全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(1): 95−99 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 河北农业大学人才基金项目
作者简介: 王晖(1978−), 女, 山东济宁人, 硕士, 植物学专业。
* 通讯作者(Corresponding author): 刘国振。Tel: 0312-7528250; E-mail: gzhliu@genomics.org.cn
Received(收稿日期): 2007-04-03; Accepted(接受日期): 2007-07-30.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00095
玉米低植酸自交系的筛选与遗传机理的初步研究
王 晖1 陈景堂2 刘丽娟1 陈 浩1 刘国振1,*
(1河北农业大学生命科学学院; 2河北农业大学农学院, 河北保定 071000)
摘 要: 玉米、小麦、水稻及豆类籽粒中的植酸, 通常被看作抗营养因子, 所以培育低植酸作物具有重要的应用价值。
本试验通过对 20份玉米自交系的无机磷含量分析, 发现齐 319的无机磷含量接近 0.93 µg mg−1, 远高于一般材料(0.15
µg mg−1)。进一步分析表明, 其植酸磷含量为 1.31 µg mg−1, 与意大利Nielsen实验室 2003年报道的玉米低植酸突变体
lpa24/ lpa2411植酸磷含量(1.20 µg mg−1)接近, 显著低于Lpa241/Lpa241野生型和常规的玉米自交系(>2.8 µg mg−1)。
对齐 319 低植酸性状的初步遗传分析表明 , 其控制基因呈隐性遗传并可能与 lpa241/lpa241 基因等位 , 但与
lpa241/lpa241突变体中肌醇-3-磷酸合成酶(MIPS)蛋白表达量下降不同, 齐 319的MIPS蛋白质表达量显著增加, 暗示
二者的低植酸性状都与MIPS的异常表达有关, 但二者的控制机理不同。
关键词: 玉米; 自交系; 低植酸; 肌醇-3-磷酸合成酶(MIPS)
Identification of Maize Low Phytic Acid Inbred Lines and Primary
Study of Its Genetic Mechanism
WANG Hui1, CHEN Jing-Tang2, LIU Li-Juan1, CHEN Hao1, and LIU Guo-Zhen1,*
(1 College of Life Sciences; 2 College of Agronomy, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei, China)
Abstract: It is well known that the phytic acid (myo-inositol-1, 2, 3, 4, 5, 6-hexakisphosphate or Ins P6) in maize (Zea mays), wheat
(Triticum compactum), rice (Oryza sativa), and soybean (Glycine max) is an anti-nutritional factor in grains, phytic acid typically
represents approximately 80% of maize seed total phosphorus. The identification of mutants with low phytic acid (lpa) is a possible
solution to solve the problem. In this study, the content of inorganic phosphorus of twenty maize inbred lines were analyzed by col-
orimetric reagent, the inorganic phosphorus content of Qi 319 was about 0.93 µg mg−1, which was higher than that of control material
(0.15 µg mg−1), further investigation of phytic acid based on standard curve indicated that the content of phytic acid in Qi 319 grains
was 1.31 µg mg−1, close to the maize lpa241/lpa241 mutant (1.20 µg mg−1) identified by Nielsen’s laboratory in 2003, which was
significantly lower than that of Lpa241/Lpa241 wild type and control maize inbred lines (>2.8 µg mg−1). F1 seeds derived from Qi
319 and wild type Lpa241/Lpa241 crossing showed low inorganic phosphorus, indicated that the gene controlling low phytic acid of
Qi 319 was recessive, homozygous low phytic acid seed was identified from Qi 319 ×/Lpa241/lpa241 F1 seeds suggested that lpa
loci of Qi 319 may allelic to lpa241/lpa241. To investigate the mechanism of lpa in Qi 319, the content of myo-inositol-3-phophate
synthase (MIPS) was assayed Western blot by using anti-MIPS antibody derived from Arabidopsis MIPS protein, according to se
quence analysis, the similarity of amino acid between maize and Arabidopsis MIPS protein is 88%. In contrast with the low content of
MIPS in lpa241/lpa241, the expression of MIPS in Qi 319 increased significantly, suggesting that both mutants are related to MIPS,
but their mechanism is different from each other. It is worthwhile to point out that the agronomic behavior of reported lpa mutant is
not satisfying for breeding applications, while Qi 319 is a wildly used inbred line with several combinations in production. This dis-
covery will broaden its application and provide a novel resource for lpa breeding program.
Keywords: Maize; Inbred line; Low phytic acid; MIPS

