全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(8): 1336−1341 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2009ZX08001-026B)和湖南省科技重大专项(2009FJ1004-1)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 陈信波, E-mail: xinbochen@live.cn
Received(收稿日期): 2010-02-09; Accepted(接受日期): 2010-04-21.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01336
3 个水稻 WAX2 同源基因表达的组织特异性及逆境响应特征
高国赋 1,2 邹 杰 1 周小云 1 刘爱玲 1,3 魏宝阳 3 陈信波 1,3,*
1湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室, 湖南长沙 410128; 2湖南省农业科学院科技情报研究所, 湖南长沙 410125; 3湖南农
业大学生物科学技术学院, 湖南长沙 410128
摘 要: 利用拟南芥的WAX2基因序列BLAST检索出 3个水稻同源基因, 命名为OsWAX2-1、OsWAX2-2和OsWAX2-3,
与拟南芥 WAX2 基因的同源性分别为 56.0%、55.2%和 52.0%; 其预测的编码蛋白与 WAX2 蛋白的同源性分别为
61.5%、60.5%和 64.7%。这 3 个蛋白都分别存在 4 个跨膜结构区和 1 个甾醇去饱和酶的保守区, 说明它们都属于跨
膜蛋白并可能与角质层的蜡质合成有关。采用半定量 RT-PCR 方法检测 3 个 OsWAX2 基因在水稻不同部位的表达情
况, 及高温、低温、NaCl、PEG和 ABA 5种处理对 3个 OsWAX2基因在转录水平表达的影响。结果表明, 3个 OsWAX2
基因在水稻中的表达存在时空差异, 3个基因在水稻萌动的胚中表达量都很高, OsWAX2-3基因在叶中的表达量最高;
3 个 OsWAX2 基因对高温、低温、盐、干旱及 ABA 胁迫响应也存在差别, OsWAX2-1 只在 ABA 处理时增强表达;
OsWAX2-2受高温、低温、盐、干旱胁迫及 ABA诱导并且响应迅速。这一结果为进一步研究 OsWAX2基因在水稻生
长发育过程及逆境胁迫下的功能与作用机制提供了参考。
关键词: 水稻; WAX2同源基因; 半定量 RT-PCR; 表达; 逆境响应
Tissue Speciality and Stress Responses in Expression of Three WAX2 Homolo-
gous Genes in Rice
GAO Guo-Fu1,2, ZOU Jie1, ZHOU Xiao-Yun1, LIU Ai-Ling1,3, WEI Bao-Yang3, and CHEN Xin-Bo1,3,*
1 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2 Research Institute of Sci-
ence and Technology Information, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China; 3 College of Bioscience and Biotechnology,
Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
Abstract: Plant surface is covered by epidermis with a layer of wax. It can regulate non-stomatal water loss, protect against ultra-
violet radiation damage and germ invasion. WAX2 gene in Arabidopsis is involved in cuticular wax production and significantly
affects leaf water evaporation. Three WAX2 homologous genes in rice, named OsWAX2-1, OsWAX2-2, OsWAX2-3 were found by
BLAST search in the NCBI database, with the homology of 56.0%, 55.2%, and 52.0% to Arabidopsis WAX2 gene respectively.
Homology of their predicted proteins to Arabidopsis WAX2 protein was 61.5%, 60.5%, and 64.7%, respectively. All of the three
proteins had four transmembrane domains and a conserved sterol desaturase domain, suggesting that OsWAX2 proteins are
transmembrane proteins and may be related to plant cuticular wax biosynthesis. Expression patterns of the three rice WAX2 ho-
mologs were analyzed using semi-quantitative RT-PCR. The results showed that the three OsWAX2 genes had tissue speciality in
expression. They also exhibited different expression patterns under high-temperature, low temperature, NaCl, PEG, and ABA
treatments. These results could be useful for further functional characterization of the three OsWAX2 genes.
Keywords: Rice; WAX2 homologous genes; Semi-quantitative RT-PCR; Expression; Stress response
逆境包括生物逆境(如病害、虫害)和非生物逆境
(如干旱、高盐、高温、低温、高光强等)。近年来, 由
于全球生态环境恶化和温室效应的影响, 干旱和高
温等逆境严重影响农作物的生长和产量。特别是水
资源匮乏已是全球农业生产面临的严峻问题。提高
植物耐旱能力可通过多种途径进行调控, 如水分吸
收、运输、渗透调控、气孔水分蒸发等。表皮覆盖
的角质层是植物最外面的保护层, 能限制植物非气
孔性水分丧失, 降低植物体表水分蒸发而具保水抗
旱作用; 同时, 角质层还可作为紫外线辐射的保护
第 8期 高国赋等: 3个水稻 WAX2同源基因表达的组织特异性及逆境响应特征 1337


