全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(4): 631−639 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2007AA100701), 农业部引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目(2006-G37), 国家自
然科学基金项目(30170639), 福建省科技厅国家科技项目备案(F2007AA100701)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 许莉萍。
第一作者联系方式: E-mail: queyouxiong@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2008-08-28; Accepted(接受日期): 2008-12-13.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00631
甘蔗 NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定
阙友雄 许莉萍* 林剑伟 陈如凯
福建农林大学 / 农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室, 福建福州 350002
摘 要 : 根据已知植物(拟南芥、烟草和亚麻 )抗病基因 (RGAs)保守序列设计简并引物 , 从甘蔗高抗黑穗病品种
NCo376的基因组 DNA和 cDNA中扩增出 11条抗病基因同源序列, 其中 5条来自基因组 DNA (EF059973、EF059974、
EF059975、EF059976和 EF059977), 6条来自 cDNA(EF155648、EF155649、EF155650、EF155651、EF155652和 EF155653)。
序列分析表明, 这些 RGAs均含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守结构域 P-loop、Kinase-2a、 Kinase-3a 和
疏水结构域。聚类分析表明, 11条 RGA同 RPS2和 XA1聚为一类, 而 N和 L6则单独聚为一类。所有 11条抗病基因
同源序列中, kinase-2 (LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸。定量 PCR分析表明, 编号为 EF059974的 PIC基
因的表达不仅受黑穗病菌胁迫的影响, 而且受水杨酸的诱导和过氧化氢的抑制, 也具有抗病基因组织特异性和组成
型表达特性。
关键词: 甘蔗; NBS-LRR; 抗病基因同源序列
Isolation and Characterization of NBS-LRR Resistance Gene Analogs from
Sugarcane
QUE You-Xiong, XU Li-Ping*, LIN Jian-Wei, and CHEN Ru-Kai
Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Ministry of Agriculture / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
Abstract: The large group of plant disease resistance (R) genes that share similar structures possesses a predicted nucleo-
tide-binding site (NBS) domain. NBS domains of this class of R genes show highly conserved amino acid motifs, which makes it
possible to isolate resistance gene analogs (RGAs) by PCR with degenerate primers. According to the conserved motifs in the
NBS regions of the three typical NBS-LRR type resistance genes (RPS2, N, and L6), five degenerate and one non-degenerate
primers were designed to correspond to P-loop motif in sense direction, and nine degenerate plus one non-degenerate primers
were made corresponding to the HD motif in the anti-sense direction. Then, the homologous PCR was used to amplify NBS se-
quences from genomic DNA and cDNA using sugarcane variety NCo376 with smut resistance. In all, eleven RGAs were obtained,
five from DNA (EF059973, EF059974, EF059975, EF059976, and EF059977) and six from cDNA (EF155648, EF155649,
EF155650, EF155651, EF155652, and EF155653). Sequence analysis showed that RGAs comprised the conserved domains
P-loop, Kinase-2a, Kinase-3a, and HD, which was conserved in NBS-LRR type disease resistance gene. Cluster analysis showed
that eleven RGAs and RPS2 and XA1 were clustered into one group, and N and L6 were divided into another group. Further,
amino acid sequences showed that their last amino acid in alignment was residue W in LLVLDDV(W/D) motif, which is typical to
non-TIR-NBS-LRR type gene. It was suggested that only non-TIR-NBS-LRR but not TIR-NBS-LRR type resistance genes ex-
isted in sugarcane genome. One RGA termed PIC (EF059974) was randomly selected for function validation through Real-time
PCR. The result showed that expression of PIC gene could to some extent be influenced by U. scitaminea, SA and H2O2, and had
the characteristics of constitutive expression and tissue-specific. The RGA cloned in this experiment may provide the shortcut for
cloning of sugarcane disease resistance gene.
Keywords: Saccharum officinarum; NBS-LRR; RGA (resistance gene analogs)
抗病基因同源序列(resistance gene analog, RGA)
是一种存在于植物基因组中具有某些特定保守结构
域的 DNA区段。综合运用同位克隆、转座子标签和
同源克隆等技术, 已分离出 30多个具有该结构域的
632 作 物 学 报 第 35卷

