全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(5): 940−945 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2007AA100701), 农业部引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目(2006-G37), 国家自
然科学基金项目(30170639), 福建省科技厅国家科技项目备案(F2007AA100701), 现代农业产业技术体系建设专项资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 许莉萍, E-mail: xlpmail@yahoo.com.cn
第一作者联系方式: E-mail: queyouxiong@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2008-09-01; Accepted(接受日期): 2008-12-13.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00940
利用斑茅 cDNA芯片研究甘蔗受黑穗病菌侵染后基因差异表达
阙友雄 许莉萍* 林剑伟 徐景升 张积森 张木清 陈如凯
福建农林大学 / 农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室, 福建福州 350002
摘 要: 为了解甘蔗抗黑穗病的分子机制, 利用斑茅干旱胁迫 cDNA 芯片检测了甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异
表达。经杂交, 在 cDNA芯片的 3 860个模板中, 有效差异表达(Ratio值≥2.0或≤0.5)的基因为 101个, 其中上调 55
个, 下调 46个。部分基因的定量 PCR验证表明, 芯片杂交结果可靠。上调表达基因经测序、冗余序列剔除, 一共获
得 36个 unique ESTs。已知功能的 22个上调表达基因, 涉及多条生理代谢途径, 如光合作用、离子转运和核酸代谢
途径; 以及多种分子水平的进程, 如基因转录、蛋白质合成与修饰以及细胞信号转导等。另外, 还检测到 14 个未知
功能基因。结果表明, 甘蔗对黑穗病的抗性具有复杂的机制。本研究为解释甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表达
及其网络构建奠定了基础, 还为今后系统研究甘蔗对生物与非生物胁迫的响应机制提供技术支持。
关键词: 甘蔗; 黑穗病菌; 斑茅; cDNA芯片; 差异表达基因
Application of E. arundinaceus cDNA Microarray in the Study of Differentially
Expressed Genes Induced by U. scitaminea
QUE You-Xiong, XU Li-Ping*, LIN Jian-Wei, XU Jing-Sheng, ZHANG Ji-Sen, ZHANG Mu-Qing, and
CHEN Ru-Kai
Key Laboratory of Genetic Improvement for Sugarcane, Ministry of Agriculture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
Abstract: RNAs of sugarcane leaves with (treatment) or without (control) the infection of U. scitaminea were extracted, subjected
to hybridization of cDNA microarray based on E. arundinaceus cDNA sequence and further validated by Real-time qPCR. There
were about 101 differentially expressed ESTs (with ratio value ≥2.0 or ≤0.5) among 3 860 genes sets in a microarray plate, with
55 up-regulated, and 46 down-regulated by U. scitaminea. After sequencing and redundant sequences elimination, we totally ob-
tained 36 unique ESTs up-regulated after the infection of U. scitaminea. Among them, 22 were involved in several metabolism
pathways, such as photosynthesis, ion transport and nucleotide metabolism, as well as some genes related to transcription factors,
proteins synthesis and modulation, and cellular signal transduction. And the function of the 14 remaining ESTs was unknown. In
conclusion, the molecular mechanism of sugarcane smut resistance is complex. This investigation would provide an understanding
for differentially expressed genes induced by U. scitaminea and set a mode for the systematic research on molecular mechanism
of sugarcane responses to biotic and abiotic stress.
Keywords: Sugarcane; Ustilago scitaminea; E. arundinaceus; cDNA microarray; Differentially expressed gene
甘蔗黑穗病是一种真菌病害。迄今, 许多研究者在黑
穗病菌的小种分化以及甘蔗对黑穗病的形态、细胞学和生
理生化抗性等方面开展了不少的研究, 但甘蔗对黑穗病
抗性的分子机制涉及众多基因的协同作用, 相关研究还
比较少。Orlando 等[1]利用 cDNA-AFLP 技术研究了甘蔗
与黑穗病菌互作后的分子响应 ; Que 等 [2]克隆了甘蔗
NBS-LRR类抗病相关基因, 并利用定量 PCR技术研究了
该基因在甘蔗对黑穗病抗性中的作用; 阙友雄等 [3]利用
DDRT-PCR 技术研究了甘蔗受黑穗病菌侵染后基因的差
异表达。
cDNA 芯片 , 又称 cDNA 微阵列 , 是一种反向
Northern杂交技术(Reverse Northern)[4]。利用结构基因组
提供的信息, cDNA芯片技术能够有效地对基因功能进行
系统分析 , 在植物功能基因组研究 , 尤其是在植物和病
第 5期 阙友雄等: 利用斑茅 cDNA芯片研究甘蔗受黑穗病菌侵染后基因差异表达 941


