全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(3): 452−458 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2007AA100701), 农业部引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目(2006-G37), 国家自
然科学基金项目(30170639)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 许莉萍, E-mail: xlpmail@yahoo.com.cn; Tel: 0591-83772604
第一作者联系方式: E-mail: queyouxiong@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2008-06-27; Accepted(接受日期): 2008-09-05.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00452
对甘蔗受黑穗病菌侵染后差异表达基因的分离与鉴定
阙友雄 杨志霞 许莉萍* 陈如凯
福建农林大学 / 农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室, 福建福州 350002
摘 要: 采用 12 个 3′锚锭引物和 8 个 5′随机引物构建引物组合, 运用 DDRT-PCR 差异显示方法, 分析 NCo376 和
F134两品种接种黑穗病菌前后的基因表达差异。经克隆、测序和半定量 RT-PCR验证, 获得 7条真实差异表达片段,
这些片段分别同 GenBank 中编码细胞色素 C 氧化酶基因、核糖体蛋白基因、NAD-依赖型苹果酸脱氢酶基因、氨基
转移酶基因、乙烯响应相关结合蛋白基因、RNA 聚合酶特异转录起始因子和反转录转座子的序列的同源性达
28%~99%。半定量 RT-PCR 分析表明, 细胞色素 C 氧化酶基因的表达受甘蔗黑穗病菌和水杨酸的调控, 不依赖于过
氧化氢的作用机制, 在甘蔗根、茎、叶中表达的抗病基因组成型表达, 但表达水平较低。推测甘蔗受黑穗病菌侵染后,
可能通过细胞色素 C 氧化酶基因的诱导, 促使植保素合成增多, 以此抵抗或抑制病原菌的胁迫。该结果丰富了甘蔗
与黑穗病菌互作的分子机制研究, 为甘蔗抗黑穗病分子育种奠定了基础。
关键词: 甘蔗; 甘蔗黑穗病; mRNA差异显示; 差异表达基因; RT-PCR
Isolation and Identification of Differentially Expressed Genes in Sugar-
cane Infected by Ustilago scitaminea
QUE You-Xiong, YANG Zhi-Xia, XU Li-Ping*, and CHEN Ru-Kai
Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Ministry of Agriculture / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
Abstract: Sugarcane smut, caused by Ustilago scitaminea Syd., is a most severe fungal disease resulting in heavy economic
losses in sugarcane production. The best way to control the disease is to breed resistant varieties. The objective of this study was
to survey the molecular mechanism of sugarcane smut resistance. Two sugarcane varieties infected by smut, consisting of NCo376
with high resistance and F134 with susceptibility, were detected to reveal the differential expression of genes regulating resistance
to smut with twelve anchored primers and eight random primers via DDRT-PCR. Seven differentially expressed polymorphic
fregments were obtained by coloning, sequencing and semi-quantitative RT-PCR validation. The results of Blast in GenBank
showed that they shared high homology (52%–97%) with cytochrome C oxidase (CCO) gene, ribosomal protein gene,
NAD-dependent malic enzyme gene, aminotransferase gene, binding protein gene and retrotransposon, respectively. The results of
semi-quantitative RT-PCR indicated that while CCO gene expression was regulated by U. sticaminea and salicylic acid (SA), its
expression was independent on H2O2. Besides, CCO gene expressed in root, stalk and leaf of sugarcane at a relatively low level.
From described above, it was inferred that the synthesis of phytoalexin induced by CCO inhibited the pathogen after infection.
The results provided useful information for further understanding the molecular mechanism of sugarcane-smut interaction.
Keywords: Sugarcane; Ustilago scitaminea Syd.; mRNA differential display; Differentially expressed gene; RT-PCR
甘蔗黑穗病是由黑粉菌(Ustilago scitaminea Syd.)
引起的一种气传真菌病害, 该病成为所有种植甘蔗
的国家和地区最主要的真菌性病害, 曾先后淘汰了
一些丰产高糖的当家品种, 造成感病品种蔗茎产量
和蔗糖分的严重损失[1-2]。
有一些与黑穗病抗性有关的甘蔗形态学、细胞
学和生理学研究的报道[3-4], 但甘蔗与黑穗病菌互作
的分子基础研究仍处于起步阶段。Orlando等[5]利用
cDNA-AFLP技术研究了甘蔗与黑穗病菌互作后的
分子响应, 获得了 62条差异表达基因, 其中 52条为
第 3期 阙友雄等: 对甘蔗受黑穗病菌侵染后差异表达基因的分离与鉴定 453