96 作 物 学 报 第 34卷

植酸又称肌醇-6-磷酸, 是谷物和豆类籽粒中广
泛存在的一种有机酸, 它有 12 个可解离的氢原子,
并可与阳离子结合形成植酸盐[1-2]。成熟谷物和豆类
作物每克干种子中总磷含量一般为 3.0~5.0 mg g−1,
植酸磷为 2.0~4.0 mg g−1。植酸不能被人或单胃动物
吸收, 摄入体内后和微量营养元素结合形成植酸盐,
降低这些营养元素的生物有效性, 从而导致微量元
素缺乏症。此外, 植酸及植酸盐随粪便排出, 会造成
环境污染, 尤其是水体的富营养化。由于土壤中缺
乏分解植酸的微生物, 畜禽粪便即使作有机肥还田
仍不能被作物吸收利用[3]。
为了降低玉米饲料中的植酸含量, 通常的做法
是添加植酸酶, 但这种方法不能从根本上解决磷污
染的问题, 还提高了饲料成本。培育低植酸品种将
是解决这一问题的有效途径。目前, 通过诱变的方
法已经在玉米[4]、小麦[5]、水稻[6]、大豆[7]等作物中
获得了植酸含量较低的突变体, 但大部分低植酸突
变体的农艺性状较差, 难以用于生产实践。筛选植
酸含量低且农艺性状好的种质具有特殊的意义。
根据玉米低植酸突变体中含磷组分的比例, 可
以将其分为lpa1、lpa2 和lpa3 三种类型。lpa1 型种
子植酸磷减少, 无机磷增加; lpa2 型则在植酸磷减
少、无机磷含量增加的同时, 增加了肌醇和其他形
式的肌醇多磷酸的积累; lpa3型在植酸磷减少、无机
磷增加的同时, 仅积累肌醇, 没有其他形式的肌醇
多磷酸。3 种类型突变体的共同特征是总磷量保持
不变, 植酸磷含量减少, 无机磷含量上升[8-9]。其控
制机理也不相同, lpa1 突变体是由于肌醇-3-磷酸合
酶(myo-inositol-3-phophate synthase, MIPS)的活性下
降, 造成肌醇-3-磷酸的合成受阻, 导致植酸含量降
低[10], 2003年意大利Nielsen实验室报道的lpa241就
属于这一类型[11-12]; lpa2 突变体是因为减少多磷酸
肌醇的合成使植酸的含量下降 , 在这类突变体中 ,
报道了 2 个等位突变, lpa2-1 突变是由于磷酸激酶
(ZmIpk)的基因重排造成的, 而lpa2-2 是ZmIpk基因
编码序列中的点突变, 导致编码蛋白质的合成提前
终止, 使酶活性下降造成的 [8]; 玉米lpa3 突变是由
于肌醇激酶(MIK)基因发生突变造成的[9]。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供筛选的玉米自交系共 20份, 包括京02、郑 58、
齐 319、K12、陕 811、获唐黄、H78、K24、L1154、
P53、P138、87-1、沈 137、472、543、2208、7922、
9046、22741和 79028。玉米低植酸突变体lpa241由
意大利Studi di Milano大学Nielsen博士赠送[12]。抗拟
南芥MIPS抗体由日本神户大学Tetsuro Mimura博士
赠送[13]。植酸钠标准品购自Sigma公司, 硫酸铁铵、
2, 2′-联吡啶、巯基乙酸购于Merck公司, 抗β-actin
一抗、羊抗兔二抗购于北京博奥森公司。
1.2 高无机磷玉米自交系的筛选
测定无机磷含量采用钼蓝显色法[4]。将单粒干
种子研成粉末, 置 96 孔V型酶标板上, 按样品质量
每毫克加 0.4 mol L−1 HCl 10 µL, 4℃条件下过夜提
取。取 10 µL提取液于新的酶标板, 加 90 µL蒸馏水
和 100 µL显色剂(3 mol L−1 ︰浓硫酸 2.5% ︰钼酸铵
10% ︰抗坏血酸 蒸馏水=1︰1︰1︰2), 室温静置 1 h
后比色测定。以KH2PO4配制的溶液置酶标板上作为
标准, 含磷量依次为 0.00、0.15、0.46、0.93和 1.39
µg, 总体系为 200 µL, 显色后分别呈黄色、浅黄、
浅蓝、淡蓝和蓝色。
1.3 植酸标准曲线的制作及玉米种子植酸磷含
量的测定
配制植酸磷含量分别为 3.94、7.88、11.83、15.77、
19.71、23.65、29.59和 31.545 µg mL−1的植酸钠标准
溶液, 取 35 µL样品, 加 35 µL双蒸水, 140 µL溶液Ⅰ
(含 0.02%硫酸铁铵和 0.2 mol L−1 HCl), 盖上乳胶盖,
煮沸 30 min, 4℃冰水浴 15 min, 室温放置 20 min, 15
455×g离心 30 min, 取出 80 µL上清液置新的 96孔
板中, 加 120 µL溶液Ⅱ(含 1% 2, 2′-联吡啶和 1%巯
基乙酸), 测OD519。以植酸磷含量为横坐 标, OD值
为纵坐标绘制标准曲线[8]。
将待测的单粒干种子研成粉末, 取 25~30 mg样
品放在 1.5 mL Eppendorf管中, 加入 0.4 mol L−1 HCl
1 mL, 室温振荡 3.5 h, 15 455×g离心 15 min, 取上
清液转移到新管中, 取 35 µL放入 96孔板按上述过
程测定测OD519, 根据标准曲线计算植酸磷含量。
1.4 齐 319的低植酸性状的遗传学分析
以齐 319 为母本, 分别与 Lpa241/Lpa241(野生
型)、Lpa241/lpa241(杂合体)和 H78 杂交, 在植株开
花前人工授粉, 成熟后按单株收获。
1.5 MIPS蛋白质的Western分析
1.5.1 玉米种子总蛋白的提取 玉米种子研成
粉末, 将大约 300 µL体积的粉末放入 1.5 mL离心管,
加 800 µL蛋白裂解液(含Tris-HCl 62.5 mmol L−1, pH
7.4, 甘油 10%, Trion X-100 10%, PMSF 1 mmol L−1,
EDTA 2 mmol L−1, β-疏基乙醇 5%), 迅速混匀并置
冰上。在冰水混合物中孵育, 每隔 2 min振荡一次,
第 1期 王晖等: 玉米低植酸自交系的筛选与遗传机理的初步研究 97

