Rc: Ricinus communis;
Rn: Rattus norvegicus; Sb: Sorghum bicolor; Sm: Selaginella moellendorffii; So: Saccharum officinarum; Sp: Schizosaccharomyces pombe;
Ss: Sus scrofa; Ta: Thermovibrio ammonificans; Tc: Tribolium castaneum; Vv: Vitis vinifera; Xt: Xenopus tropicalis; Zm: Zea mays.
第 11期 李长宁等: 甘蔗 ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析 2029


呈上升趋势, 在 24 h比对照高出 82.4%, WSA处理
在各取样时间段都比对照显著提高 , 但低于同期
WS处理的O−2&产生速率; 在根中, CA处理 6 h后O−2&
产生速率达到极值, 后随时间推移而下降(图 4-B);
WS 处理在各取样时间点分别比对照增加 87.3%、
113%、119.5%、138.8%和 149.8%, WSA 处理分别
增加 80.5%、98.1%、105.6%、117.3%和 128.1%。
CA、WS和 WSA处理均显著提高甘蔗叶片(图
4-C)和根系(图 4-D)的 ABA 含量。CA 处理的叶片
ABA含量在 12 h达极值, 根系在 6 h达极值后呈下降
趋势; WS和WSA处理的 ABA含量变化趋势相对一
致, 均随着胁迫时间延长含量逐渐升高, 叶片中WS
及 WSA处理 ABA含量均在处理 9 h达到极值; 根
系中, 2个处理均在 12 h达到极值, 24 h内保持稳定。

图 4 不同处理条件下甘蔗叶片(A, C)和根系(B, D)中 &-2O 产生速率及 ABA含量变化
Fig. 4 &-2O producing rate and ABA content in leaves (A, C) and roots (B, D) of sugarcane seedlings under different treatments
相同处理时间内, 标有不同字母的处理间在 0.05水平差异显著。
Bars superscripted by a different letter are significantly different at the 0.05 probability level at the same time of different treatments.

2.4 SoACL表达分析
由图 5 可知, 甘蔗叶片及根系中 SoACLA-1 和
SoACLB-1 基因均受到 CA、WS、WSA 处理的诱导
使表达量升高, 但叶片中 2个基因表达量均远高于
同处理条件下根系的表达量。叶片中, CA、WSA处
理下 2个基因表达量均在 9 h达极值, WS处理在 12
h 达最大值, 后表达量均比最大值有所下降; 根系
中, 3个处理条件下 2个基因表达量最大值均出现在
处理 12 h。不同处理条件下, 叶片及根系中 2 个基
因表达极值均出现在 WS 处理 12 h, 此时叶中
SoACLA-1 和 SoACLB-1 表达量分别是对照的 16.53
倍和 17.12 倍, 根中表达量分别是对照 3.89 倍和
3.92 倍。相同部位和处理下 2 个基因表达量并无明
显差异。
2030 作 物 学 报 第 38卷


图 5 不同处理条件下甘蔗叶片(A, B)和根系(C, D)中 SoACL表达量变化
Fig. 5 Changes of SoACL expression in leaves (A, B) and roots (C, D) of sugarcane seedlings under different treatments
相同处理时间内, 标有不同字母的处理间在 0.05水平差异显著。
Bars superscripted by a different letter are significantly different at the 0.05 probability level at the same time of different treatment.