上调表达, 10条下调表达。Que等[6]克隆了甘蔗NBS-
LRR类抗病相关基因, 并利用定量PCR技术研究了
该基因在甘蔗对黑穗病抗性响应机制中的可能作
用。对于植物和病原生物互作系统, 已开发出多种
技术可在RNA水平上研究其基因表达, 其中差异显
示反转录PCR (differential display reverse transcrip-
tion PCR, DDRT-PCR)是应用较广泛的一种[7-9], 该
技术可以同时检测两种或多种处于不同发育时期或
生长环境中的细胞或组织间的基因差异表达。而且,
在放射性差异显示技术基础上发展起来的荧光差异
显示技术, 在样品使用量、灵敏度和重复性等方面
进一步得到改善 , 通过对总RNA、引物、cDNA、
dNTP等关键试剂用量的控制和PCR反应的优化, 可
部分克服传统DDRT-PCR分析中假阳性率高并免除
同位素标记污染的缺点 [10-11]。此外 , 利用半定量
RT-PCR对差异表达基因进行验证可消除假阳性[12]。
目前, 尚未见应用荧光显示DDRT-PCR技术的报道,
而相关研究的开展有望为深入了解甘蔗与黑穗病菌
互作的分子机制提供必要的信息。
本文研究甘蔗受黑穗病菌侵染后基因的差异表
达, 以期丰富甘蔗与黑穗病菌互作的分子机制研究,
为甘蔗抗黑穗病分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
甘蔗(Saccharum Complex)品种 NCo376和 F134
由福建农林大学甘蔗综合研究所提供。NCo376抗小
种 1和小种 2, F134抗小种 1但感小种 2, 分别为抗
黑穗病性鉴定所用的抗病和感病标准对照种。选试
验选用健康、生长期一致蔗茎，以 NCo376 为材料
进行细胞色素 C氧化酶基因的表达分析。
甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea Syd.)生理小
种 2, 为本实验室保存, 在甘蔗品种 F134 上繁殖。
采集植株上新鲜的发病黑穗, 装于纸袋, 经太阳晒
干或风干后密封, 储存在 4℃冰箱中备用。
反转录酶、Trizol 试剂购自 GibcoBRL 公司 ,
pMD18-T 亚克隆试剂盒购自 TaKaRa 公司, 其他试
剂均为上海生物工程技术公司产品, 水杨酸和过氧
化氢购自国药集团, 所有化学试剂均为分析纯。
1.2 试验设计
试验分 2组, 一组以NCo376和F134为材料, 经
5×105 mL−1黑穗病菌孢子悬浮液针刺接种蔗芽后保
湿沙培, 于 28℃±0.5℃生化培养箱中培养 72 h, 切
取表观正常的蔗茎芽体组织提取总RNA, 用于
DDRT-PCR分析和差异片段的半定量RT-PCR验证 ,
同时设置针刺接种无菌双蒸水为空白对照。另一组
以NCo376 为材料, 在托盆中装沙, 种植 6 盆, 每盆
30个芽, 置温度 27℃±0.5℃、每日光照 13 h、黑暗
11 h、光照强度为 440 µmol m−2 s−1的赛福PGX-380C
光照培养箱中进行培养。甘蔗长至 5叶期时, 进行 3
种处理, 即以 5×105 mL−1黑穗病菌孢子悬浮液针刺
接种甘蔗芽部组织, 以 5 mmol L−1 SA水溶液喷甘蔗
叶面, 以 10 mmol L−1 H2O2水溶液喷甘蔗叶面。同时
以蒸馏水处理作为对照。选择生长比较一致的 20株,
取其+1叶、+2叶和+3叶混合, 在处理后 0、6、12、
24、48、60和 72 h用直径 1 cm打孔器取样, 每叶片
取一块, 同时收集其中 1份对照样品根、茎组织, 立
即用液氮固定 , 置–80℃冰箱保存 , 用于提取RNA,
进行细胞色素C氧化酶基因的表达分析。
1.3 RNA提取和第一链 cDNA的合成
采用改进的Trizol法提取甘蔗组织总RNA[13],
Beckman DU-640分光光度仪测定浓度, 电泳检测质
量。在PCR管中加入 3.0 µL总RNA (1 µg µL−1), 2.0
µL 3′端锚定引物(AP), 加双蒸水(DEPC处理)至 12.0
µL, 混合均匀, 70℃预反应 5 min, 快速置冰上冷却。
而后顺序加入 4.0 µL 5×RT缓冲液, 2.0 µL dNTP混合
物(各 250 µmol L−1), 2.0 µL DTT(100 µmol L−1), 0.2
µL superscript II (200 U µL−1), 充分混匀, 放入带有
热盖的PCR仪(型号：Eppendorf Mastercycler gradi-
ent), 反应条件为 42℃ 5 min; 50℃ 60 min; 72℃ 15
min; 保持在 4℃, –20℃保存备用。
1.4 DDRT-PCR反应
以T7 荧光锚定引物和M13 随机引物配置成不
同组合, 进行PCR。10 µL PCR反应体系中含 2.0 µL
cDNA, 1.0 µL 10×PCR缓冲液, 0.7 µL Mg2+(终浓度
3.75 mmol L−1), 2.0 µL dNTP(终浓度 50 µmol L−1)
0.7 µL 3′ TMR-AP(终浓度 2.5 pmol L−1, 引物序列
见表 1), 1.75 µL ARP(终浓度 2.5 pmol L−1, 引物序列
表 2), 0.1 µL Taq酶(终浓度 0.05 U µL−1) 0.65 µL
H2O。
PCR (Eppendorf Mastercycler Gradient)程序为
94℃ 2 min; 94℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃ 90 s, 4个循
环; 94℃ 30 s, 59℃ 30 s, 72℃ 90 s, 30个循环; 72℃
7 min; 分别在 4℃和–20℃保存。PCR产物经聚丙烯
酰胺凝胶电泳分离 , 在美国 Beckman 公司的
Genomyxlr DNA测序/差异显示系统上分析, 有关操
作按该公司的说明书进行。