4~5次后于 4℃ 15 455×g离心 20 min。将上清液转
移到新的 1.5 mL离心管中, −70℃保存。
1.5.2 Western 分析 用 10%SDS-PAGE 分离,
电泳参数设置为 30 mA, 60 min; 剪适当大小的 PVDF
膜浸于甲醇中 5 min, 去离子水稀释甲醇至终浓度
20%, 将膜转移到无 SDS的转移缓冲液(Tris 3 g, 甘
氨酸 14.4 g, 定容至 1 L)中缓摇 15 min, 电泳结束后
将胶转移到无 SDS的缓冲液中摇 10 min; 湿转 100
V, 80 min; TBS缓冲液 (Tris 2.4 g, NaCl 8 g, 加水定
容至 1 L) 洗 5 min, 在含 5%脱脂奶粉的 TTBS (100
mL TBS缓冲母液, 900 mL双蒸水, 1 mL Tween-20)
封闭液中封闭 1 h, 用 TTBS缓冲液洗膜 3次, 每次
5 min; 然后将膜转移到一抗(稀释 1 000 倍)孵育液
中 4℃孵育过夜, 用 TTBS 缓冲液洗膜 3 次, 每次 5
min; 再将膜转移至二抗(稀释 1 000倍)中室温孵育 1
h, 用 TTBS缓冲液洗膜 3次, 每次 5 min; 在膜上滴
加适量 ECL plus (GE healthcare)检测液, 室温孵育 3
min, 暗室压 X-胶片曝光 10 min后洗片检测。蛋白
质的上样量由β-actin抗体标定。

