全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(1): 168173 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31071072)和重庆市重大攻关项目(CSTC, 2010AA1013)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 赵芳明, E-mail:zhaofangming2004@163.com
第一作者联系方式: E-mail: duqing2863@126.com
Received(收稿日期): 2011-05-19; Accepted(接受日期): 2011-09-18; Published online(网络出版日期): 2011-11-07.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20111107.1552.019.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00168
水稻叶尖早衰突变体 lad的形态、生理分析与基因定位
杜 青 方立魁 桑贤春 凌英华 李云峰 杨正林 何光华 赵芳明*
西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市市级重点实验室, 重庆 400716
摘 要: 叶片作为植物的主要光合作用场所, 研究其早衰机制对提高作物的经济产量具有非常重要的意义。本研究
报道了一个来自 EMS诱变优良恢复系缙恢 10号的新水稻叶尖早衰突变体 lad (leaf apex dead), 其叶尖在第 5片叶抽
出前呈正常状态, 当第 5叶完全抽出之后前 5叶的叶尖变黄并最终枯死; 随后的叶子在完全抽出后, 叶尖也逐渐变黄
并枯死。对该突变体的生理生化分析发现, 其叶绿素含量、可溶性蛋白含量明显下降, SOD酶活性异常。其株高、叶
长、粒数等也都显著降低。经遗传分析, 该突变性状受 1 对隐性单基因控制, 利用分子标记将该基因定位于第 11 染
色体 SSR标记 SWU11-19和 SWU11-5之间, 遗传距离为 13 cM, 并且与 SSR标记 SWU11-25和 SWU11-27共分离。
本研究结果为该基因的进一步克隆和功能研究奠定了良好基础。
关键词: 水稻; 叶尖早衰死亡; 基因定位; 表型分析; 生理分析
Analysis of Phenotype and Physiology of Leaf Apex Dead Mutant (lad) in Rice
and Mapping of Mutant Gene
DU Qing, FANG Li-Kui, SANG Xian-Chun, LING Ying-Hua, LI Yun-Feng, YANG Zheng-Lin, HE
Guang-Hua, and ZHAO Fang-Ming*
Rice Research Institute, Southwest University / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety of Genetically Modified Crops, Chongqing
400716, China
Abstract: A new mutant of leaf apex dead, lad, was obtained from the rice (Oryza sativa L.) restorer line Jinhui 10, which was
induced by ethyl methanesulfonate (EMS). The leaf apexes of the mutant appeared normal before the emergence of the 5th leaf.
However, the apexes of all leaves except for the 5th leaf turned yellow and gradually died after the expansion of the 5th leaf.
Thereafter, the apexes of newly expanding leaves all became yellow and dead gradually. The physiological and biochemical
analysis showed that the lad mutant contained lower contents of chlorophyll and soluble protein compared with the wild type, and
the activity of superoxide dismutase (SOD) was abnormal in lad mutant. Besides, the plant height, leaf length, grain number, and
seed setting rate were significantly lower in the mutant than in the wide type. The result of genetic analysis showed that the pre-
mature senescence character was controlled by a single recessive nuclear gene. Using an F2 population derived from Xinong 1A 
lad, the LAD gene was mapped between SSR markers SWU11-19 and SWU11-5 on chromosome 11, and the genetic distance was
13 cM. This gene was cosegregated with markers SWU11-25 and SWU11-27. These results provide a basis for fine mapping and
map-based cloning of LAD gene, and the lad mutant might be used in the mechanism study of leaf premature senescence of rice.