454 作 物 学 报 第 35卷

表 1 DDRT-PCR所用的锚定引物序列
Table 1 Anchored primer sequences used in DDRT-PCR
引物名称
Primer code
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
TMR-T7(dT12)AP1 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTGA
TMR-T7(dT12)AP2 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTGC
TMR-T7(dT12)AP3 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTGG
TMR-T7(dT12)AP4 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTGT
TMR-T7(dT12)AP5 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTCA
TMR-T7(dT12)AP6 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTCC
TMR-T7(dT12)AP7 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTCG
TMR-T7(dT12)AP8 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTAA
TMR-T7(dT12)AP9 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTAC
TMR-T7(dT12)AP10 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTAG
TMR-T7(dT12)AP11 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTAT
TMR-T7(dT12)AP12 ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTCT

表 2 DDRT-PCR所用的随机引物序列
Table 2 Random primer sequences used in DDRT-PCR
引物名称
Primer code
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
M13r-ARP1 ACAATTTCACACAGGACGACTCCAAG
M13r-ARP2 ACAATTTCACACAGGAGCTAGCATG
M13r-ARP3 ACAATTTCACACAGGAGACCATTGC
M13r-ARP4 ACAATTTCACACAGGAGCTAGCAGA
M13r-ARP9 ACAATTTCACACAGGATAAGACTAG
M13r-ARP10 ACAATTTCACACAGGAGATCTCAGA
M13r-ARP11 ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTG
M13r-ARP12 ACAATTTCACACAGGAGGTACTAAG