2 结果与分析
2.1 高无机磷玉米自交系筛选
对 20 份玉米自交系的无机磷含量进行了定性
分析(图 1)表明, 所分析的玉米自交系的 8粒种子基
本表现一致的显色反应 , 表明这些材料都是纯合
的。在所测材料中, 齐 319的显色最深(接近 0.93 µg),
其次是 K12(接近 0.46 µg), H78也有轻度的显色(略
高于 0.15 µg), 其他材料几乎不显色(低于 0.15 µg)。
由于齐 319 的无机磷含量最高, 实验以 H78 作为对
照, 对齐 319做了进一步的分析。
2.2 高无机磷玉米自交系的植酸磷含量分析
一般认为, 籽粒中的高无机磷是与低植酸相伴
随的, 所以高无机磷含量可以作为低植酸的间接筛
选指标[4,8-9,11]。为了确认所获得的材料是低植酸的,
分析了齐 319种子的植酸磷含量, 结果如图 2所示。
H78 和意大利材料Lpa241/Lpa241 野生型种子的植
酸磷含量分别为 2.92和 2.80 µg mg−1, 而齐 319与低
植酸突变体lpa241/lpa241 种子的植酸磷含量分别为
1.31 和 1.22 µg mg-1, 显著低于野生型和H78, 由此
可以认定, 齐 319也属于低植酸材料。
2.3 齐 319低植酸性状的遗传分析
为了对齐 319 控制低植酸性状的遗传机制有进
一步了解, 本实验以齐 319为母本, 分别以H78、野
生型Lpa241/Lpa241、杂合体Lpa241/lpa241 为父本
进行杂交配组, 并对其F1代种子进行无机磷含量分
析。 图 3表明, 齐 319自交F1的籽粒无机磷含量仍
然较高, 与图 1 结果相同。Lpa241/lpa241 自交, 呈
现性状分离 , 与预期结果相符。齐 3 1 9×
Lpa241/Lpa241 F1的 8 粒种子均表现低无机磷性状,
未见分离, 表明控制齐 319 低植酸性状的基因是隐
性遗传的。由于Lpa241/lpa241 杂合型花粉将有
Lpa241和lpa241 2种基因型, 如果花粉都表现正常,
应分别占 50%, 图 3中第 4列齐 319×Lpa241/Lpa241
的 8粒F1种子中, 有 4粒表现高无机磷性状, 而第 3
列的结果表明, Lpa241基因型花粉与齐 319杂交, 呈
低无机磷性状, 所以第 4 列中高无机磷种子的出现

图 1 用96孔板筛选高无机磷玉米自交系
Fig. 1 Screening high inorganic phosphorus content maize inbred lines via 96-well format
列1、12、13和24为磷标准对照; A1、A13、H12和H24为空白对照; B1、B13、G12和G24浓度为0.15 µg; C1、C13、F12和F24浓度为
0.46 µg; D1、D13、E12和E24浓度为0.93 µg; E1、E13、D12和D24浓度为1.39 µg。列2~11依次为京02、郑58、齐319、K12、陕811、
获唐黄、H78、K24、L1154和P53; 列14~23依次为P138、87-1、沈137、472、543、2208、7922、9046、22741和79028。
Columns1, 12, 13, and 24 are controls. A1, A13, H12, and H24 are empty controls; B1, B13, G12, and G24 are 0.15 µg phosphorous samples; C1,
C13, F12, and F24 are 0.46 µg phosphorous samples; D1, D13, E12, and E24 are 0.93 µg phosphorous samples; E1, E13, D12, and D24 are 1.39 µg
samples. Columns 2–11 are Jing 02, Zheng 58, Qi 319, K12, Shaan 811, Huotanghuang, H78, K24, L1154, and P53, respectively;
Columns 14–23 are P138, 87-1, Shen 137, 472, 543, 2208, 7922, 9046, 22741, and 79028, respectively.