层, 并能抵抗病菌的侵入[1-3]。因此通过调控表皮蜡质
降低非气孔水分蒸发可能是植物耐旱节水的新途径。
Chen 等[4]从拟南芥中克隆并鉴定出第一个能同
时影响上表皮蜡质层和角质膜层的组成和结构的基
因 WAX2, wax2 突变体比野生型角质层轻 20%但厚
36%, 蜡质组分总量降低 78%以上, 叶面非气孔途
径的水分蒸发显著增强。这表明 WAX2 基因与植物
抗蒸腾能力有关。Kurata 等[5]随后也报道了 WAX2
基因(另命名为 YOURE-YOURE)的克隆与基因表达
部位的研究。WAX2(YOURE-YOURE)只在茎表皮分
生组织和嫩叶、茎、果实和根的形成初期的细胞中
特定表达, 在生长的表面毛上高表达。表皮蜡质的
合成除了受发育状况的控制以外, 还对环境信号, 如
光强、光周期、湿度、寒冷和季节变化等做出响应。
我们利用拟南芥的 WAX2 基因序列, BLAST 检
索出 3 个水稻 WAX2 同源基因, 对其进行生物信息
学分析并采用半定量 RT-PCR 方法进行表达研究,
以期为阐明 OsWAX2 基因在水稻生长发育过程及逆
境胁迫下的功能与作用机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试水稻品种 粳稻品种日本晴 (Oryza
sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare), 由湖南农业
大学水稻基因组实验室提供。
1.1.2 试剂 Trizol购于 Invetrogen公司; 逆转录
酶(ReverTra Ace)和 RNA inhibitor购于 Toyobo公司;
Taq DNA Polymerase, RNase-free DNase I 购于
Fermentas (MBI)公司; 氯仿、水饱和酚、异丙醇、
醋酸钠、乙醇等为国产分析纯。
1.1.3 引物 用引物设计软件 Primer5 设计引物,
引物序列如表 1所示。

表 1 PCR 扩增基因所用引物
Table 1 Primers used in PCR amplification
基因
Gene
上游引物
Upstream primer (5′–3′)
下游引物
Downstream primers (5′–3′)
ACTIN CTTCAACACCCCTGCTATG ACATCTGCTGGAATGTGC
OsWAX2-1 AGGACTCCAATTTCTGCCTGTT GCACTTTGACGCCCATCTT
OsWAX2-2 ACCACTTCGTCCTCCTCCC CACCAGCCACGTCTTGCA
OsWAX2-3 AGATCGACAGGGAGTGGGACT AACGGCTGCACCGAGAAGG