1.5 差异条带回收与二次扩增
采用煮沸法回收差异cDNA片段 , 用清洁锋利
的刀片切下差异条带, 浸于 30 µL TE (pH 7.4的 60
mmol L−1 Tris-Cl和 1.0 mmol L−1 EDTA混合液)中, 37
℃水浴 3 h后置–20℃保存备用。各取 2.0 µL M13和
T7 引物进行二次扩增, T7 为 5′-GTAATACGACG
ACTCACTATAGGGC-3′; M13为 5′-AGCGGATAAC
AATTTCACACAGGA-3′。
二次扩增体系为 2.0 µL 10×PCR缓冲液、1.6 µL
dNTP(终浓度 50 µmol L−1)、0.7 µL Mg2+(终浓度 3.75
mmol L−1)、2.0 µL M13引物(终浓度 2.5 pmol L−1)、
2.0 µL T7引物(终浓度 2.5 pmol L−1)和 0.2 µL Taq (终
浓度 0.05 U µL−1)酶, 加水至总体积 20 µL。反应程
序为 94℃ 2 min; 94℃ 30 s, 53℃ 30 s, 72℃ 1.5
min, 4个循环; 94℃ 30 s, 62℃ 30 s, 72℃ 1.5 min,
30 个循环; 72℃ 7 min; 分别在 4℃和 –20℃保存,
用于后续克隆实验。
1.6 差异片段的克隆和序列分析
用 TaKaRa公司的 pMD18-T载体克隆差异片段,
具体步骤根据试剂盒说明书。而后分别挑取经鉴定
的阳性克隆, 送上海生物工程技术公司测序。所获
得的序列去除载体序列和相应的锚定引物和随机引
物序列后, 即为目标片段序列。所获得差异条带的
DNA 序列数据, 采用 tBlastx 程序在 GenBank 上进
行相似性搜索。
1.7 差异片段的半定量RT-PCR验证和细胞色素
C氧化酶基因的表达特性分析
以甘蔗 25S rRNA基因作为内参 , 利用Primer
premier 5.0软件设计内参基因 25S rRNA和差异表达
片段引物(表 3)。分别以 1 µg处理组和对照组甘蔗芽
体组织总RNA为模板, 利用目标差异片段对应的锚
定引物进行反转录反应, 反应体系和程序同 1.4。以
反转录产物为模板进行PCR反应, 反应体系为: 3.0
µL逆转录产物、2.0 µL 10×PCR 缓冲液(含Mg2+)、
2.0 µL dNTP (终浓度 50 µmol L−1)、上下游引物各 0.4
µL (终浓度 2.5 pmol L−1), 0.6 µL Taq酶, 用ddH2O补
足至 20 µL。同时,设置以水为模板的PCR作为阴性
对照。反应程序为 94℃预变性 5 min; 94℃ 30 s, 52
℃ 30 s, 72℃ 1.5 min, 30个循环; 72℃ 10 min; 保
持在 4℃。用 1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测。
甘蔗内参基因 25S rRNA和细胞色素C氧化酶基
因(序列名称为RI1)的引物见表 3。采用与半定量
RT-PCR相同的反应体系和程序, 进行细胞色素氧化
酶基因在SA、H2O2处理或甘蔗黑穗病菌胁迫后, 以
及甘蔗根、茎和叶片中的表达特性分析。

第 3期 阙友雄等: 对甘蔗受黑穗病菌侵染后差异表达基因的分离与鉴定 455

表 3 RT-PCR分析中使用的引物序列
Table 3 Primer sequences used in RT-PCR
序列名称
Primer code
正向引物
Primer sequence (5′–3′)
反向引物
Primer sequence (5′–3′)
RI1 GGATGTTGGCTGAAAGAA ATGGCATTTCCACGATTA
RI2 CAACCCTTCCAGCCACTT CCATTTCACGCAACATCC
RI3 GGGGTGTTGGAGTATAGGT AAAGGGAACTGCTGGTGT
RI4 TCAACTTCCTCGTGTCCC TCCAATATCCTGCCAACC
SI1 CGAGGTGTCGGTGTTGTG AGGACGCCATCGCATTAG
SI2 TGATGAACAAGATAACGACCAC AGCCAGGATTGACGAGCA
SI3 CTCCCTGGNCCGGCTT GGACCTTTGGAGCTTTGA
SI4 GATGACAAAGCCAGATGC CAATGTGCCCTGAAACAC
SI5 CTGGACAAGATGGAGGCG TCCTGCGAATGAGACACG
SI6 AAAACAGAGCCATTTCGC TTCCTTTCCTGGTCATCG
S01 GATGTTTCTGTGGGCACTA CCAACGAAATCAGCTTTAT
25S rRNA GCAGCCAAGCGTTCATAG CGGCACGGTCATCAGTAG

2 结果与分析
2.1 RNA提取与差异 cDNA片段的获得
所提取的处理组和对照组甘蔗芽体组织总RNA
琼脂糖凝胶电泳结果(图 1)。图 1显示所有RNA样品
均有明显的 5S、18S和 28S三个条带, 且带形完好,
28S与 18S吸光度比值约为 2; 紫外分光光度计进行
定量分析结果A260/A280均在 1.98~2.05 之间, 浓度约
为 2 µg µL−1。电泳和定量分析结果说明RNA样品无
明显的降解和DNA污染, 质量好, 符合后续试验操
作的要求。



图 1 供试材料的总 RNA电泳图
Fig. 1 Agarose electrophoresis of total RNA
1: NCo376接种后; 2: NCo376接种前; 3: F134接种后;
4: F134接种前
1: NCo376 treatment; 2: NCo376 control; 3: F134 treatment;
4: F134 control.

