全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(11): 1946−1952　 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家高技术研究发展计划(863计划)(2006AA100106); 湖北省重大科技攻关项目(2006AA206A01); 国家科技支撑计划项目(2006BA-
D07A04)
作者简介: 程计华(1980−), 男, 湖北天门人, 硕士, 研究方向: 作物遗传育种。
*
通讯作者(Corresponding author): 胡琼(1966−), 女, 安徽霍邱人, 博士生导师, 研究员, 从事油菜分子生物学和遗传育种研究。
Tel: 027-86711556; E-mail: huqingy@public.wh.hb.cn
Received(收稿日期): 2007-09-03; Accepted(接受日期): 2008-05-14.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01946
油菜野芥 NSa细胞质雄性不育系的特异性分子鉴定
程计华 1,2 李云昌 1 胡 琼 1,* 梅德圣 1 李英德 1 徐育松 1 王巍敏 1
(1 中国农业科学院油料作物研究所国家油料作物改良中心, 农业部油料作物遗传改良重点实验室, 湖北武汉 430062; 2 华中农业大学
植物科技学院, 湖北武汉 430070)
摘 要: 常规细胞质类型鉴定方法花费时间长、工作量大、鉴定效率低、应用性较差。基于基因组重复序列的 PCR
技术(rep-PCR)在重复序列丰富的线粒体和原核生物的基因组鉴定中效果较好, 本研究对 8 份油菜资源的细胞质进行
分子鉴定, 结果表明 rep-PCR 可以明确区分甘蓝型油菜中常见的 6 种雄性不育细胞质。同时对甘蓝型油菜和野芥
(Sinapis arvensis)体细胞杂交创建的、育性较为稳定的 NSa 野芥雄性不育胞质进行了分子特异性鉴定, 获得了 2 条
NSa不育胞质的特征 DNA条带。但波里马和萝卜质不育细胞质的特异性引物在 NSa中不能扩增出特异性片段, 说明
NSa不属于这 2种细胞质类型。本研究结果为该不育胞质系统的利用和知识产权保护提供了理论依据和技术支撑。
关键词: 油菜; 异源细胞质雄性不育; 分子特异性; 重复序列 PCR
Molecular Identification and Distinctness of NSa Male Sterile Cytoplasm
in Brassica napus
CHENG Ji-Hua1,2, LI Yun-Chang1, HU Qiong1,*, MEI De-Sheng 1, LI Ying-De1, XU Yu-Song1, and
WANG Wei-Min1
(1 National Center for Oil Crops Improvement, Key Laboratory of Agricultural Ministry for Oil Crops Improvement, Oil Crops Research Institute,
Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, Hubei; 2 College of Plant Science, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070,
Hubei, China)
Abstract: Cytoplasmic male sterility (CMS) has been widely used as an efficient pollination control system in rapeseed (Brassica
napus) hybrid production. With the exploitation of wild species of Crucifer and the application of biotechnology, several cyto-
plasmic male sterile systems of oilseed rape have been reported in recent years. Traditional methods used for the identification of
cytoplasm, however, are time and labor consuming with low efficiency. Thus, it is highly desirable to develop an efficient and
accurate identification method for cytoplasm classification. Repetitive sequence based polymerase chain reaction (rep-PCR) has
proved to be a good method for the identification of mitochondrial and procaryotic organisms which contain abundant repetitive
sequences in genome. Fingerprints of six cytoplasmic male sterility materials including Nsa, Pol, nap, No, Ogu, and Ath were
mapped using rep-PCR. Based on the PCR amplification band patterns by two primer pairs, six male sterile cytoplasms in rape-
seed could be distinguished unambiguously. Two bands, ERIC750 and ERIC4000, were unique to NSa CMS which was derived
from somatic hybrids between B. napus and S. arvensis. The PCR results using gene specific primers also showed that NSa is a
novel cytoplasmic male sterility system in oilseed rape. Thus, a method for cytoplasm classification in oilseed rape was estab-
lished. The two specific markers for NSa cytoplasm not only confirmed the distinctness of NSa cytoplasm from other male sterile
cytoplasm at molecular level, but also provided useful tools for the protection of intellectual property right of this potential CMS
material in rapeseed breeding and production.
第 11期 程计华等: 油菜野芥 NSa细胞质雄性不育系的特异性分子鉴定 1947