1.2 方法
1.2.1 OsWAX2 基因的生物信息学分析 以拟南
芥 WAX2蛋白和 WAX2 cDNA序列分别在 GenBank
中对水稻蛋白和基因进行 BLAST检索, 同源性采用
CLUSTAL 和 DNAMAN 软件分析。采用 TMHMM
软件分析水稻 WAX2 同源蛋白的跨膜结构 , 在
NCBI 网站输入蛋白质序列直接进行序列保守区功
能分析。
1.2.2 OsWAX2 基因的表达部位检测 取水稻三
叶期幼苗的根、孕穗期后期的穗、穗下节间、剑叶、
倒二鞘及水稻日本晴种子经蒸馏水浸泡 48 h后切下
的萌动胚 , 经液氮速冻后存于−80℃用于提取总
RNA。
1.2.2.1 水稻总 RNA 的提取 采用 Trizol 试剂抽
提方法提取水稻总RNA以总RNA 17 µL加 10×buffer
2 μL、DNase 1 μL混匀, 瞬时离心, 37℃反应 30 min;
再加 2 μL 25 mmol L−1 EDTA, 65℃保温 10 min, 终止
反应, 取出进行下一步或置−80℃保存待用。
1.2.2.2 水稻总 RNA反转录合成第一链 在 0.2
mL的离心管中加入总 RNA 10 μL、10×buffer 4 μL、
dNTP 2 μL、oligdt 2.5 μL、inhibitor 0.5 μL、Ace 1 μL
混匀, 瞬时离心, 42℃反应 1 h; 95℃ 5 min 终止
反应。
1.2.2.3 PCR 扩增检测 OsWAX2 基因表达 PCR
反应引物见表 1。PCR程序为 94℃ 4 min, (94 30 s, ℃
58 30 s, 72℃ ℃ 1 min), 循环次数根据基因表达情况
确定(OsWAX2-1、OsWAX2-2、OsWAX2-3 的循环数
分别为 34、32和 32), 72℃ 8 min, 之后取 6 μL产物
进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。以水稻 ACTIN基因
特异性引物(表 1)扩增的 ACTIN基因(RAc1, 登录号
为 AB047313)产物为内标准(循环数 28)。
1.2.3 OsWAX2 基因的逆境表达 将水稻日本晴
种子 37℃催芽后, 播于装有细沙的瓷盘上, 置人工
气候箱, 25℃, 相对湿度 80%, 光照强度 202.5 μmol
m−2 s−1和 12 h d−1光周期条件下培养, 每天浇水。20
d 后当水稻苗长到三叶期时进行试验。设高温
1338 作 物 学 报 第 36卷