植物抗病基因[1]。根据这些抗病基因编码的蛋白质
结构特征 , 可以将除玉米 Hml (Helminthosporium
carbonum susceptibility 1)外的其他基因分为 4大类,
即含有核苷酸结合位点 (NBS)和富含亮氨酸重复
(leucine-rich repeats, LRR)的胞内受体蛋白基因、丝
氨酸／苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase, STK)
基因、含有胞外 LRR结构的跨膜受体蛋白基因以及
同时含有胞外 LRR 和胞内 STK 结构的跨膜受体蛋
白基因[2], 其中以 NBS (nucleotide binding site)类抗
病基因为主。许多研究证明, 一些 RGA与抗病基因
(resistance gene, R基因)紧密连锁, 甚至本身就是抗
病基因的一部分。此外, RGA 还具有容易获得、扩
增结果稳定和使用费用低廉等优点。因此, 以 RGA
区段的保守性为基础设计 PCR 特异简并引物, 扩增
R 基因同源序列, 进而进行抗病基因的分离和克隆,
已经成为当前比较流行的标记、定位和克隆植物抗
病基因的策略之一。
然而, 对甘蔗 R 基因的克隆至今尚未取得实质性
进展。主要原因是甘蔗基因组大, 遗传背景复杂, 现代
甘蔗栽培种大多是蔗属 3个种(Saccharum officinarum、
Saccharum spontaneum和 Saccharum bareri)的复合物,
有的是 4个种(含 Saccharum sinense)的复合物, 属高度
杂合的异源多倍体和非整倍体植物, 不同品种间染色
体数目差异大, 从 80条到 140条不等, 建立用于位点
分析的理想群体非常困难, 限制了图位克隆法的应
用。与此同时, 甘蔗缺乏合适的转座子系统, 因而也难
以通过转座子标签方法克隆基因。利用已知植物抗病
基因的保守结构域, 设计 PCR 简并引物, 将有望从那
些暂时还无法利用图位克隆和转座子标签技术分离目
的基因的作物中分离 RGA。从甘蔗中分离 RGA, 不仅
有助于筛选与甘蔗中各种抗病基因连锁的分子标记,
而且对某些 RGA的结构特征、表达特性以及调控特点
的研究, 将有望深入阐释甘蔗的抗病机制, 也为进一
步利用图位克隆、转座子标签技术或者 RACE (rapid
amplification of cDNA ends, RACE)技术获得甘蔗抗病
基因全长奠定基础。本文拟根据前人已克隆的
NBS-LRR类抗病基因保守序列设计简并引物, 克隆分
离甘蔗 RGAs, 选取其中一个 RGA 进行功能分析, 为
最终克隆甘蔗抗病基因奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试验设计
甘蔗高抗黑穗病品种 NCo376 来自福建农林大
学甘蔗综合研究所。用于 RGAs克隆的 DNA和 RNA
提取所用叶片直接采集自田间种植甘蔗。同时取生
长健壮、长势一致的蔗茎, 50℃热水脱毒处理 2 h后,
进行带菌检测[3], 采用托盆种植, 沙培, 共 6 盆, 每
盆 21 株, 置赛福 PGX-380C 光照培养箱中, 在光照
强度 275 µmol m−2 s−1, 光照 13 h, 黑暗 11 h, 温度
27℃条件下培养。待长至五叶期时, 分别进行每毫
升 5×105 个黑穗病菌孢子的悬浮液针刺接种蔗芽[4],
及以 5 mmol L−1 SA和 10 mmol L−1 H2O2喷射叶面处
理, 以蒸馏水进行同样处理作为对照。分别在处理
后 0、6、12、24、48、60 和 72 h 剪取完全展开的
功能叶, 每次取 3 株, 液氮固定, 置−80℃冰箱保存
备用, 用于定量 PCR分析。
1.2 RNA提取和 cDNA合成
在传统的Trizol法的基础上略加改进[5], 提取甘
蔗叶片总RNA, 分别采用CLONTECH公司的SMART
PCR cDNA Synthesis Kit和Advantage2 PCR Kit进行
cDNA 第 1 链和第 2 链合成。同时, 为了比较实用
cDNA和DNA进行NBS区域克隆的优劣, 采用 SDS
法提取基因组 DNA[6]。
1.3 PCR扩增和目的片段克隆
根据已克隆的 NBS-LRR 类抗病基因 NBS 保守
结构域(GLPIAL)设计简并引物(表 1)。25 µL反应体
系中含 10×PCR buffer (plus Mg2+) 2.5 µL, dNTPs
(2.5 mmol L−1) 0.5 µL, Forward primer (10 µmol L−1)
2.5 µL, Reverse primer(10 µmol L−1) 2.5 µL, Taq (5 U
µL−1) 0.2 µL, ddH2O 15.8 µL。反应程序为 94 ℃预变
性 4 min; 94℃ 45 s, 45℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35个循环;
72℃ 10 min。同时以去离子水为模板, 作为阴性对
照实验。反应结束后, 以 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
而后进行目的片段的回收、克隆。
1.4 甘蔗抗病基因同源序列遗传多样性及进化
关系分析
将经 PCR 和酶切鉴定的阳性克隆送往上海捷瑞
生物技术有限公司测序。序列采用 Blast程序进行相似
性搜索, 然后利用 DNAMAN 6.0查找 ORF并翻译成
氨基酸序列, 进行氨基酸序列同源性比对。参比基因
为拟南芥 RPS2 (ATU14158)、水稻 Xa-1 (AB002266)、
烟草 N (U15606)以及亚麻 L6 (LUU27081)基因。
1.5 PIC基因功能的定量 PCR分析
定量 PCR分析中, 以 25S rRNA基因作为内参。
根据前面克隆 RGAs中 PIC (EF059974)序列和前人
克隆的 25S rRNA (BQ536525)基因序列, 设计定量
第 4期 阙友雄等: 甘蔗 NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定 633