所有 DDRT-PCR 反应均有扩增产物, 说明采用
的条件比较适合差异显示分析, 其中无论是高抗黑
穗病甘蔗品种NCo376, 还是感黑穗病品种 F134, 处
理前后样品中大多数扩增条带相同, 仅获得了 11条
大于 350 bp的处理与对照间差异表达的多态性片段
(图 2)。11条多态性片段中, 10条来自病原菌接种的
处理组芽体组织, 其中 RI1、RI2、RI3、RI4等处理
后诱导表达的差异片段来自 NCo376, SI1、SI2、SI3、
SI4、SI5 和 SI6 六条处理后诱导表达的差异片段来
自 F134; 仅有 1条来自 F134对照组, 记为 S01。此
外, 处理组和对照组之间还存在一些仅在表达量上
存在差异的条带, 未纳入本研究的范畴。以上结果
说明甘蔗受到黑穗病菌胁迫后既诱导了某些基因的
表达, 也抑制了某些基因的表达, 但以诱导某些基
因的特异表达为主, 而表达受到抑制的基因数相对
较少。差异片段的二次 PCR扩增结果见图 3。



图 2 DDRT-PCR部分产物的电泳图
Fig. 2 Electrophoresis of the parts of DDRT-PCR products



图 3 差异片段的二次扩增电泳图
Fig. 3 Electrophoresis of re-amplication PCR products of the
differential expressed cDNA fragments
0: 空白对照; 1~4: RI1~RI4; L5~L11: SI6: SI5、SI4、S01、SI3、
SI2和 SI1; M: DNA marker。
0: control; 1–4: RI1–RI4, respectively; 5–11: SI6, SI5, SI4, S01,
SI3, SI2, and SI1, respectively; M: DNA marker.

2.2 同源性序列比对分析
将 11 条差异表达片段的序列与 GenBank 中已
知的序列进行 tBlastx同源性比对(表 4), 发现在抗病
品种 NCo376 病原菌接种芽体组织中差异表达的片段
RI1 与水稻线粒体 DNA 同源性达 99% [Oryza sativa

456 作 物 学 报 第 35卷

表 4 差异表达片段及其 tBlastx结果
Table 4 Differentially expressed fragments and their tBlastx results
序列名称
Sequence code
登录号
Accession No.
引物组合
Primers combination
来源
Source
同源基因(登录号)
Homologous gene (accession No.)
同源性
Homology(%)

RI1 FK939136 AP7*ARP3 NCo376 细胞色素氧化酶基因(AAX99137)
Cytochrome C oxidase gene (AAX99137)
99

RI2 FK939139 AP7*ARP3 NCo376 核糖体蛋白基因(NP001050397)
Ribosomal protein gene (NP001050397)
97

RI3 FK939140 AP7*ARP3 NCo376 NAD-依赖苹果酸脱氢酶基因 (P37224)
NAD-dependent malic enzyme gene (P37224)
92

RI4 --------- AP7*ARP3 NCo376 核糖体蛋白基因(AAW50982)
Ribosomal protein gene (AAW50982)
94

SI1 FK939141 AP8*ARP11 F134 氨基转移酶基因(AAK43507)
Aminotransferase gene (AAK43507)
86

SI2 -------- AP7*ARP4 F134 结合蛋白基因(NP178360)
Binding protein gene (NP178360)
69

SI3 FK939137 AP7*ARP4 F134 乙烯响应相关结合蛋白基因(AAP32467)
Ethylene-responsive element binding protein gene
(AAP32467)
69

SI4 FK939142 AP7*ARP11 F134 RNA聚合酶特异转录起始因子(BAD45609)
RNA polymerase specific transcription initiation
factor (BAD45609)
71

SI5 ---------- AP7*ARP11 F134 未知蛋白基因(XP962912)
Unknown protein gene (XP962912)
30

SI6 ---------- AP8*ARP11 F134 未知蛋白基因(CAM45305)
Unknown protein gene (CAM45305)
28