原互作响应中相关基因的鉴定和分离中, 有着广阔的应
用前景[4]。近几年来, cDNA 芯片技术已经被广泛应用到
植物与病原互作机制的研究当中, 在阐释病菌胁迫下植
物体内信号传导网络和基因差异表达模式等方面, 发挥
了重要的作用[5]。已有研究认为对于尚无可直接利用芯片
的特定植物 , 在尚未开发出芯片之前 , 可借用已开发的
模式植物或近缘植物芯片研究其基因表达[6]。类似地, 应
用该技术有望为甘蔗抗黑穗病相关基因的克隆和功能鉴
定提供更多的信息。
本实验运用农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室开
发的斑茅干旱胁迫 cDNA 芯片, 筛选黑穗病菌胁迫下甘
蔗中诱导表达的 EST。对克隆的 EST 进行序列比对和功
能分析, 目的是深入了解甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因
差异表达情况, 探讨甘蔗抗黑穗病的分子基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
植物材料为甘蔗高抗黑穗病品种NCo376, 由福建农
林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室提供。因主要
目的为研究甘蔗抗黑穗病品种的抗性机制, 仅使用抗病
品种为材料。接种所用病原菌为甘蔗黑穗病菌(U. scita-
minea Syd.)小种 2, 采集自感小种 2, 抗小种 1的甘蔗品种
F134。为保证实验数据可靠, 采用相同方法同时处理 2份
实验材料, 分别进行芯片杂交, 仅将 2次杂交中表达趋势
一致的芯片位点进行下一步分析。芯片相关信息见刘文龙
等文章[7]。
1.2 试验设计
选取 30 条生长健壮、长势一致蔗茎, 双芽茎段, 平
均分为 2份, 50℃热水脱毒处理 2 h后, 采用人工针刺接
种法, 其中一份接种黑穗病菌孢子悬浮液(实验组), 接种
浓度为 5×105个 mL−1, 另一份接种灭菌双蒸水(对照组)。
接种后置 25℃下保湿 24 h, 再种植于田间[8]。待甘蔗生长
到出现黑穗病症状后, 分别采集实验组和对照组的甘蔗
+1叶(可见肥厚带下第 1个叶片), 用于 RNA提取。
1.3 总 RNA的提取和纯化
提取甘蔗叶片总 RNA[9], 采用 QIAGEN RNeasy Kit
纯化 RNA。RNA线性放大和荧光探针制备与定量参照
Message Amp aRNA Kit (Ambion)说明书。
1.4 芯片杂交与洗涤
芯片杂交与洗涤具体步骤见阙友雄博士学位论文[10]。
1.5 cDNA芯片杂交的数据分析
图像获取和数据分析具体步骤见阙友雄博士学位论
文[10]。设定 Ratio 值在 0.5~2.0 范围内的基因表达差异不
显著, Ratio值≥2.0和≤0.5分别为表达上调(up-regulated)
和下调(down-regulated)基因。
散点图显示基因表达丰度差异。片内相关系数反映
芯片杂交重复性。检出率反应探针和模板匹配性。
1.6 cDNA克隆测序及序列分析
挑选芯片杂交中表达上调(Cy3/Cy5≥2)的克隆送到
上海生工生物工程技术有限公司测序。剔除冗余序列后,
得到 unique EST。在 NCBI 网站上(http://www.ncbi.nlm.
nih.gov)将 unique EST 进行比对, 根据蛋白相似性, 参考
拟南芥测序计划(Arabidopsis Sequencing Project)的功能
分类方法对 EST 进行分类, 并分析各个 EST 在甘蔗抗黑
穗病分子机制中的潜在功能。部分 EST 序列同数据库中
已知功能基因的同源性较低, 但考虑到本实验所获得的
EST序列较短, 仍然认为这些序列之间具有相同的功能。
1.7 以实时荧光定量 PCR验证芯片杂交数据
根据笔者已克隆甘蔗的 RGA 片段 (Ea-0564)和
NBS-LRR基因序列(Ea-0632), 25S rRNA基因为内参基因,
设计定量 PCR 引物(表 1)。25 μL PCR 体系含 12.5 μL
2×SYBR Primix Ex Taq, 0.5 μL Primer F (10 μmol L−1), 0.5
μL Primer R (10 μmol L−1), 2.5 μL cDNA模板, 和 9 μL dd
H2O。PCR程序为 95℃ 10 s, 94℃ 5 s, 60℃ 25 s, 40个循
环。设置 60℃至 90℃每隔 0.2℃读取荧光值 1次, 生成融
解曲线。每个样品设 3次重复。采用 DPS软件处理数据。