Keywords: Oilseed rape; Alloplasmic male sterility; Molecular characterization; rep-PCR
细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, 简
称 CMS)系统是油菜杂种优势利用的主要授粉控制
系统[1], 目前我国育成的杂交油菜品种中, 60%以上
是细胞质雄性不育杂种。油菜中比较常见的细胞质
雄性不育的类型主要有波里马不育胞质 (Pol
CMS)[1]、萝卜不育胞质(Ogu CMS)和 nap CMS[2]等。
发掘和创建新型雄性不育细胞质、避免杂交油菜品
种细胞质的单一化一直是油菜品种改良的重要课
题。近年来随着远缘杂交技术的成熟, 越来越多的
细胞质雄性不育系统被建立起来, 包括国外的含洋
基芥(B. tourniforti)[3]、拟南芥(Arabidopsis thaliana)[4]、
Trachystoma ballii[5] 和 Moricandia arvensis[6]细胞质
的甘蓝型和芥菜型油菜细胞质雄性不育系统。我国
也发现了多种新的油菜细胞质雄性不育系, 如 MI
CMS[7]、681A[8]、NEA[9]、6-102A[10]及陕 2A、NCa、
NSa[11]等。
目前广泛采用的鉴定雄性不育细胞质的方法是
鉴定恢保关系。该方法需要利用测验种配制大量的
杂交组合, 在下一个年度观察杂种一代的育性, 较
准确, 但费时耗力, 鉴定效率低[12]。已有的研究发现,
细胞质雄性不育基因位于线粒体基因组上, 如油菜
Pol CMS中与不育相关基因是 orf224, 与 atp6基因
共转录引起不育[13], 而 orf138则是Ogu CMS中的不
育相关基因[14], 因而可以在 DNA 水平上准确鉴定
不育胞质的差别。Levings等[15]、杨光圣等[12]分别证
明了利用 DNA 限制性片段的多态性(RFLP)可以鉴
定玉米和油菜不育胞质类型, 但由于 RFLP 操作繁
琐, 成本也高, 实际应用价值较小。如果能建立不育
细胞质归类的常规 DNA 多态性扩增(PCR)技术, 不
仅操作起来简便易行, 可靠性也很高。以不育基因
序列或基于重复序列设计引物进行 PCR扩增是鉴定
细胞质的有效方法, 在洋葱[16]、玉米[17-18]和芥菜型
油菜[19]中都获得了成功。基于重复序列的 PCR扩增
(repetitive sequence based polymerase chain reaction,
rep-PCR)技术最初应用于细菌等低等生物的分子指
纹图谱的构建, 该技术无需设计大量的引物, 少数
几对通用引物就能分析大量样品, 克服了 RFLP 价
格昂贵, 操作繁琐的缺点, 因此具有高通量、经济及
适应性广等优点[20]。应用该技术对芥菜型油菜细胞
质进行分类是其在植物上的一个创新性应用, 但在
甘蓝型油菜中还未见报道。
NSa CMS是由新疆野芥与甘蓝型油菜体细胞杂
交而获得的含野芥细胞质的油菜异源细胞质雄性不
育系, 其恢保关系与 Pol、Ogu CMS均不相同, 不育
性较 Pol CMS更稳定[10]。通过广泛筛选鉴定, 已实
现三系配套。本文利用油菜线粒体基因特异性引物
及基于重复序列的 PCR 引物对 Pol、NSa、Ogu 和
nap等 8份甘蓝型油菜的细胞质进行鉴定, 以建立有
效的油菜雄性不育胞质的分子鉴定方法。
1 材料与方法
1.1 材料
7份油菜细胞质雄性不育材料 Pol、NSa、No、
Ogu、Ath、NCa 和 nap, Pol、nap 和 Ogu 为油菜中
常见的不育胞质 [1], 均取自于中国农业科学院油料
作物研究所油菜种质资源中期库; NCa 为甘蓝型油
菜与埃塞俄比亚芥有性杂交通过核置换产生的雄性
不育[22], 由中国农业科学院油料作物研究所油菜生
物技术育种课题组提供; Ath为拟南芥与甘蓝型油菜
体细胞杂交产生的拟南芥细胞质雄性不育 [4], 从瑞
典农业大学引进; NSa为新疆野芥野油 18与甘蓝型油
菜中双4号体细胞杂交产生的野芥细胞质雄性不育[10],
No为诸葛菜与甘蓝型油菜中油 821体细胞杂交产生
的诸葛菜细胞质雄性不育[21]; 常规甘蓝型油菜中油
821作为对照。NSa、No和中油 821均由本所油菜杂
种优势利用课题组提供。
主要生化试剂 Taq 酶、dNTPs 购自鼎国生物公
司, 引物由 Invitrogen公司合成, 其他试剂都为进口
或国产分析纯。
1.2 线粒体 DNA及总 DNA的提取
将种子置 MS培养基上, 室温下暗培养 8∼10 d,
至长出 5∼8 cm 左右的黄化苗 , 用以提取线粒体
DNA。参照 Scotti 等的提取步骤[23], 并稍作改进。
主要改进为在粗制线粒体沉淀后, 用 DNase I (用量
为每克组织 2.5 μg酶) 4℃下处理 2 h以去除吸附在
线粒体膜上的核 DNA, 然后离心收集纯线粒体。参
照李佳等[24]的方法提取总 DNA。
1.3 PCR引物设计及扩增条件
利用 Primer Premer 5.0 软件, 根据已经发表的
甘蓝型油菜线粒体基因组序列[25]中的 18 个线粒体
基因序列(这些基因包括 atp1、atp6、atp8、atp9、atpA、
orf1、coxI、coxII、nad1、nad2、nad3、nad4、rrn26S、
1948 作 物 学 报 第 34卷