Keywords: Rice; Leaf apex dead; Gene mapping; Phenotypic analysis; Physiologic analysis
叶片衰老是植物叶片发育的最后阶段, 是一种细胞
程序性死亡的过程[1]。叶片衰老过程中的细胞衰退是一个
有序的过程, 首先发生在叶绿体中, 最后阶段是线粒体与
细胞核发生变化[2]。叶片衰老对植物的适应性非常重要,
然而叶片的早衰却会减少植株的寿命并降低植物的经济
产量。影响衰老的因素分为内因和外因, 外因如干旱胁迫,
病虫害等都可以引起植物的早衰 [3]; 内因则由植物本身
基因调控引起。目前对控制植物衰老的基因的研究已有不
少, 在如拟南芥、玉米、大麦等许多植物中已经克隆出与
叶片衰老相关的基因。在拟南芥中已发现了多个调控衰老
的基因, 其中 ATAPG[4]、ATAPG9[5]、HYS1[6]、OLD1[7]为
加速叶片衰老的基因, OIN3[8]、ORE1[9]、ORE4[10]、ORE9[11]
第 1期 杜 青等: 水稻叶尖早衰突变体 lad的形态、生理分析与基因定位 169


可以延迟叶片的衰老。但在水稻中, 对叶片早衰相关基因
研究的报道还比较少。现已报道的有关水稻叶片早衰的基
因有 4个[12-15]。其中 3个由单隐性基因控制, 一个由显性
基因控制。水稻作为世界近一半人口的粮食作物, 其产量
与品质备受关注。有研究表明叶片推迟 1 d衰老, 可以使
水稻增产 1%左右[16]。对叶片衰老进行有目的地调控, 可
以提高农作物的产量。因此, 发现水稻叶片早衰突变体与
探明作物叶片衰老的分子生物学机制 , 探讨控制作物叶
片衰老的技术与方法 , 可为人类粮食生产带来巨大的经
济与社会效益。
本实验室在 EMS 诱变缙恢 10 号的突变体库中发现
了 1 个水稻叶尖早衰突变体, 暂时命名为 lad (leaf apex
dead), 其表型不同于以前报道的衰老突变体 , 该突变体
的形态和生理分析及基因定位对进一步克隆该基因有重
要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
表型分析及生理分析所用材料为遗传稳定的水稻叶
片早衰突变体 lad及对照缙恢 10号, lad突变体由优良恢
复系缙恢 10号 EMS诱变产生。
1.2 叶绿素含量的测定
抽穗期分别取 10株野生型和突变体的叶片测定光合
色素含量。为了测定叶片间叶绿素含量的变化, 分别取剑
叶、倒二叶、倒三叶, 取样时间为早晨 8:30~9:00。测定
方法参考文献[17]和 [18]。
1.3 可溶性蛋白含量、SOD酶、POD酶活性测定
抽穗期分别取 10 株野生型和突变体的叶片, 测定可
溶性蛋白含量、SOD活性及 POD活性分别采用南京建成
科技有限公司的考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(A045-2), 超
氧歧化酶测试盒(A001)和植物中过氧化物酶测定试剂盒
(A084-2), 测定方法见试剂盒实验说明书。测定部位为抽
穗期的野生型和突变体的剑叶、倒二叶、倒三叶, 每个指
标分别设 3次重复。
1.4 农艺性状分析
在灌浆期, 田间测定 10株突变体和野生型的剑叶长、
倒二叶长和倒三叶长; 在成熟后, 分别取 10 株突变体和
野生型测定株高、一次枝梗数、总粒数、实粒数、千粒重,
并计算结实率, 用 Microsoft Excel进行各性状 t测验。
1.5 遗传分析
2009 年在重庆以西农 1A 和日本晴为母本, lad 为父
本杂交分别构建 F1群体, 2009年秋季在海南种植 F1, 并收
获 F2。2010年在重庆种植 F2群体。
1.6 DNA的提取
提取亲本和基因池 DNA采用 CTAB法[19], 提取用于
连锁分析的 F2单株 DNA采用碱煮法[20]。
1.7 SSR分子标记分析
SSR 引物序列参照 http://www.gramene.org/microsat,
由上海生工生物工程有限公司合成, PCR反应体系 25 μL
包括: 10×PCR缓冲液 2.5 μL, 25 mmol L1 MgCl2 1.3 μL,
2.5 mmol L1 dNTPs 1.0 μL, ddH2O 16.0 μL, 10 μmol L1
引物 2.0 μL, 模板 DNA 2.0 μL, 5 U μL1 Taq DNA聚合酶
0.2 μL。扩增反应程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s,
56℃退火 30 s, 72℃复性 1 min, 35个循环; 最后 72℃延伸
10 min。PCR产物经 10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 快
速银染后观察[21]。
1.8 遗传图谱构建
选取西农 1A ×lad构建的 F2群体隐性单株为作图群
体。将具有 lad 带型的单株记为 A, 具有西农 1A 带型的
单株记为 B, 具有双亲带型的单株记为 H, 用 Mapmak-
er3.0 分析数据和作图, 用 Kosambi 函数将重组率转化为
遗传距离(cM)。
2 结果与分析
2.1 早衰突变体 lad形态分析