表 1 荧光定量 PCR引物
Table 1 Primers for Real-time qPCR
引物编号
Primer name
克隆号
Clone ID
引物序列
Sequence (5′−3′)
Ea0564-F GTCTTGGATGATGTATGGGAGAAAG
Ea0564-R
Ea-0564
CGATTGTGAACTGCCAAAGAAG
Ea0632-F GAAAACAACACAGCGGAGGAG
Ea0632-R
Ea-0632
GCAACAGCAAGGGCAAGA
25S rRNA2F GCAGCCAAGCGTTCATAGC
25S rRNA2R
Internal control
CCTATTGGTGGGTGAACAATCC

2 结果与分析
2.1 cDNA芯片杂交效果
从 cDNA芯片杂交散点图(图 1-A)可以看出, 部分基
因分布于散点图的左上侧, 在甘蔗受黑穗病菌胁迫后上
调表达; 部分基因分布于散点图右下侧, 下调表达。片内
相关系数为 0.705, 散点集中在斜率为 1 的轴线两侧, 杂
交数据重复性良好, 结果可靠(图 1-B)。
942 作 物 学 报 第 35卷


图 1 芯片杂交的散点图和片内相关系数
Fig. 1 Dot plot of hybridization signals and intra-slip relativity
A: 散点图; B: 片内相关系数图。
A: dot plot of hybridization signals; B: intra-slip relativity.