rrn5S、cob、matR、orf224 和 orf138), 每个基因设
计 1∼2 对特异引物, 选取扩增产物大小合适且软件
评分较高的引物共 21对。其中 Pol和 Ogu特异引物
序列为 ORF224F, 5′-AGC TGT CTG GAG GGA
ATC-3′; ORF224R, 5′-ACG ACA TCA AGG AGG
AAC-3′; ORF138F, 5′-GAA ACG GGA AGT GAC
AAT AC-3′; ORF138R, 5′-GCA TTA TTT TCT CGG
TCC AT-3′, 预期产物大小分别为 690和 530 bp。PCR
体系含 2 μL 10×buffer, 2.5 mmol L−1 Mg2+, 0.4 μmol
L−1 dNTPs, 上下游引物各 0.5 μmol L−1, 1 U Taq
DNA 聚合酶, 10 ng mtDNA。PCR程序为: 94℃预变
性 3 min; 92℃ 20 s, 50℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共 30个
循环, 随后 72℃延伸 15 min。
rep-PCR 最常用的 3 对引物序列为 BOX A1R,
5′-CAT CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3′; ERIC
1R, 5′-TGT AAG CTC CTG GGG ATT CAC-3′;
ERIC2, 5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′;
REP1R, 5′-III ICG ICG ICA TCI GGC-3′; REP2I,
5′-ICG ICT TATCIG GCC TAC-3′[23]。PCR体系含 2
μL 10×buffer, 2.5 mmol L−1 Mg2+, 0.4 μmol L−1
dNTPs, 上下游引物各 0.5 μmol L−1, 2.5 U Taq DNA
聚合酶, 10 ng mtDNA。PCR程序为: 94℃预变性 3
min, 92℃ 20 s, 52℃ 1 min (REP引物 38℃), 68℃ 3
min, 共 37个循环, 随后 68℃延伸 15 min。PCR产
物在 1.5%琼脂糖胶上分离检测。
1.4 数据采集及聚类分析
分别统计 3 对 rep-PCR 引物各样本的扩增条带
(有带赋值为 1, 无带赋值为 0), 再将 3对引物的条带
混合统计。采用 NTSYS-pc V2.1 软件, 按非加权类
平均法(unweighted pair group method arithmetic ave-
rages, UPGMA)进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 特异引物的 PCR结果
大多数线粒体基因特异引物的扩增产物仅为 1
条带, 少数引物没有扩增产物或出现 2 条带, 其中
Ogu 和 Pol 特异性引物只分别在 Ogu 和 Pol 细胞质
不育材料中有扩增带, 且与预期大小一致, 分别约
为 500 bp和 700 bp, 其他细胞质材料中均无扩增产
物(图 1-a, b)。有一对引物在各材料都没有扩增产物,
其他 18 对引物在 5 个材料中的扩增带型没有差异
(图 2)。
2.2 rep-PCR分析
利用 rep-PCR 引物对 8 份材料进行 PCR 扩增,