S01 FK939138 AP7*ARP11 F134 反转录转座子(ABF97201)
Retrotransposon protein gene (ABF97201)
35

(japonica cultivar-group) mitochondrial DNA], 与玉
米、高粱、水稻、小麦等作物的细胞色素氧化酶的
同源性达 95%以上, 与高粱、玉米的二色线粒体细
胞色素氧化酶的同源性达 100%, 由此推断该片段是
细胞色素氧化酶基因的部分序列。未能找到 SI5 和
SI6 的同源序列 , 可能为新基因 , 有待于进一步验
证。其余 9条序列分别与编码核糖体蛋白基因、NAD-
依赖型苹果酸脱氢酶基因、氨基转移酶基因、结合
蛋白基因、乙烯响应相关结合蛋白基因、RNA聚合
酶特异转录起始因子和反转录转座子的基因具有较
高的同源性。
2.3 半定量 RT-PCR验证
根据 DDRT-PCR 分析所获得的 11 条差异片段
的序列设计引物, 以片段来源品种(NCo376或 F134)
病原菌接种与未接种的 cDNA 为模板, 进行半定量
RT-PCR表达分析(图 4)。其中 RI4、S12、S15和 S164
条片段在进行半定量 RT-PCR 分析时, 在病原菌接
种组与未接种组均有位置一致的明显条带 , 说明
这 4个片段为假阳性片段; 其余 7条差异片段 RI1、
RI2、RI3、S11、S13、S14和 S01在利用半定量 RT-PCR
验证时, 其中 6 条仅在病原菌接种组有一条明显条
带, 未接种组无可见的条带, 而编号为 S01 条带也



图 4 11条差异表达片段的半定量 RT-PCR验证
Fig. 4 Expression validation of eleven differentially expressed bands obtained from DDRT-PCR by semi-quantitative RT-PCR
Tr、C和 O分别表示样品处理、样品对照和空白对照。
Tr, C, and O indicate samples treatment, samples control, and control, respectively.
第 3期 阙友雄等: 对甘蔗受黑穗病菌侵染后差异表达基因的分离与鉴定 457

仅在未接种组中出现, 说明这 7条差异片段均为真实
的差异表达片段。
2.4 细胞色素 C氧化酶基因的表达特性分析
图 5显示, 细胞色素C氧化酶(cytochrome C oxi-
dase, CCO)基因受到甘蔗黑穗病菌、SA或H2O2胁迫
后的表达特点是不同的。病原菌胁迫下, 该基因的
表达量随着处理时间的延长而逐渐升高, 说明该基
因的表达受甘蔗黑穗病菌所诱导。水杨酸处理后 ,
该基因在 0~24 h表达量低, 在 36 h表达量明显增加,
并在其后保持一个相对稳定的表达态势, 说明该基
因的表达受水杨酸调控。H2O2处理后, 该基因的表
达维持在一个相对稳定的状态, 没有明显的诱导或
者抑制表达的作用, 推测该基因具有不依赖于H2O2
的作用机制。从图 6看出, CCO基因在甘蔗根、茎和
叶片组织中组成型表达, 表达量没有明显差异, 且
表达量较低, 因此甘蔗中该基因的表达情况符合抗
病基因的表达特点。根据以上结果, 推测CCO基因
在甘蔗应对黑穗病菌的侵染及后续抗性反应机制中
具有重要的作用。



图 5 细胞色素 C氧化酶基因在不同处理下的表达
Fig. 5 Expression profile of cytochrome C oxidase gene under
different treatments
NC: 阴性对照; 0~6: 0、12、24、36、48、60和 72 h样品。
NC: control; 0–6: 0, 12, 24, 36, 48, 60, and 72 h, respectively.