2.2 甘蔗受黑穗病菌胁迫后上调表达 EST的筛选与功能
分类
从 1 844个检测位点(即 3 860个芯片点阵中杂交信
号良好位点)中, 共筛选出 101个差异表达 ESTs, 其中 55
个为上调表达 ESTs, 46个为下调表达 ESTs。
对上调表达的 55 个 ESTs 进行单向测序, 经序列分
析, 剔除冗余序列, 得到 36个 unique ESTs(表 2)。同源性
检索发现其中 14个为功能未知的新基因, 其余 22个均在
GenBank 上检索出同源基因, 占所有 36 个上调表达 unique
EST的 61.1%。这些 EST大体被分为 8大类(表 2):
(1) 蛋白质合成与蛋白修饰相关基因, 包括 2个核糖
体蛋白基因。Wool 等[11]研究表明, 核糖体蛋白参与蛋白
质生物合成、复制、转录、翻译调控、细胞凋亡、DNA
修复等, 在生物体的生长、发育过程中起重要的作用。本
研究中, 核糖体蛋白上调表达, 以适应黑穗病菌的胁迫。
(2) 碳水化合物代谢相关基因, 包括如 UDP-葡萄糖
-4-差向异构酶基因、二磷酸核酮糖羧化酶基因、C2结构
域蛋白和 Rubisco活化酶等 4个基因。其中, 二磷酸核酮
糖羧化酶是卡尔文循环的关键酶, 还对许多外界因子如
水杨酸、盐胁迫和干旱处理等具有明显的应答反应[12]。
本研究中, 4个碳水化合物代谢相关基因上调表达, 表明
黑穗病菌胁迫影响了碳水化合物合成和甘蔗的光合作用。
(3) 细胞信号转导相关基因, 包括 8个基因, 如受体
蛋白激酶基因和锌指蛋白基因等。蛋白激酶对植物-病原
菌互作反应具有调节作用, 在对病毒、细菌等的抗性中发
挥重要作用[13]。锌指蛋白是最大的一类 DNA 结合蛋白,
在植物耐盐和耐高盐中具有重要作用, 并受低温和 ABA
的特异诱导[14]。而 ATP 合酶(登录号为 EU071808) 是生
物体内进行氧化磷酸化和光合磷酸化的关键酶[15]。这表
明细胞信号途径可能与甘蔗对黑穗病的抗性密切相关。
(4) 转录相关基因, 如 RNA聚合酶基因。RNA聚合
酶(RNA polymerase)能识别启动子, 形成转录复合物, 启
动特定基因转录和表达 [16]。黑穗病菌胁迫后, 可能正是
RNA 聚合酶转录了在黑穗病抗性反应中起作用的基因的
转录和表达。
(5) 核酸代谢相关基因, 如核酸结合蛋白基因。
(6) 起离子转运作用的基因 , 如泛肽蛋白连接酶基
因。泛肽基因与离子转运有关, 不仅在热胁迫、干旱胁迫
和烟草花叶病毒抗性中起作用 [17], 还能直接参与病原体
防御, 提高植物对病害的综合抗性[16]。离子转运途径可能
参与了甘蔗对黑穗病菌胁迫的响应。
(7) 其他在甘蔗受黑穗病菌胁迫过程中发挥作用的
相关基因, 如 NADH 脱氢酶基因和细胞壁蛋白基因。植
物可以通过调节 NADH 介导的循环电子传递或叶绿体呼
吸电子传递来平衡植物细胞氧化还原系统, 影响 Rubisco
酶活性, 减轻逆境胁迫的伤害。细胞壁蛋白是细胞壁的结
构成分, 细胞壁的功能主要体现在 3个方面, 即维持细胞
形状与控制细胞生长、物质运输与信息传递以及参与植物
的抗逆反应。
(8) 未知功能基因。共 14个, 占 38.9%。另外, 36条
差异表达基因, 在 cDNA芯片杂交中的 Ratio值是不一样
的, 分布在 2.045~9.572 之间, 具有不同的表达水平(表
2)。
2.3 cDNA芯片杂交结果的定量 PCR验证
所选择的两个 ESTs 序列在用定量 PCR 技术进行表
达分析时, 虽然在具体的 Ratio 值上并未与芯片杂交分析
结果完全吻合, 但是, 这两个 ESTs 序列表达却同它们各
自在 cDNA芯片杂交中的结果基本一致, 其中 Ea-0564在
芯片杂交和定量 PCR 验证中的 Ratio 值分别为 2.113 和
2.524, Ea-0632 的 Ratio 值则分别为 2.468 和 1.972, 皆为
上调表达(图 2)。结合芯片阳性参照 GAPDH 和 APRT 的
杂交结果和定量 PCR验证结果一致[18]。因此, cDNA芯片
表 2 甘蔗受黑穗病菌胁迫后 cDNA芯片中表达上调的 ESTs序列分析
Table 2 Sequence alignment of up-regulated ESTs after infection by U. scitaminea
基因类型(个数)
Gene type (number)
克隆编号
Clone ID
NCBI登录号
Accession number
Ratio值
Ratio value
Blast检索
Blast hit
功能描述
Description
物种
Species
同源性(氨基酸)
Homology (Amino acid)
Ea04-042 EU071783 2.682 CAA68422.1 Ribosomal protein L22 Zea mays 84/85 (98%) 蛋白质合成与修饰相关基因(2)
Protein modulation and protein synthesis(2) Ea10-053 EU071788 3.018 CAA68422.1 Ribosomal protein L22 Zea mays 86/86 (100%)