(42℃)、低温(8℃)、模拟干旱(10% PEG)、高盐(100
mmol L−1 NaCl)、ABA (100 μmol L−1) 5个处理, 模
拟干旱、高盐胁迫及 ABA处理形式为营养液加入相
关物质, 每个处理分 8个时间段(0.25 h、0.75 h、1.5
h、3 h、5 h、8 h、12 h、24 h), 每个时间段取 10株
水稻苗; 对照不进行处理。剪取水稻苗的地上部分,
经液氮速冻后存于−80℃, 用于提取总 RNA。
提取水稻总 RNA及后续实验步骤同 1.2.2。
2 结果与分析
2.1 OsWAX2基因的生物信息学分析
以 OsWAX2基因全长 cDNA对水稻 DNA BLAST
得到 3个与 WAX2基因具高度同源性的全长 cDNA序
列 AK070469(基因位点 RAP: Os06g0653000, MSU/
TIGR: LOC_Os06g44300.1), AK066569 (基因位点
RAP: Os02g0178800, MSU/TIGR: LOC_Os02g08230.1),
AK060786 (基因位点 RAP: Os09g0426800, MSU/
TIGR: LOC_Os09g25850.1), 分别命名为 OsWAX2-1、
OsWAX2-2和 OsWAX2-3。它们与拟南芥 WAX2基因
的同源性分别为 56.0%、55.2%和 52.0%, 其预测的
编码蛋白与 WAX2 蛋白的同源性分别为 61.5%、
60.5%和 64.7%, 说明水稻中这 3个基因编码的蛋白
同源性较高(图 1)。经跨膜结构和保守区功能分析,
这 3 个蛋白均分别具有 4 个跨膜结构和 1 个甾醇去
饱和酶的保守区, 与拟南芥中的 WAX2 蛋白具有 6
个跨膜结构以及合成蜡质的功能十分相似 [4], 可能
与角质层的蜡质合成有关。
2.2 OsWAX2基因在水稻不同部位的表达结果
通过半定量 RT-PCR 对 3 个 OsWAX2 基因的部
位表达模式进行分析表明, 3个 OsWAX2基因的表达
量在不同的部位存在差别。如图 2 所示, OsWAX2-1
基因在水稻茎中不表达, 而在其他部位均表达, 胚
中表达量最高, 叶中很低; OsWAX2-2基因在水稻日
本晴的根、茎、叶、鞘、穗、胚中均表达, 胚中最
高, 茎中次之; OsWAX2-3在水稻日本晴的根、茎、
叶、鞘、穗、胚中均表达, 胚和叶中较高。这 3个基
因在日本晴萌动胚中表达量都非常高, 而叶中表达
量最高的是 OsWAX2-3。
2.3 逆境处理 OsWAX2基因中表达结果
2.3.1 ABA处理时的表达 如图 3所示, 水稻苗
经 100 μmol L−1ABA处理时, OsWAX2-1基因表达在
处理 0.25 h明显增加, 1.5 h达最高峰, 随后下降, 5 h
恢复正常水平; OsWAX2-2基因表达在 0.25 h开始增
加, 5 h后缓慢下降, 24 h恢复正常水平; OsWAX2-3
基因表达量随处理时间延长稍有下降。
2.3.2 高温处理时的表达 如图 4 所示, 水稻苗
经 42℃高温处理时, OsWAX2-1基因表达无明显变化,
说明其表达不受高温诱导 ; OsWAX2-2 基因和
OsWAX2-3基因的表达先增加后降低, 24 h回落到原
水平; OsWAX2-2基因在高温处理 0.75 h时表达量增
加, 3 h达最高峰, OsWAX2-3基因在高温处理 0.25 h
时表达量增加, 1.5 h达最高表达量, 随后逐渐回落。
2.3.3 低温处理时的表达 如图 5 所示, 水稻苗
经 8℃低温处理时, OsWAX2-1基因表达无明显变化;
OsWAX2-2基因表达在处理 0.25 h开始增加, 1.5 h后
缓慢下降, 但一直保持在较高水平; OsWAX2-3基因
表达稍有增加, 随后缓慢回落。
2.3.4 PEG 处理时的表达 如图 6 所示, 水稻苗
经 10%PEG处理时, OsWAX2-1基因表达量无明显增
加; OsWAX2-2基因和 OsWAX2-3基因表达量于处理
3 h增加并维持较高表达水平。
2.3.5 NaCl处理时的表达 如图 7所示, 水稻苗
经 100 mmol L−1 NaCl处理时, OsWAX2-1基因表达
量无明显增加; OsWAX2-2基因在处理 0.75 h时表达
量增加, 3 h达最高表达量, 随后回落并保持较高水
平, OsWAX2-3基因的表达略有下降。
3 讨论
目前, 人们对参与植物角质层蜡质合成代谢途
径的基因及基因的调控并不清楚, 本研究在水稻中
检索出 3个WAX2同源基因, 它们可能与角质层的蜡
质合成有关。
许多研究表明, 基因在不同的生长发育阶段和
不同的部位表达模式及表达丰度存在很大差异。本
研究发现这 3个基因的表达存在差异, 3个基因在萌
动胚中都有很高的表达 , 尤其是 OsWAX2-1 和
OsWAX2-2 的表达量最高, 推测它们在种子萌发过
程中可能起重要作用; 3 个基因在幼穗中都有表达,
可能与水稻花粉的发育有关; OsWAX2-3在叶中高表
达, 推测其可能在合成蜡质过程中起作用。
植物激素 ABA在调节植物生长发育和逆境适应
性方面发挥重要作用。在一些非生物逆境如干旱、低
温、高盐等条件下, 植物细胞迅速积累 ABA, 并通过
ABA 介导调节逆境相关基因表达, 提高植物中通过
第 8期 高国赋等: 3个水稻 WAX2同源基因表达的组织特异性及逆境响应特征 1339