表 1 甘蔗 RGA克隆所用引物序列
Table 1 Primers used in RGA amplification
引物代号
Primer name
类群
Group
保守氨基酸结构域
Conserved motifs
引物序列
Primer sequences(5′–3′)a
Forward
H1145 --- GGVGKTT GGIGGIRTIGGIAAIACIAC
H2016b --- GGVGKTT GGTGGGGTTGGGAAGACA ACG
H2017 --- GGSGKTT GGIGGIWSIGGIAARACIAC
H2018 --- GGLGKTT GGIGGIYTIGGIAARACIAC
H2019 --- GGMGKTT GGIGGIATIGGIAAAACIAC
LM638 --- GGVGKTT GGIGGIGTIGGIAAIACIAC
Backward
H1146 Universal GLPL IARIGYIARIGGIARICC
H2021 Universal GLPLAL CAACGCTAGTGGCAATCC
H2020 Universal GL/FPL/FAL/V CAANGCCAANGGCAANCC
H2022b Universal GL/FPL/FAL/V CAGNGCNAGNGGNAGNCC
H2023 TIR FLDIACF RAARCAIGCSATRTCIARRAA
H2026 TIR FLHIACR RAARCAIGCDATRTGIAR RAA
H2024 non-TIR LKRCFLY RTAIAGRAARCAISKYAG
H2025 non-TIR FAYCSLF RAAIARISWRCARTAIGCRAA
H2027 non-TIR YCALFPE YTCIGGRAAIARIGCRCARTA
LM637 A(A/G)IGCTA(A/G)IGGIA(A/G)ICC
a I: inosine, R: A/G, W: A/C, Y: C/T, N: A/G/C/T, S:G/C, D: A/G/T, K:G/T. b Non-degenerate primers were used to compare PCR effi-
ciency against degenerate primers.