图 1 特异引物扩增
Fig. 1 PCR products from Pol (a) and Ogu (b) specific primers
泳道 1~5分别为 nap、Ogu、NSa、No和 Pol, M为 λDNA EcoR I/
Hind III酶切分子量标记。a为 Ogu特异引物 orf138; b为 Pol特
异引物 orf224。
Lanes 1–5: nap, Ogu, NSa, No, and Pol. Lane M: λDNA EcoR I/
Hind III marker. a: specific primer (orf138) for Ogu; b: specific
primer (orf224) for Pol.

图 2 其中 1对扩增无差异特异引物在各材料中的扩增结果
Fig. 2 PCR products with one of specific primers
泳道 1~5分别为 nap CMS、Ogu CMS、No CMS、NSa CMS和
Pol CMS。M为 DL2000 marker。
Lanes 1–5: nap, Ogu, No, NSa, and Pol CMS; Lane M: DL2000
marker.

除了上面的 5 种以外, 还增加了 NCa 异核型不育系
(NCa CMS)、拟南芥细胞质雄性不育(Ath CMS)以及
中油 821。扩增结果显示, BOX引物在中油 821、NCa
和 nap 中只能扩增出相同的两条主带, 大小分别约
为 1 300 bp和 900 bp, 且这两条带为 8种材料所共
有。在 NO中除了扩增出约 1 300 bp和 900 bp两条
带以外, 在 1 100 bp和 800 bp处也各有一条带。NSa、
Ogu和 Ath扩增带型几乎一致。除了约 1 300 bp和
900 bp 两条带外, 这 3 种胞质还共有的一条约 700
bp 的特异带。Pol 中有一条约 300 bp 的特异带(图
3-a)。REP引物在 NSa和 Ogu中扩增出相同带型, 都
有 4 000 bp和 1 000 bp两条带; 中油 821与 NCa带
型也相同, 3条主带分别约 4 000、1 400和 1 000 bp
左右; Ath和 nap中都有一条约 4 200 bp的特异带;
Pol和 No中均没有扩增到产物(图 3-b)。
第 11期 程计华等: 油菜野芥 NSa细胞质雄性不育系的特异性分子鉴定 1949



图 3 3对 rep-PCR引物的线粒体 DNA及总 DNA扩增结果
Fig. 3 PCR product from rep-PCR primers in mtDNA or total DNA
a、b引物分别为 BOX、REP; c、d引物为 ERIC; a、b、c的模板为线粒体 DNA; d的模板为总 DNA。
The primers in a and b: BOX and REP respectively; the primer pair in c and d: ERIC. The templates in a, b, and c: mtDNA; the templates in d:
total DNA. Lanes 1–8 in a, b, and d: Zhongyou 821, NCa CMS, nap CMS, Ath CMS, Ogu CMS, No CMS, NSa CMS, and Pol CMS; Lanes
1–8 in c: Ath CMS, Zhongyou 821, NCa CMS, nap CMS, Ogu CMS, No CMS, NSa CMS, and Pol CMS; Lanes 1–6 in d: NCa CMS, Ath CMS,
Ogu CMS, No CMS, NSa CMS, and Pol CMS; M: λDNA EcoR I/Hind III marker.

ERIC引物扩增的结果也与以上的结果类似, nap、
NCa 和中油 821 扩增结果完全相同, 为大小不等的
4条主带; Ogu和 Ath 中都扩增到 8条带, 带型也一致;
Pol、NSa和 No的扩增带型各不相同, 且与其他几种细
胞质的带型均不相同, 两条大小分别约 4 000 bp和 750
bp 的扩增带为 NSa 所特有(图 3-c)。综上所述, 3 对
rep-PCR 引物的扩增结果除了不能区分中油 821、NCa
和 nap3份材料外, BOX引物能鉴别出 Pol, 但不能区分
NSa、Ogu和Ath; REP引物能分辨出 Ogu和 Ath; ERIC
引物能显示 Pol、NSa、No和 Ogu之间的差异。
2.3 指纹图谱及聚类分析
利用不育材料间 rep-PCR 扩增差异带型可以绘
制出 6 种不育胞质的线粒体基因组的特征指纹图谱
(表 1), 此图谱中可用 7个标记将这 6种不育胞质分
开。这 7个标记分别是 Rep1500、Rep1000、ERIC300、
ERIC750、ERIC1500、ERIC4000和 ERIC600, 其中
ERIC750和 ERIC4000为 NSa的特征带。ERIC引物
在 6种材料总 DNA中扩增无任何差异(图 3-d)。