突变体 lad 植株在五叶期前与对照缙恢 10 号的叶片
形态完全相同。当第 5 叶完全抽出后, 早衰表型出现, 并
持续到成熟。突变体 lad除新抽叶保持正常绿色外, 其余
叶片的叶尖都逐渐变黄, 随后扩展到叶片的 2/3, 最后叶
片尖端约 1/4枯死(图 1)。此外, 突变体 lad的株高、实粒
数、总粒数和结实率极显著低于野生型缙恢 10 号, 一次枝
梗数、倒二叶长和倒三叶长显著小于对照, 而千粒重和剑
叶长与对照没有显著差异(表 1)。
2.2 生理生化分析
伴随着衰老的一系列重要生理生化反应就是 SOD 和
POD 酶活性、可溶性蛋白含量、叶绿素含量等的变化。本
研究分别测定了野生型和早衰突变体 lad的剑叶、倒二叶、
倒三叶的 SOD 酶和 POD 酶活性。SOD 作为一种抵抗衰老
的酶, 在 lad 突变体剑叶和倒二叶中与野生型相比显著提高
(图 2-A), 这说明 SOD酶抵御衰老从新叶开始。POD酶活性
也表现出与 SOD相同的规律, lad突变体剑叶和倒二叶的酶
活性显著高于野生型的酶活性, 在倒三叶中提高的水平不
显著, 说明在抵御衰老过程中, 二者具有协同作用(图 2-B)。
突变体剑叶中可溶性蛋白的含量与野生型相比有所下降,
但没有显著差异, 而倒二叶和倒三叶中的含量显著低于野
生型, 说明可溶性蛋白的降解从老叶开始(图 2-C)。lad突变
体的剑叶、倒二叶和倒三叶中的叶绿素 a、叶绿素 a+b、类
胡萝卜素含量均显著或极显著下降; lad 突变体的剑叶和倒
三叶的叶绿素 b的含量也显著下降, 但倒二叶的下降程度不
显著; lad 突变体的倒二叶和倒三叶中的类胡萝卜素含量显
著下降, 剑叶没有显著差异(图 2-D)。
2.3 遗传分析
以日本晴为母本, lad 为父本, F1所有的单株叶片均表
现正常, 表明突变性状受隐性基因控制。F2代群体中出现明
显的分离, 正常单株 257：早衰突变株 73符合 3：1单基因
分离(χ2=1.31 < χ20.05=3.84); 以西农 1A为母本, lad为父本,
配制杂交组合, F1所有的单株叶片均表现正常, F2代群体表
现 3：1单基因分离(χ2=1.08 < χ20.05=3.84)。这表明该突变体
受 1对单隐性核基因控制。
170 作 物 学 报 第 38卷



图 1 lad突变体与野生型的表型对比
Fig. 1 Phenotype of lad mutant and its original parent Jinhui 10
A: 抽穗前期野生型与突变体植株; B: 野生型植株叶片与突变体叶片; C: 野生型植株叶尖与突变体叶尖。
A: The earing prophase plant of wild type and mutant; B: The leaves of wild type and mutant; C: The leaf apexes of wild type and mutant.

表 1 早衰突变体 lad与对照缙恢 10号的重要农艺性状
Table 1 Main agronomic traits of the lad mutant and the control Jinhui 10
材料
Material
株高
Plant height
(cm)
一次枝梗数
Primary
branch
实粒数
No. of
Filled grains
per panicle
总粒数
No. of
grains
per panicle
结实率
Seed setting
rate (%)
千粒重
1000-grain
weight (g)
剑叶长
Length of
flag leaf (cm)
倒二叶长
Length of the
second leaf
from top (cm)
倒三叶长
Length of the
third leaf
from top (cm)
lad 71.42±4.43** 7.67±0.52* 25.17±7.03** 74.33±4.63** 33.86±9.34** 26.50±0.10 35.77±4.87 44.32±6.47* 49.80±2.05*
Jinhui 10 106.00±2.45 10.33±2.81 139.40±7.82 171.60±5.94 81.26±4.28 26.70±0.34 36.00±4.03 54.47±6.14 56.27±5.59
*和**分别表示在 0.05和 0.01显著水平。
* and ** indicate significance at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

2.4 基因定位
选用西农 1A×lad杂交的 F2群体作为定位群体,共获得
93 个突变单株用于基因定位。在 F2 群体中分别选取 10
株正常株和 10 株早衰突变株构建正常基因池和突变基因
池。选用 400对均匀分布在水稻 12条染色体上的 SSR标
记对西农 1A 和 lad 进行多态性分析, 再用表现多态性的
SSR 标记对正常株基因池和突变株基因池进行多态性分
析, 发现位于第 11 染色体上的标记 RM3428 和 RM1341
在亲本和基因池间均存在差异。利用 RM1341和 RM3428