PCR 引物。PIC 基因正向引物 5′-GTCTTGGATGA
TGTATGGAGAAA-3′, 反向引物 5′-CGATTGTGA
ACTGCCAAAGAAG-3′; 内参基因 25S rRNA 正向
引物 5′-GCAGCCAAGCGTTCATAGC-3′, 反向引物
5′-CCTATTGGTGGGTGAACAATCC-3′。
10 µL的反转录体系含 2 µL 5×RT缓冲液, 0.5
µL dNTPs 10 mmol L−1, 1 µmol L 6碱基随机引物,
Exscript RTase 反转录酶 50 U, 0.25 µL RNase In-
hibitor, 1 µL 总 RNA (500 ng)作为模板, 用 RNase
free H2O补足 10 µL。42℃反应 10 min, 95℃, 2 min,
5℃保持 5 min。定量 PCR分析中, 所用仪器为 ABI
PRISM7500 实时荧光定量 PCR 仪。以上述反转录
cDNA 产物为模板 , 反应体系为 25 µL 含 SYBR
Primix ExTaq (2×) 12.5 µL, 上游和下游引物各 0.5
µL, cDNA模板 2.5 µL, 无菌水 9 µL。每个样品设置
3次重复。反应条件为 95℃ 10 s; 94℃ 5 s, 60℃ 25 s,
共 40个循环。反应结束后, 进行融解曲线分析。在
样品扩增的同时, 以实验中不同处理的 cDNA 模板
混合样进行 10倍梯度稀释制作标准曲线。相对表达
量= (Eref) Ct ref/(Etarget) Ct target, 采用 DPS数据处理系
统分析数据。
2 结果与分析
2.1 甘蔗 NBS类 RGA的分离与鉴定
利用表 1 中引物组合, 分别以甘蔗基因组 DNA
和 cDNA 为模板进行 PCR 扩增(图 1)。多对引物在

图 1 甘蔗 RGA扩增结果
Fig. 1 RGA amplification in sugarcane
A: 以 DNA为模板; B: 以 cDNA为模板; M: DNA分子量标准; 1~8: 8个不同引物组合的扩增结果; C: 空白对照。
A: amplification with DNA; B: amplification with cDNA; M: DNA ladder marker; 1–8: PCR results of eight primer combinations, respec-
tively; C: negative control.
634 作 物 学 报 第 35卷