表 1 油菜 6种不育胞质的特征指纹图谱
Table 1 Fingerprinting of six types of cytoplasm in rapeseed
Rep1500 Rep1000 ERIC300 ERIC600 ERIC750 ERIC1500 ERIC4000
Pol CMS – – – + – – –
NSa CMS – + + + + + +
No CMS – – + – – – –
Ogu CMS – + – + – + –
Ath CMS + + – + – + –
nap CMS + + + + – – –
+: 有带; -: 无带。＋: band; －: no band.

1950 作 物 学 报 第 34卷

对带型进行统计后, 用 NTSYS-pc 软件进行 8
个材料遗传关系分析, 得到了聚类分析图(图 4)。可
在遗传距离 0.6处将 8个材料划分为 4个类群, 其中
Pol和 No划为一群, Ogu和 Ath划为一群, nap、中
油 821 和 NCa 聚为一类, NSa 单独聚为一类。说明
NSa 与其他材料遗传关系较远 , 这与其来源有关 ,
因为上述材料中只有 NSa具有野芥的部分胞质[10]。
NCa 与中油 821 和 nap 聚为一类也完全符合它们之
间的亲缘关系[22,28]。

图 4 全部 8份材料的聚类图
Fig. 4 Dendrogram of all materials

3 讨论
截至目前, 从已经鉴定出的植物细胞质雄性不
育基因的结构和序列可以看出, 细胞质雄性不育基
因的发生存在较大的独立性。除了都编码蛋白质的
疏水性区域外, 它们的序列之间缺乏相关性, 没有
同源性或同源性很低, 不育基因为各个不育胞质所
特有, 如油菜 Pol胞质的 orf224/atp6位点、nap胞质
的 orf222/nad5c/orf139 区域、Ogu 胞质的 orf138/
orf158 位点[26]。因而利用与某一胞质不育基因的序
列设计引物进行 PCR扩增常常能获得该不育胞质特
异性分子标记[18]。本研究利用 Pol和 Ogu CMS的不
育基因序列, 成功得到了 Pol 和 Ogu 不育胞质的特
异性分子标记, 即利用基于 orf224 和 orf138 序列的
引物仅分别在 Pol和 Ogu CMS材料中获得特异性扩
增条带。利用这两个特异性分子标记可以快速鉴定
出一个新发现或鉴定的不育材料的细胞质是不是油
菜中最为常见的 Pol 或 Ogu 胞质。本实验中 Pol 和
Ogu胞质的特异性引物在NSa CMS中不能扩增出片
段, 说明除了 nap、No、Ath和 NCa外, 通过体细胞
杂交新近创建的 NSa CMS的细胞质也与 Pol和 Ogu
胞质有着本质的区别。
对于多个不育胞质的鉴定, 利用某一不育基因
的特异性引物显然不能达到目的。大多数的研究表
明细胞质雄性不育与线粒体功能基因有关[30-31], 有
些甚至还是某些功能基因结构和序列变化所引起 ,
如矮牵牛不育基因含有 atp9的 5′端、coxII的第一和
第二个外显子部分区域及一个未知序列 urfS[27]。但
本研究利用可能与雄性不育相关的线粒体基因的特
异性引物扩增基因片段, 从扩增片段的大小上没有
发现 atp1、atp6、atp8、atp9、atpA、orf1、coxI、coxII、
nad1、nad2、nad3、nad4、rrn26S、cob 和 matR 等
15 个线粒体基因在所鉴定不育胞质材料中的差异,
说明在油菜中不同不育胞质间线粒体功能基因的保
守性较强。虽然这些基因的转录或表达与雄性不育
性状有关[30-33], 但其序列和结构本身跟不育性状并
没有必然的联系, 因而试图利用 PCR 方法通过线粒
体基因组上的已知基因序列来寻找与雄性不育基因
连锁的分子标记, 从而鉴定不同的雄性不育细胞质,
盲目性较大。同样, 在鉴定细胞质雄性不育基因时,
也需要避免利用这一途径, 如果不能通过基因差异
表达来寻找不育胞质基因, 在线粒体全基因组上进
行扫描应该是更为有效的方法。
rep-PCR所用的 BOX、ERIC和 REP 3对引物可
以扩增细菌基因组上相对保守的重复片段之间的序
列, 这 3 对引物已经广泛应用于人类和植物病原菌
的分子鉴定与分类。内共生假说认为, 植物线粒体
基因组来源于古细菌, 线粒体基因组保留有原核生
物基因组的一些特点, 而各种雄性不育系细胞质间
的差异主要存在于线粒体基因组上。利用该方法对
芥菜型油菜的细胞质进行分类, 克服了 RFLP 操作
繁琐, 价格昂贵的缺点[20]。本研究利用 BOX和 ERIC
这两对引物的扩增带型绘制出的油菜 6 种雄性不育
胞质的特征分子图谱, 可以很好地用于油菜新型不
育胞质的鉴别。至于这 3 对引物均不能区分中油
821、nap和 NCa的细胞质, 可能与这 3个材料的遗
传关系较近有关。聚类分析的结果也表明这 3 个材
料的遗传关系较近。从系谱上看, 中油 821 衍生于
日本的胜利油菜, 具有 nap 胞质[28], NCa 是以中油
821 为母本与埃塞俄比亚芥有性杂交后, 利用中油
821 做父本多次回交不断进行核置换获得的[21]。这
第 11期 程计华等: 油菜野芥 NSa细胞质雄性不育系的特异性分子鉴定 1951