Ea09-052 EU071785 2.338 AAP68981.1 UDP-glucose-4-epimerase Zea mays 25/27 (92%)
Ea04-043 EU071784 2.110 XP_465295.1 C2 domain-containing protein-like Oryza sativa 18/18 (100%)
Ea27-063 EU071793 2.277 CAA78027.1 Ribulose bisphosphate carboxylase Zea mays 128/129 (99%)
碳水化合物代谢相关基因(4)
C-compound, carbohydrate metabolism(4)
Ea13-074 EU071798 2.089 AAA18392.1 Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit Zea mays 85/87 (97%)


Ea04-106 EU071787 3.207 BAD46526.1 Putative receptor-like protein kinase O. sativa 34/35 (97%)
Ea07-074 EU071803 3.135 XP_470885.1 Putative ring-H2 zinc finger protein O. sativa 14/31 (45%)
Ea08-092 EU071807 6.385 ABA98616.1 Protein kinase domain O. sativa 14/34 (41%)
Ea12-075 EU071813 2.080 BAB97372.1 S-locus-related I M. arvensis 13/27 (48%)
Ea08-104 EU071808 2.352 NP_188532.2 Protein binding A. thaliana 19/67 (28%)
Ea09-104 EU071786 2.674 BAD27289.1 ATP synthase I subunit S. officinarum 107/109 (98%)
Ea05-064 EU071800 2.113 XP_550392.1 Putative leucine-rich repeat/extensin 1 O. sativa 11/14 (78%)
细胞信号转导相关基因(8)
Cellular communication and signal transduction
Mechanism(8)
Ea06-032 EU071801 2.468 NP_172668.1 Leucine-rich repeat/extension A. thaliana 24/81 (29%)


转录相关基因(1)
Transcription(one)
Ea16-090 EU071789 2.045 CAA36511.1 RNA polymerase beta subunit Zea mays 84/115 (73%)
核酸代谢相关基因(1)
Nucleotide metabolism(1)
Ea50-033 EU071795 2.125 AAA33486.1 Nucleic acid-binding protein O. sativa 42/48 (87%)
Ea07-018 EU071802 2.455 NP_850430.1 Ubiquitin-protein ligase/ zinc ion binding A. thaliana 15/46 (32%) 离子转运相关基因(2)
Ion transporter(2) Ea05-029 ---------- 2.939 NP_187459.1 Ubiquitin-protein ligase/ zinc ion binding A. thaliana 14/44 (31%)


Ea08-037 EU071806 4.479 AAT02521.1 Cell wall protein Chlamydomonas 10/13 (76%)
Ea13-052 EU071797 2.802 CAA59104.1 D-hordein H. vulgare 8/21 (38%)
Ea14-019 EU071790 3.207 CAA09812.1 NADH dehydrogenase H. vulgare 98/101 (97%)
甘蔗受黑穗病菌胁迫过程中起其他作用的基因
(4)
Others(4)

Ea17-060 EU071810 2.904 AAD38291.1 Putative polyprotein O. sativa 15/42 (35%)


Ea13-068 EU071782 2.833 AAT44674.1 Hypothetical protein 137 S. officinarum 118/118 (100%)
Ea21-261 EU071791 2.779 ABD32447.1 Hypothetical protein M. truncatula 20/74 (27%)
Ea21-059 EU071792 2.172 CAA33959.1 Unnamed protein produc O. sativa 37/58 (63%)
Ea50-052 EU071796 5.957 AAT94024.1 Hypothetical protein O. sativa 12/26 (46%)
Ea08-123 EU071809 2.463 BAD35205.1 Hypothetical protein O. sativa 25/71 (35%)
Ea22-133 EU071811 9.572 AAM64462.1 unknown A. thaliana 15/37 (40%)
Ea04-118 EU071812 3.573 AAR91063.1 Hypothetical protein Zea mays 37/82 (45%)
Ea30-097 EU071794 2.081 BAD44787.1 Unknown protein O. sativa 14/33 (42%)
Ea05-039 EU071799 2.119 AAU43987.1 Unknown protein O. sativa 12/27 (44%)
Ea13-053 2.321 XP_474151.1 OSJNBa0060D06.10 O. sativa 19/55 (34%)
Ea08-021 EU071805 2.064 XP_450232.1 Hypothetical protein O. sativa 16/42 (38%)
Ea08-015 EU071804 2.882 NP_918590.1 B1080D07.24 O. sativa 20/71 (28%)
Ea12-091 EU071814 2.303 AAT44674.1 Hypothetical protein 137 S. officinarum 124/125 (99%)
未知功能基因(14)
Unknown(14)