甘蔗基因组DNA和 cDNA中扩增出了一条或者多条
带。根据已克隆的 NBS-LRR 类抗病基因分析结果,
其 NBS结构域长度大多数集中在 500 bp左右。因此
对每对引物扩增产物中长度在 500 bp左右的片段进
行回收、克隆和测序, 发现其中 11条 RGAs片段具
有典型的 NBS 结构域 , 即 P-loop (GGVGKTT),
Kinase-2a (VLDDVW), Kinase-3a (GSR/KILVTTR),
以及疏水结构域 HD(hydrophobic domain)。因此, 共
获得了 11条 NBS类抗病基因同源序列。
2.2 甘蔗 RGA 编码氨基酸序列的比对及聚类分
析
11条甘蔗 NBS类抗病基因同源序列中, 5条分
离自基因组 DNA(EF059973、EF059974、EF059975、
EF059976和EF059977), 6条分离自 cDNA (EF155648、
EF155649、 EF155650、 EF155651、 EF155652 和
EF155653)。图 2的聚类分析显示, 11条甘蔗抗病基
因同源序列所编码氨基酸, 同 4 个已知 R 基因氨基
酸序列的同源性较低, 大多集中在 24%~35%之间。
其中 EF155653 同水稻 Xa1 基因之间的同源性为
35%。而且, 11条甘蔗抗病基因同源序列相互之间在
氨基酸水平上的同源性表现出丰富的多态性, 同源
性分布在 24.8%~99.4%之间。说明 11 条 NBS 类抗
病基因同源序列, 可能分属于甘蔗中不同的抗病基
因, 或具有 NBS结构域的不同基因。另外, 11条甘
蔗抗病基因同源序列同两个已克隆的、典型的
non-TIR-NBS-LRR 类抗病基因 Xa1 和 RPS2 聚成一
类; 而两个 TIR-NBS-LRR类抗病基因 L6和 N却自
成一类。
氨基酸序列比对结果表明(图 3), 11条甘蔗抗病
基因同源序列与植物中 4个已克隆NBS-LRR类抗病
基因(Xa1、RPS2、L6 和 N)的 NBS 区段对应保守结
构域具有较高的同源性, 均含有 4个NBS-ARC保守
结构域 , 包括用以设计引物序列的两端保守区
(GMGGVGKTT和 GLPLAL)以及 Kinase-2 (VLDDV
W/D)和 Kinase-3 (GSR/KILVTTR)等 4个保守区。值
得注意的是, 所有 11 条甘蔗抗病基因同源序列中
kinase-2 (LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨
酸 (W), 而这已经被证明可以用来区分 non-TIR-
NBS-LRR 类抗病基因(Xa1 和 RPS2)和 TIR-NBS-
LRR类抗病基因(L6和 N)。
2.3 甘蔗 PIC基因的表达分析
2.3.1 PIC 基因和 25S rRNA 基因的定量 PCR 分
析效果 从图 4 可以看出, 内参基因和目的基因
标准曲线的线性范围较广, 在 cDNA 模板稀释 1、

图 2 甘蔗中 11个 NBS序列与 4个已知 R基因相应片段的聚类
分析
Fig. 2 Cluster analysis of eleven NBS sequences in sugarcane
and four R genes fragments cloned

10−1、10−2、10−3和 10−4倍等 5个梯度上具有良好线
性关系, 在检测的线性范围内, Ct 值和起始模板稀
释倍数的对数值之间相关系数 R2 均大于 0.998, 相
关性好; 扩增曲线呈 S 型, 符合 PCR 指数扩增, 无
不良成分的影响。同时, 图 4还显示, 融解曲线均呈
锥形状的单一峰, 没有其他杂峰, Tm值分别为 78℃
和 82℃左右, PCR 反应的特异性良好, 没有产生引
物二聚体和非特异性扩增, 这也得到琼脂糖凝胶电
泳的验证。另外, 每个样品 3 次扩增的重复性良好,
说明实验方法稳定, 结果可靠。
2.3.2 PIC基因在不同处理条件下的表达分析
图 5显示, 病原菌接种后, 甘蔗 PIC基因的表达表现
出一定程度的“抑-扬-抑”趋势。首先, 在 12~24 h时
间段, SNLR 基因的表达受到抑制, 但维持在一个相
对稳定的表达水平, 12 h和 24 h的表达量相当, 但都
低于对照。其次, 在 36 h表达量最高, 48~72 h之间
又表现出下降的趋势。总体上, 甘蔗接种病原初期
抑制 PIC 基因的表达, 接着上调表达, 最后抑制表
达。假若 PIC 基因与甘蔗抗黑穗病有关, 则可能的
解释之一为甘蔗黑穗病菌侵染蔗芽初期繁殖数量相
对较少, 对 SNLR基因表达的诱导不强; 而后增殖加
强, 促使 PIC 基因上调表达, 这反过来抑制病原菌
繁殖, PIC基因表达量下降。
第 4期 阙友雄等: 甘蔗 NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定 635








图3 甘蔗RGA序列的氨基酸比对分析
Fig. 3 Amino acid sequences alignment of eleven NBS sequences in sugarcane and four R genes cloned
636 作 物 学 报 第 35卷