些杂交和回交的过程理论上不会引起线粒体基因组
的显著变化, 因而 NCa 的线粒体基因组的遗传背景
应该以中油 821的遗传基础为主。虽然 RFLP 和基因
差异表达研究都检测出了NCa与 nap胞质的不同[29-30],
但两者在基因组上的根本性差异还有待进一步研
究。
作为利用现代生物技术创建的新型异源细胞质
雄性不育材料, NSa CMS的育性稳定性明显优于同
源细胞质雄性不育系统, 在我国油菜杂种优势利用
中应用前景广阔。尽管可以推论其不育胞质来源于
新疆野芥, 与现有的同源和异源不育胞质有所不同,
但其新颖性还缺乏足够的分子证据。本研究利用
ERIC引物在 NSa中扩增出 1条约 750 bp和 1条约
4 000 bp的特征带, 聚类分析也将 NSa单独聚为一
类, 进一步证明NSa不育胞质不仅不同于 Pol和Ogu
胞质, 与 nap、No、Ath 和 NCa 等不育材料的胞质
也不相同, 是一个全新的甘蓝型油菜异源雄性不育
细胞质。至于这个通过原生质体对称性融合获得的
野芥不育胞质[31]与国外新近获得的芥菜型不育胞质
[4-6]是否具有相似性, 还有待进一步研究。
4 结论
利用油菜 Pol和 Ogu CMS不育基因序列设计特
异性引物可以获得 Pol 和 Ogu 不育胞质的特异性分
子标记, 从而能够鉴定出某一种不育材料是否属于
常见的 Pol 或 Ogu 不育胞质类型。基于重复序列的
PCR, 可以在分子水平上将现有甘蓝型油菜 6 种不
育胞质分开, 是一种有效的不育胞质鉴定方法。体
细胞杂交创建的油菜野芥雄性不育细胞质, 与其他
不育胞质在分子水平上具有明显差异。通过 rep-PCR
扩增出的两条 NSa的特征分子标记, 是鉴别 NSa不
育胞质的有力证据。