图 1 拟南芥 WAX2 蛋白与水稻的 3 个 OsWAX2 蛋白的序列比对
Fig. 1 Alignment of WAX2 with three OsWAX2 proteins
WAX2：拟南芥 WAX2蛋白; OsWAX2-1、OsWAX2-2、OsWAX2-3：水稻同源基因预测蛋白。
WAX2: Arabidopsis WAX2 protein; OsWAX2-1, OsWAX2-2, OsWAX2-3: predicted proteins of WAX2 homologous genes in rice.
1340 作 物 学 报 第 36卷



图 2 3 个 OsWAX2 基因在水稻各部位的表达
Fig. 2 Spatial expression patterns of three OsWAX2 genes



图 3 ABA 处理下 3 个 OsWAX2 基因的表达模式
Fig. 3 Effects of ABA on expression of three OsWAX2 genes



图 4 高温(42℃)处理下 3 个 OsWAX2 基因的表达模式
Fig. 4 Effects of heat shock on expression of three OsWAX2
genes



图 5 低温(8℃)处理下 3 个 OsWAX2 基因的表达模式
Fig. 5 Effects of cold treatment on expression of three
OsWAX2 genes

抗逆性[6-7]。本研究表明 OsWAX2-1、OsWAX2-2 经
ABA 处理时增强表达, 说明这 2 个基因在逆境响应
中可能通过一条 ABA 依赖的信号途径起作用。
OsWAX2-1经 ABA处理时增强表达而在其他逆境中
表达并无明显变化, 结合部位表达结果分析, 笔者
推测 OsWAX2-1 可能在水稻生育期及种子萌发过程


图 6 PEG 处理下 3 个 OsWAX2 基因的表达模式
Fig. 6 Effects of PEG on expression of three OsWAX2 genes



图 7 NaCl 处理下 3 个 OsWAX2 基因的表达模式
Fig. 7 Effects of NaCl on expression of three OsWAX2 genes

ABA 依赖的信号途径表达重要蛋白, 这有待进行深
入研究。
本研究发现, OsWAX2-1、OsWAX2-2、OsWAX2-3
并不都受高温、低温、盐、干旱胁迫诱导, 表达模
式也存在差别。其中 OsWAX2-2受高温、低温、盐、
干旱胁迫诱导并且反应迅速, 说明该基因对逆境胁
迫敏感, 并可能在逆境胁迫响应的发起过程起重要
作用。植物在盐胁迫下启动从信号传递、相关代谢
途径到新的离子渗透平衡等一系列的应答机制。
OsWAX2-2 在盐胁迫下表达增强并维持较高水平 ,
其表达的蛋白可能有助于细胞的盐分调节。
植物在逆境下产生许多与抗逆反应相关的功能
蛋白质。有研究表明, 干旱胁迫下, 很多植物的表皮
蜡质含量都会增加[8-10]。近年来, 人们正在研究利用
蜡质相关基因提高作物产量和抗旱性。Zhang 等[10]
利用转蜡质相关基因的方法提高了苜蓿的抗旱性。
结合本研究结果, 若能将 3个 OsWAX2 基因与水稻
抗逆性的关系研究透彻, 利用基因工程的手段将其
转化到其他植物中 , 选育出具有复合抗性的植株 ,
对农业生产、环境保护将有十分重要的意义。
4 结论
检索出 3 个水稻同源基因(命名为 OsWAX2-1、
OsWAX2-2和 OsWAX2-3), 它们与拟南芥 WAX2基因
的同源性分别为 56.0%、55.2%和 52.0%, 其预测的
第 8期 高国赋等: 3个水稻 WAX2同源基因表达的组织特异性及逆境响应特征 1341


编码蛋白与 WAX2 蛋白的同源性分别为 61.5%、
60.5%和 64.7%。它们在水稻中的表达存在时空差异,
对高温、低温、盐、干旱及 ABA胁迫响应存在差别。
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ance in transgenic alfalfa (Medicago sativa). Plant J, 2005, 42:
689–707
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