图 4 甘蔗 PIC基因和 25S rRNA的标准曲线(A、B)、扩增曲线(C、D)和融解曲线(E、F)
Fig. 4 Standard curve (A, B), amplification curve (C, D), and melting curve (E, F) of PIC and 25S rRNA gene in sugarcane

图 6 显示 , 甘蔗叶片喷射水杨酸(SA)后 , PIC
基因的表达特点同黑穗病菌胁迫下不同。在 SA 处
理的初期(12 h), 叶片中 PIC 基因的表达量明显高
于对照 , 并在处理 24 h 达最高 , 而后表达下调并
维持较低表达量。PIC 基因在 SA 胁迫下的表达特
点可以归结为“扬-抑”类型。这可能是由于 , 在处
理早期 SA起着信号因子的作用 , 诱导抗病相关基
因 PIC的表达 ; 而后 , PIC基因抑制病原菌的生长,
缓解病菌胁迫 , PIC 基因的表达也随之减弱 , 表达
量下降。
第 4期 阙友雄等: 甘蔗 NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定 637



图 5 PIC基因在甘蔗接种黑穗病菌后的表达特点
Fig. 5 Expression pattern of PIC gene under U. scitaminea
treatment

图 6 PIC基因在水杨酸胁迫下的表达特性
Fig. 6 Expression pattern of PIC gene under SA treatment

图 7显示, 过氧化氢(H2O2)处理 72 h内, PIC基
因表达都受到抑制。处理 12 h的 PIC基因表达量仅
为对照中的 25%, 而后继续下降, 在 36~48 h之间保
持相对稳定, 但在 60 h 急剧下降, 仅有微量表达,
其后表达量较大幅度上调, 但仍然低于对照。外源
H2O2可抑制病原菌的生长, 同时也往往造成 ROS的
积累, 这是植物本身对逆境作出的一种防御反应。
H2O2(包括外加的和植物本身受到胁迫后产生的)在
整个处理时段中都抑制 PIC 基因表达, 仅在处理末
期表达量上调, 属于“全程抑制”类型。原因可能是外
源 H2O2的添加, 抑制了甘蔗叶片中的细菌和真菌的
生长, 缓解甚至解除了不良微生物的胁迫。因此, 抗
病相关机制尚未启动, PIC 基因仅维持一个较低水
平的表达量。

图 7 PIC基因在过氧化氢处理中的表达特性
Fig. 7 Expression pattern of PIC gene under H2O2 treatment

2.3.3 PIC 基因在甘蔗根、茎和叶片中的表达情
况 图 8 显示, PIC 基因的组成型表达具有组织
特异性, 其中表达量在叶片中远远高于根中, 也比
茎中高出不少。

图 8 PIC基因在不同甘蔗组织中的表达
Fig. 8 Expression of PIC gene in different tissues of sugarcane