致谢: 长江大学农学院 2003级蒋红同学参加部分实
验, 本研究还得到了课题组李晓琴老师和余友桥老
师的大力支持, 中国农业科学院油料作物研究所油
菜种质资源研究室伍晓明研究员和生物技术育种课
题组刘贵华研究员惠予研究材料, 特此一并致谢！
References
[1] Fu T-D(傅廷栋), Yang G-S(杨光圣). Cytoplasmic male ste-
rility in rapeseed. In: Fu T-D(傅廷栋 ) ed. Breeding and
Utilization of Rapeseed Hybrid (杂交油菜的育种与利用).
Wuhan: Hubei Science and Technology Press, 2000. pp 52−84
(in Chinese)
[2] Hu Q(胡琼), Li Y-C(李云昌). Induction and improvement of
cytoplasmic male sterility in oilseed Brassica by somatic hy-
bridization. Acta Agron Sin (作物学报 ), 2006, 32(1):
138−143 (in Chinese with English abstract)
[3] Liu J H, Landgren M, Glimelius K. Transfer of the Brassica
tournefortii cytoplasm to B. napus for the production of cyto-
plasmic male sterile B. napus. Physiol Planta, 1996, 96:
123−129
[4] Leino M, Teixeira R, Landgren M, Glimelius K. Brassica
napus lines with rearranged Arabidopsis mitochondria display
CMS and a range of developmental aberrations. Theor Appl
Genet, 2003, 106: 1156−1163
[5] Kirti P B, Mohapatra T, Baldev A, Prakash S, Chopra V L. A
stable cytoplasmic male-sterile line of Brassica juncea carry-
ing restructured organelle genomes from the somatic hybrid
Trachystoma ballii + B. juncea. Plant Breed, 1995, 114:
434−438
[6] Prakash S, Kirti P B, Bhat S R, Gaikwad K, Kumar V D,
Chopra V L. A Moricandia arvensis-based cytoplasmic male
sterility and fertility restoration system in Brassica juncea.
Theor Appl Genet, 1998, 97: 488−492
[7] Fu S-Z(傅寿仲), Qi C-K(戚存扣), Tang J-H(唐继红). Breed-
ing of MI cytoplasmic male sterility in Brassica napus. Acta
Agron Sin (作物学报), 1989, 17(2): 151−156(in Chinese with
English abstract)
[8] Wang G-H(王国槐), Chen S-Y(陈社员), Guan C-Y(官春云).
Breeding and study on cytoplasmic male sterility “681A” in
Brassica napus. Crop Sci (作物研究), 2000, 14(4): 31−32(in
Chinese)
[9] Jiang L-C(蒋梁材), Pu X-B(蒲晓斌), Zhang Q-H(张启行),
Chen F(陈放). Discovery and its genetic study on the cyto-
plasmic male sterile line “NEA” in Brassica napus L. Sci
Agric Sin (中国农业科学), 2002, 35(1): 72−78(in Chinese
with English abstract)
[10] Wan Z-J(万正杰), Wang X-J(王显军), Fu T-D(傅廷栋), Tu
J-X(涂金星). Cytology study on the cytoplasmic male sterile
line 6-102A in Brassica juncea. Chin J Oil Crop Sci (中国油
料作物学报), 2006, 28(3): 268−271(in Chinese with English
abstract)
[11] Hu Q(胡琼), Li Y-C(李云昌), Mei D-S(梅德圣), Fang X-P(方
小平), Hansen L N, Andersen S B. Establishment and identi-
fication of cytoplasmic male sterility in Brassica napus by
intergeneric somatic hybridization. Sci Agric Sin (中国农业科
学), 2004, 37(3): 333−338(in Chinese with English abstract)
[12] Yang G-S(杨光圣), Fu T-D(傅廷栋), Brown G G. Genetic
classification of cytoplasmic male sterility in Brassica napus
L. Sci Agric Sin (中国农业科学), 1998, 31(1): 27−31(in Chi-
nese with English abstract)
[13] L’Homme Y, Stahl R J. Brassica napus cytoplasmic male ste-
rility is associated with expression of a mtDNA region
containing a chimeric gene similar to the pol CMS-associated
1952 作 物 学 报 第 34卷