98 作 物 学 报 第 34卷



图 2 齐319及对照玉米自交系的植酸磷含量分析
Fig. 2 Phosphorus content of phytic acid in
Qi 319 and control materials
lpa241/lpa241: 意大利Nielsen实验室的纯合型玉米低植酸突
变体; Lpa241/Lpa241: 意大利Nielsen实验室的玉米低植酸突变
体的野生型材料。试验重复3次, 并计算平均值和方差。
lpa241/lpa241: the lpa mutant of maize from Nielsen’s
lab; Lpa241/Lpa241: the maize widetype without lpa from
Nielsen’s lab. The experiment was repeated three times,
and the average and standard derivation were calculated.



图 3 以齐319为母本配组的F1材料的无机磷分析
Fig. 3 Inorganic phosphorous analysis
for F1 of crosses with Qi 319
1: 齐319自交; 2: Lpa241/lpa241自交; 3: 齐319×Lpa241/Lpa241;
4: 齐319×Lpa241/lpa241 F1; 5: H78自交; 6: 齐319×H78。
1: Qi 319 self crossing; 2: Lpa241/lpa241 self crossing;
3: Qi 319×Lpa241/Lpa241 F1; 4: Qi 319×Lpa241/lpa241
F1; 5:H78 self crossing; 6: Qi 319×H78.

应该是lpa241 花粉与齐 319 杂交的结果, 高无机磷
性状的种子的出现表明齐 319 的低植酸控制基因可
能与 lpa241 是等位的 , 分离比例为 1︰1, 表明
Lpa241和lpa241的花粉活力相当。H78自交F1种子
的无机磷含量也与图 1 的结果相同, 接近正常。齐
319×H78 的F18 粒种子的表型一致, 其无机磷含量
与亲本H78相当, 明显低于齐 319, 同样表明控制齐
319低植酸性状的基因是隐性遗传的。
2.4 齐 319玉米自交系 MIPS蛋白质的检测
用抗拟南芥的 MIPS 抗体能够特异识别玉米的
MIPS 蛋白质(拟南芥与玉米 MIPS 的氨基酸序列相
似性为 88%, 数据未附), 所检测的阳性条带蛋白质
分子量约为 56 kD (图 4), 与理论值相符, 并且是单
一条带。同样以 H78 的 MIPS 蛋白质含量为参照, 可
以看出齐 319 种子中 MIPS 蛋白质含量最多, 而纯合
的 lpa241/lpa241 突变体的 MIPS 含量极低, Niel-
sen曾证明lpa241/lpa241的中MIPS RNA表达量较低
[11], 本试验结果也进一步证明 lpa241/lpa241 的中
MIPS蛋白质含量很低。第 3泳道是lpa241/lpa241突
变体的野生型, 其MIPS量与H78 接近。第 4 泳道是
齐 319 和Lpa241/Lpa241 野生型杂交的材料 , 其
MIPS表达量与H78 也接近。值得注意的是, 第 5 泳
道是齐 319 与lpa241/lpa241 杂交的材料, 为低植酸
表型, 但其MIPS表达量却接近H78, 对造成这一现
象的原因, 推测可能与该材料中的 2 个MIPS基因拷
贝分别来自齐 319(MIPS含量高 )和 lpa241/lpa241
(MIPS含量低)的互补效应有关。