图 6 细胞色素 C氧化酶基因的组织特异表达
Fig. 6 Expression profile of cytochrome C oxidase gene in
various tissues
NC: 阴性对照; 1~3: 根、茎和叶样品。
NC: control; 1–3: root, stalk, and leaf, respectively.
3 讨论
如何排除 DDRT-PCR分析中的差异片段的假阳
性是获得客观研究结果的关键, 涉及试验材料的选
择、试验过程中有关对照的设置以及差异片段的验
证等环节。本研究选择公认的甘蔗抗黑穗病性鉴定
标准对照品种 NCo376 和 F134 为材料, 抗性明确,
同时, 以生长期一致的蔗茎为研究材料, 以尽量减
少除目标性状外其他遗传背景的差异。通过空白对
照和阳性对照的设置, 保证了所用试验材料真实反
映病原菌胁迫的差异 , 尽量满足DDRT-PCR分析对
试验材料的要求。在获得差异表达片段后, 采用半
定量RT-PCR进行验证, 以排除假阳性的差异片段。
实验结果表明, 11 条DDRT-PCR筛选出的潜在差异
表达片段中, 7条经验证为真实差异片段, 占 63.6%,
假阳性率仅为 36.4%, 而通常的假阳性率为 70%以
上[8]。说明通过严格控制材料一致性和对照设置, 结
合半定量RT-PCR验证, 有助于在DDRT-PCR分析中
获得可靠的结果。
植保素(phytoalexin)在植物的抗病过程中起着
相当重要的作用, 其合成是植物抵抗病原微生物侵
染的防卫反应之一。在植保素合成过程中, 已发现 2
种类型的酶在其中起重要的调节作用, 一种是色氨
酸合酶a (TSA)的同系物(tryptophan synthase a ho-
molog), 一种是细胞色素氧化酶。本研究中, 编号为
RI1 的差异表达片段与细胞色素C氧化酶基因具有
较高的同源性, 与抗病性密切相关, 对其进行了更
深入的研究。根据前人的研究结果, 水杨酸和过氧
化氢是早期的信号诱导因素, 它们可以起着类似第
二信使的作用, 参与植物的超敏反应HR (hypersen-
sitive response)和系统获得性反应(systemic acquired
resistance, SAR), 在植物的抗病信号转导和抗病性
反应中起着重要作用[14-16]。为此, 结果显示了该基
因在抗病甘蔗品种NCo376中的表达受病原菌、水杨
酸的调控, 为诱导表达型基因,但该基因的表达不依
赖过氧化氢, 而且, 在甘蔗根、茎、叶中低水平组成
型表达, 说明该基因参与系统获得性反应, 具有抗
病基因的共性[17]。抗病甘蔗品种(如NCo376)可能通
过细胞色素C氧化酶基因的诱导表达 , 促使植保素
合成增多, 抵抗或抑制外来病原菌的胁迫, 从而增
强品种的抗病性。核糖体是蛋白质合成的主要结构
成分和场所, 其数量与蛋白质合成密切相关。编号
为RI2 的差异表达片段与编码核糖体蛋白基因的序
列有较高的同源性, 说明了甘蔗在适应黑穗病菌的
胁迫时, 大量表达相关抗性蛋白, 共同防御或者抵
抗黑穗病菌的进一步侵染。苹果酸是植物体内参与
C4 循环、景天酸循环等众多代谢途径的关键代谢
物。编号为RI3的差异表达片段与NAD-依赖苹果酸
脱氢酶基因有较高的同源性, 推测可能在甘蔗与黑
穗病菌互作后的光合响应过程中起作用。而编号为
SI4 的RNA聚合酶特异转录起始因子, 可能在甘蔗

458 作 物 学 报 第 35卷

适应黑穗病菌胁迫的响应机制中启动某些抗性相关
基因的表达。其他 3条差异表达片段, 虽然表现出同
某种特定基因较高的同源性, 但在植物抗病性过程
中的功能研究尚少, 有待于进一步研究。同时, 本研
究中发现, 抗病品种和感病品种在黑穗病菌接种前
后差异表达基因不同, 具有不同的抗性响应机制。
本文对甘蔗与黑穗病菌互作的分子机制只进行了初
步研究, 工作还不够深入, 希望能为今后的相关研
究提供一些资料。
4 结论
DDRT-PCR 分析中所获得的 7 个差异表达片段
中, RI1编码的细胞色素 C氧化酶基因, 具有抗病基
因组成性表达的特性, 参与系统获得性反应。RI2编
码核糖体蛋白基因, 是蛋白质合成的结构成分和场
所。RI3编码 NAD-依赖苹果酸脱氢酶基因, 可能在
甘蔗与黑穗病菌互作后的光合响应过程中起作用。
SI4 编码 RNA 聚合酶特异转录起始因子, 可能启动
某些抗性相关基因的表达。而其他 3 条差异表达片
段的功能未知。总之, 甘蔗与黑穗病菌分子互作是
个复杂的过程, 有众多的基因参与其中, 并且抗感
品种具有不一样的差异基因表达模式。
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