orf224 gene. Curr Genet, 1997, 31: 325−335
[14] Bellaoui M, Pelletier G, Budar F. The steady-state level of
mRNA from the Ogura cytoplasmic male sterility locus in
Brassica cybrids is determined post-transcriptionally by its 3
region. EMBO J, 1997, 6: 5057−5068
[15] Levings C S I, Pring D R. Restriction endonuclease analysis
of mitochondrial DNA from normal and Texas cytoplasmic
male sterile maize. Science, 1976, 193: 158−160
[16] Sato Y. PCR amplification of CMS-specific mitochondrial
nucleotide sequences to identify cytoplasmic genotypes of
onion (Allium cepa L.). Theor Appl Genet, 1998, 96: 367−370
[17] Liu Z, Peter O, Long M, Weingartner U, Stamp P, Kaeser O. A
PCR assay for rapid discrimination of sterile cytoplasm types
in maize. Crop Sci, 2002, 42: 566−569
[18] Zhang Z-X(张祖新), Fang M-J(方明镜), Du H-W(杜何为),
Deng L-R(邓莉蓉), Zheng Y-L(郑用琏). The rapid discrimi-
nation based on PCR on cytoplasmic types of male sterile line
of maize (Zea may L.). Acta Agron Sin (作物学报), 2005, 31:
1386−1388(in Chinese with English abstract)
[19] Ashutosh, Dwivedi K K, Kumar V D, Prakash S, Bhat S R.
Rep-PCR helps to distinguish different alloplasmic cytoplas-
mic male sterile lines of Brassica juncea. Plant Sci, 2005, 168:
1083−1087
[20] Lupski J R, Weinstock G M. Short, interspersed repetitive
DNA sequences in prokaryotic genomes. J Bacteriol, 1992,
174: 4525−4529
[21] Mei D-S(梅德圣), Li Y-C(李云昌), Hu Q(胡琼). Investigation of
male sterile lines derived from intergenic somatic hybrids of
Brassica napus (+) Orychophragmus and Brassica napus (+)
Sinapis arvensis. Chin J Oil Crop Sci (中国油料作物学报), 2003,
25(1): 72−75(in Chinese with English abstract)
[22] Liu G-H(刘贵华), Cai M(蔡明), Sheng X-Y(盛晓燕). Breed-
ing of NCa male sterility and its maintainer-restorer relation-
ship in Brassica napus. Sci Agric Sin (中国农业科学), 1997,
30(3): 61−65 (in Chinese with English abstract)
[23] Scotti N, Cardi T, Marechaldrouard L. Mitochondrial DNA
and RNA isolation from small amounts of potato tissue. Plant
Mol Biol Rep, 2001, 19: 67a−67h
[24] Li J(李佳), Shen Z-B(沈斌章), Han J-X(韩继祥), Gan L(甘
莉). An efficient protocol for isolating total DNA from leaf in
oilseed rape. J Huazhong Agric Univ (华中农业大学学报),
1994, 13(5): 521−523(in Chinese)
[25] Handa H. The complete nucleotide sequence and RNA editing
content of the mitochondrial genome of rapeseed (Brassica
napus L.): Comparative analysis of the mitochondrial ge-
nomes of rapeseed and Arabidopsis thaliana. Nucl Acids Res,
2003, 31: 5907−5916
[26] Hanson M R, Bentolila S. Interactions of mitochondrial and
nuclear genes that affect male gametophyte development.
Plant Cell, 2004, 16(suppl): 154−169
[27] Hanson M R, Wilson R K, Bentolila S, Kohler R H, Chen H C.
Mitochondrial gene organization and expression in petunia
male fertile and sterile plants. J Hered, 1999, 90: 362−368
[28] He Y-H(贺源辉 ), Yang R-F(杨瑞芳 ), Luo S-Q(罗时清 ).
Breeding of new rapeseed cultivar 821 with multi-resistance
and high yield and the trait structure. Oil Crops in China (中
国油料), 1987, (2): 11−15(in Chinese with English abstract)
[29] Wei W L, Wang H Z, Liu G H. Transcriptional regulation of
10 mitochondrial genes in different tissues of NCa CMS sys-
tem in Brassica napus L. and their relationship with sterility.
J Genet Genom, 2007, 34: 72−80
[30] Wei W-L(危文亮), Wang H-Z(王汉中), Liu G-H(刘贵华).
Molecular identification of the sterile cytoplasm of NCa of a
cytoplasmic male sterile line in rapeseed (Brassica napus L.).
Sci Agric Sin (中国农业科学), 2005, 38(10): 1965−1972(in
Chinese with English abstract)
[31] Hu Q, Andersen S B, Dixelius C, Hansen L N. Production of
fertile intergeneric somatic hybrids between Brassica napus
and Sinapis arvensis for the enrichment of the rapeseed gene
pool. Plant Cell Rep, 2002, 21: 147−152