3 讨论
ATP 柠檬酸裂解酶 (ACL)作为催化细胞质中
acetyl-CoA 合成的关键调控酶, 在生物体的正常生
长发育中发挥着重要的作用 [5,9,14]。本研究通过
RACE和电子克隆得到编码甘蔗 ACL蛋白的 2个亚
基基因 SoACLA-1 和 SoACLB-1。序列分析表明, 它
们拥有完整的编码框, 所编码蛋白与其他物种相比,
在重要的功能域区间如底物结合位点和磷酸化位点
等, 序列均高度保守, 显示所获得基因序列的准确
性和该基因进化保守性。由于甘蔗和拟南芥 ACL同
属杂聚肽结构 , 而人(Homo sapiens)等哺乳动物的
ACL 属于同聚肽结构, 多序列比对时, 杂聚肽 ACL
两个亚基间比同聚肽 ACL 缺省 60 个氨基酸残基,
据推测与动物界的进化史早期发生 ACLA 与 ACLB
基因的融合有关[13]。
ABA影响着植物众多基因的转录调控[22-23]。本
研究结果表明, 甘蔗 SoACLA-1和 SoACLB-1基因均
受 CA、WS 及 WSA 处理诱导使表达量上升。逆境
胁迫下植物体内的 ABA 含量会增加, 外施 ABA 处
理能进一步提高内源 ABA的含量, 正常条件下, 外
施 ABA处理亦会使植物内源 ABA含量上升[24]。本
研究结果表明, 相同处理期内, CA、WS的 ABA含
量均高于对照, WSA处理的含量高于前述 2个处理,
证实了 Ye 等[24]的研究结果。ACL 与植物倍半萜[25]
和类胡萝卜素[26]的合成密切相关, ABA本身就是一
种具有倍半萜结构的植物激素 , 而类胡萝卜素为
ABA合成的重要前体物质, 但 ACL活性与 ABA合
成是否存在定量关系, 还需进一步研究证实, 在本
研究中 WSA 的 ABA 含量高于同期 WS 处理, 但
ACL的表达量并不存在上述的对应关系。
第 11期 李长宁等: 甘蔗 ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析 2031


植物代谢过程中活性氧(ROS)的产生不可避免,
生物及非生物胁迫常导致细胞 ROS 含量急剧上
升[27]。本研究结果显示, WS 处理的O−2&产生速率显
著高于对照, 证实了前人的研究, ROS 作为重要的
第 2信使, 在 ABA信号传导中扮演重要角色, 这可
能是 CA处理O−2&产生速率高于对照的原因。已有研
究表明, 逆境胁迫下外源ABA能提高植物抗氧化防
护系统相关酶的活性, 加强 ROS 清除能力[28], 从而
导致 WSA的O−2&产生速率低于 WS处理。TCA循环
中的顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱
氢酶等在遭受 ROS攻击时活性会降低[29-30], 导致柠
檬酸在线粒体中的积累并促使其加速向细胞质中转
运[31], 底物的增加使胞质中 ACL活性提高[32], 加快
柠檬酸的分解以满足下游物质合成对底物的需求。
本研究结果表明, WS 处理的O−2&产生速率均高于其
余 2 个处理, 与此对应的是 SoACL的表达量亦高于
2个处理, 证实 ROS与 ACL的密切关系。
此外, ACL还与根系分泌物相关。研究证实, 在
可吸收无机离子缺乏的土壤环境中, 植物根系可向
外分泌羧化物作为有机螯合剂去活化难溶离子, 促
进植物对它们的吸收利用, 柔嫩及成熟根系分别以
分泌苹果酸盐和柠檬酸盐为主[33-34], ACL 催化产物
草酰乙酸为苹果酸合成的重要底物。水分胁迫会致
使根系细胞的水势降低, 导致吸收困难, ACL 活性
提高将加速草酰乙酸积累并提高苹果酸的合成, 有
助于根系分泌物增加, 利于根系对无机离子的吸收
以维持植物体正常生长的需要。研究证实, ACL 催
化产物草酰乙酸和 ADP 对其催化反应存在反馈调
节机制[35], 这可能是 ACL在达到表达极值后表达量
随之减少的原因, ACL 两个亚基组合对其活性来说
必不可少, 当 2个亚基的摩尔数相等时 , 该酶活性
达到最大值 [36], 这可能就是 2个亚基编码基因表达
量并无差异的原因。
4 结论
编码甘蔗 ACL 蛋白 2 个亚基的基因 SoACLA-1
和 SoACLB-1, 其推测的氨基酸序列与其他物种具有
高度同源性, 且关键功能域区间的序列高度保守。2
个基因均受 ABA、水分胁迫、水分胁迫加 ABA 处
理诱导表达, 但叶中表达量显著高于根系; 2个基因
表达量与 ABA、ROS含量关系密切, 推测该蛋白参
与 ABA调控的植物对逆境胁迫响应的代谢过程。
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