图 4 用Western检测种子中MIPS蛋白质含量
Fig. 4 MIPS protein detection by Western analysis
1: Qi 319; 2: lpa241/lpa241; 3: Lpa241/Lpa241; 4: Qi 319×
Lpa241/Lpa241 F1; 5: Qi 319×lpa241/lpa241 F1; 6: H78.
3 讨论
本文通过对常用玉米自交系的筛选, 获得了高
无机磷、低植酸的材料齐 319, 控制齐 319低植酸性
状的基因呈隐性遗传, 并且与报道的 lpa241/lpa241
突变体很可能是等位的。但是与 lpa241/lpa241的低
MIPS 蛋白质表达明显不同, 齐 319 种子中的 MIPS
含量高于一般对照材料 , 说明 lpa241/lpa241 与齐
319可能具有不同的低植酸控制机制。
肌醇-3-磷酸合酶(MIPS EC 5.5.1.4)是以NADH
为辅酶催化光合作用产物葡萄糖-6-磷酸向肌醇-3-
磷酸的转化, 是光合植物体内植酸从头合成的第一
步。目前, 已经从多种植物、动物和微生物中分离
和克隆出MIPS基因, 如酵母[14]、土豆[15]、水稻[16]、
大豆 [17]、拟南芥 [18]及紫萍 [19]。在这些生物中MIPS
基因序列高度保守。不同作物MIPS基因的拷贝数不
同, 大麦和水稻[16] 为单拷贝, 玉米为分散的多拷贝
[20], 大豆也至少有 4 个拷贝[17]。在绿豆中发现了两种
MIPS蛋白, 从胚形成过程中的球形颗粒中分离出的
MIPS蛋白能与酵母MIPS单克隆抗体杂交; 从根和叶
片中还分离出一类 56 kD的MIPS蛋白[21]。
由Raboy等[20] 和Pilu等[11-12] 各自培育的两份玉
第 1期 王晖等: 玉米低植酸自交系的筛选与遗传机理的初步研究 99

米lpal型突变, 都定位于 1S染色体, 且都与MIPS的
几个同源区域接近。水稻lpal突变定位于 2L, 然而单
拷贝的MIPS则定位于第 3 染色体, 说明水稻lpal突
变不是由MIPS基因突变引起[16]。大麦lpal突变定位
于 2H, 比较基因组发现这个位点与玉米和MIPS有
联系的lpal突变位点不同源。由此推测, lpal型突变可
能是那些具有MIPS基因功能 , 但与MIPS基因没有
同源性的基因发生突变造成的 ; 也有可能是由于
MIPS基因的转录或翻译调节因子的突变造成的[22]。
而 lpal大豆低植酸突变已明确是由于 MIPS基因的
点突变造成的[23]。
在报道的玉米低植酸突变体中, lpa1 是由于编
码MIPS的基因突变影响了MIPS的表达和酶活 , 导
致植酸含量降低 [10]。对lpa241/lpa241 的研究表明,
吐丝后 26~30 d的籽粒MIPS的RNA表达量明显低于
野生型, 对其MIPS编码基因的序列分析表明有 10
个碱基发生了变化, 但不影响基因功能, 推测该突变
是由MIPS调控区的变化造成的 [12]。遗传试验表明 ,
lpa1和lpa241/lpa241是等位的。报道的玉米低植酸突
变体, 多数表现为籽粒小、出芽率低、成活率低等[4]。
本研究所鉴别的齐 319 为广泛应用的玉米自交系, 用
其作亲本选育并推广的品种有鲁 单 50、鲁单 981、泰
玉 2号等。低植酸特性的鉴别使其变得更有应用价值,
通过常规育种手段还可将齐 319 低植酸性状转移到其
他玉米自交系中, 用于低植酸玉米育种。
4 结论
玉米自交系齐 319 种子具有高无机磷、低植酸
特性; 其控制基因呈隐性遗传并可能与玉米低植酸
突变体 lpa241等位。在齐 319中, MIPS蛋白质的表
达显著增加, 而 lpa241中的MIPS的表达量下降, 暗
示二者可能具有不同的调控机理; 齐 319 低植酸性
状的鉴别, 拓展了其应用价值, 为玉米低植酸育种
提供了一份新的材料。
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