3 讨论
RGA 是个庞大的基因家族, 从基因组中分离的
部分 RGA 可能由于内含子的存在, 无法通读, 为不
表达的假基因, 而从 cDNA中分离的 RGA则均为表
达序列, 不含任何内含子, 它们是抗病候选基因的
可能性更大, 这将更有利于真正的抗病基因的筛选[7]。
本研究从高抗黑穗病甘蔗品种 NCo376 中克隆的 11
条抗病基因同源序列 , 无论是来自基因组 DNA(5
条), 还是来自 cDNA (6条), 都不含内含子, 这可能
仅仅是所克隆 RGA 数量较少才导致的现象。这 11
条 RGA 编码的氨基酸序列均含有 NBS 的 4 个保守
结构域, 即 P-loop(GGVGKTT)、Kinase-2(VLDDVW/
D)、Kinase-3(GSR/KILVTTR)和 HD(GLPLAL)。另
外, 所有 11条抗病基因同源序列中, kinase-2 (LLVL
DDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸, 这符合 Pan
等[8]的研究结果, 即单子叶植物所有 NBS-LRR类抗
病基因皆为 non-TIR-NBS-LRR类。
NBS 结构域是最重要的抗病基因保守结构域之
一, 在植物的抗病反应中起着重要的作用[9]。但是,
NBS 与基因的抗病功能没有必然联系, 并非只有抗
病基因才具有NBS结构域, 具有NBS结构域的基因
也不一定就是抗病基因 [10]。许多蛋白家族 , 包括
RAS (rat sarcoma)族蛋白、ATPase延伸因子、G蛋
白都含有 NBS位点。这些蛋白家族广泛参与细胞生
长、分化、细胞骨架构成、小泡转运和对病原体的
防御反应[2]。另外, NBS 还出现在许多 ATP 和 GTP
的结合蛋白中, 可能起激活激酶或 G 蛋白, 参与蛋
白质磷酸化的作用, 从而放大抗病反应信号, 使植
物对病原产生过敏反应 (hypersensitive response,
HR)[11]。除了 NBS结构域, NBS-LRR类抗病基因还
应具有其他一些重要的结构域, 如 TIR (toll or inter-
luken-1-receptor)、 LRR (leucine-rich repeats)或 LZ
(leucine zipper)等。因此, 本研究分离得到的 11条 NBS
类抗病基因同源序列, 仅为潜在的抗病基因片段。
638 作 物 学 报 第 35卷

水杨酸是早期的信号诱导因素, 它可以起着类
似第 2 信使的作用 , 参与植物的系统获得性反应
(systemic acquired resistance, SAR) [12]。有研究报道,
外源 H2O2可以抑制微生物的生长, 甚至具有直接杀
菌活性[13-14]。而已克隆的抗病基因绝大部分为组成
型表达, 这是抗病基因的一般特性[15]。本研究显示,
PIC 基因在受到甘蔗黑穗病菌、SA 和 H2O2胁迫后
表现出 3种不同的表达模式 , 即“抑-扬-抑”型(甘蔗
黑穗病菌)、“先扬后抑”型(水杨酸)以及“全程抑制”
型(过氧化氢)。另外, PIC基因在叶片中的表达量最
高, 根中次之, 而茎中最小。因此, PIC 基因的表达
受病原菌和水杨酸处理的诱导, 但受过氧化氢的抑
制, 并为组成型表达, 可能与甘蔗某种抗性相关。假
如 PIC 基因真正在甘蔗某种抗性中发挥作用, 则可
以从以上研究结果推测, 一方面 PIC 基因应对不同
环境胁迫会产生不同响应模式, 即甘蔗品种对不同
的逆境具有不同的抗性机制; 另一方面不同环境因
子, 如黑穗病菌、过氧化氢和水杨酸, 对抗病基因表
达的影响是复杂的。植物在抵御环境胁迫中, 会进
化出不同的抗性反应机制, 如相关基因可上调表达,
或通过抗病基因的不同表达模式, 分阶段、不同程
度地抵抗各种不良环境因子的影响。
迄今为止, 有关甘蔗抗病基因同源序列相关研
究 , 仅见少量报道 [16-20]。本研究中 11条甘蔗 NBS
类抗病基因同源序列的获得, 为进一步通过分子生
物学和遗传学手段对这些抗病基因同源序列进行全
长克隆、功能分析、染色体定位以及它们同已知抗
病基因的连锁关系分析等奠定了基础。
4 结论
从甘蔗基因组 DNA和 cDNA中共分离出 11条
NBS 类抗病基因同源序列 , 编号 PIC 基因的
RGA(EF059974)的表达不仅受黑穗病菌胁迫的影响,
还受水杨酸的诱导和过氧化氢的抑制, 该基因具组
织特异性和组成型表达特性。推测 PIC 基因与甘蔗
某种病害的抗性相关。
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