Ea02-038 EU071815 3.066 AAT44674.1 Hypothetical protein 137 S. officinarum 100/101 (99%)

944 作 物 学 报 第 35卷

能较真实反映基因表达变化, 差异的产生可能仅仅是实
验误差或者两种实验技术之间本身的灵敏度差异导致。

图 2 cDNA芯片的定量 PCR验证
Fig. 2 Real-time qPCR assay of cDNA microarray hybridization
data

3 讨论
cDNA 芯片技术具有高通量和高敏感性特点, 在植
物与真菌互作以及植物与细菌互作的分子机制研究方面
的应用较为广泛[5-6,19-20]。然而, 由于研究对象(如基因组
不清楚等)及经费问题, 大多植物目标 cDNA 芯片尚未开
发, 限制了 cDNA 芯片技术的应用。Girke 等[6]的研究证
实, 拟南芥 cDNA芯片可应用于近缘植物基因表达研究。
此后, 近缘和远缘植物芯片的应用已经有不少成功的报
道[21-22]。
斑茅是甘蔗的近缘植物。本实验利用斑茅干旱胁迫
cDNA芯片, 对黑穗病菌胁迫后甘蔗基因表达的差异情况
进行了初步研究, 共检测到 1 844个表达位点, 占芯片总
位点的 47.78%, 获得了 36 个上调表达的差异基因, 表明
甘蔗 cDNA与斑茅 cDNA之间的近缘杂交是有效的, 说明
利用斑茅干旱胁迫 cDNA 芯片可以获得甘蔗受黑穗病菌
胁迫后基因差异表达的大量信息。定量 PCR 验证结果也
表明, 斑茅干旱胁迫 cDNA 芯片能较真实地反映甘蔗受
黑穗病菌胁迫后部分基因的表达量变化。因此, 甘蔗逆境
相关基因芯片诞生之前, 斑茅干旱胁迫 cDNA 芯片可用
于甘蔗基因差异表达的研究。
植物在长期进化过程中形成了一套复杂的机制来抵
御病原菌的侵染, 它们通过感知病原物并迅速启动防卫
反应, 以达到抗病目的[5,21-22]。前人研究表明, 在植物与
病原互作过程中 , 有各种不同功能的大量基因差异表
达[19-20]。本实验中, cDNA 芯片杂交结果表明, 在甘蔗受
黑穗病菌胁迫后 , 上调表达的基因 , 除部分直接参与病
原物的杀伤和阻遏(如细胞壁蛋白基因)外, 更多的是在抗
黑穗病机制中参与不同生理代谢或分子途径。这些基因的
功能涉及光合作用、离子转运以及核酸代谢等, 同时基因
转录和细胞信号转导相关基因也上调表达。推测甘蔗对黑
穗病菌的抗性是多种代谢途径和不同水平分子进程协调
作用的结果。这与 Orlando 等[1]的研究结果一致; 笔者[3]
前期利用 DDRT-PCR 技术研究甘蔗受黑穗病菌侵染后基
因的差异表达, 也获得类似的结果。因此, 甘蔗对黑穗病
的抗性是众多基因共同参与的一个分子适应过程。本实验
结果对利用近缘植物基因芯片, 研究甘蔗基因表达差异
无疑具有积极的借鉴作用。
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