对 F2 群体的 93株叶尖早衰植株进行基因连锁分析, 结果
表明 RM1341和 RM3428均与目标基因连锁, 遗传距离分
别为 13.8 cM和 25.0 cM, 且位于早衰基因 LAD的同一侧。
然后在 RM1341的另一侧设计 SSR引物(表 2), 将 LAD基
因进一步定位于 SWU11-19 和 SWU11-5 标记之间, 遗传
距离分别为 4.2 cM和 8.8 cM (图 3)。进一步在 SWU11-19
和 SWU11-5间又设计了 8个 SSR新标记(表 2), 其中 2个标
记 SWU11-25和 SWU11-27在亲本间具有多态性, 利用这 2
个标记对 F2 群体进行基因连锁分析, 结果表明 SWU11-25
和 SWU11-27与早衰基因 LAD共分离(表 2)。
3 讨论
衰老是植物生长发育的最后一个阶段, 环境因素与基
因调控都可能引起植物的早衰, 而早衰的直接影响是减少
植物的经济产量。因此获得更多的有关调控植物早衰的信息
可以预防作物的早衰从而提高作物的经济产量。
叶片早衰体现着一系列生理生化的变化, 最后反应在表
型上。叶绿素作为叶绿体的主要组成部分之一, 在植物的光
合作用中具有关键作用, 相对叶绿素含量也与光合作用成
正相关的关系[22]。而且, 在衰老的植物中, 蛋白质会被降解
并运输到植物的其他部位[6]。因而, 水稻叶绿素和蛋白质含
量下降可作为水稻叶片衰老的主要指标[23]。此外, SOD酶及
POD 酶作为抵抗衰老的酶在衰老出现时其含量和活性会有
所变化, 变化的趋势在不同时期有所不同。本突变体中, 剑
叶、倒二叶和倒三叶的叶绿素 a、叶绿素 a+b、类胡萝卜素
含量均显著或极显著下降, 剑叶和倒三叶的叶绿素 b含量也
显著下降, 但倒二叶的叶绿素 b下降程度不显著。这说明水
稻衰老时, 叶绿素含量下降，而且叶绿素 a下降得比叶绿素
b快, 这一结论与 Biswas等[24]的结果一致; 剑叶和倒二叶中
的 SOD酶和 POD酶与野生型相比显著提高, 在倒三叶中
第 1期 杜 青等: 水稻叶尖早衰突变体 lad的形态、生理分析与基因定位 171




图 2 lad突变体和野生型生理参数分析
Fig. 2 Analyses of the physiological traits in lad mutant and wild type of rice
A: lad与缙恢 10号的叶片 SOD酶活性的比较; B: lad 与缙恢 10号叶片 POD酶活性比较; C: lad与缙恢 10号叶片可溶性蛋白含量比较;
D: 光合色素在 lad与缙恢 10号叶片中的比较(Chl a：叶绿素 a; Chl b：叶绿素 b; Chl a+b：叶绿素 a+b总量)。小写和大写字母分别表示在 0.05
和 0.01显著水平。
A: The SOD activity of mutant lad and wild type Jinhui 10; B: The POD activity of mutant lad and wild type Jinhui 10; C: The content of solu-
ble protein during the mutant and the wild type; D: Photosynthetic pigments contents of mutant and wild type (Chl a is chlorophyll A; Chl b is chlo-
rophyll B; Chl a+b is content of chlorophyll A and chlorophyll B). Small letters (a, b) and capital letter (A, B) indicate significance level at 0.05 and
0.01, respectively.

的活性水平没有显著差异, 说明 SOD酶和 POD酶是衰老
的重要信号,抵御衰老从新叶开始; 倒一叶中可溶性蛋白
的含量与野生型没有显著差异 , 在倒二叶和倒三叶中可
溶性蛋白的含量显著低于野生型 , 说明可溶性蛋白的降
解从老叶开始。综上所述, 在衰老过程中, 叶绿素含量、
SOD、POD及可溶性蛋白都会呈现不同的变化规律, 是叶
片衰老的重要特征。
环境因素如温度、干旱、营养不足、创伤、病菌侵
染等都能引起植物的早衰。这方面已有不少报道。在拟南
芥、大麦、芸薹属植物、玉米和大豆中已鉴定出上百个与
衰老有关的基因 , 并且根据它们在衰老时的表达方式可
分为衰老上调基因和衰老下调基因。大多数与同化作用相
关的基因在衰老过程中被抑制, 而其他一些与水杨酸、茉
莉酸等激素相关的衰老关联基因(SAGs)在植物衰老过程
呈现上调表达[25]。在拟南芥中, 已报道了许多与叶片衰老
相关的基因, 它们对植物激素的合成产生影响, 从而促进
或推迟植物叶片衰老; 另外预测一些衰老相关基因与转
录因子的编码相关, 如 WRKY6[26]和 WRKY53[27]。在水稻
中也有一些衰老相关基因的克隆及初步功能分析 , 这些
基因有的与延迟衰老相关, 也有的与提前衰老有联系, 如
水稻常绿基因 SGR[28]参与烯烃活性调节、叶绿素的降解
和色素蛋白复合体的退化; Lee等[29]发现的 14个与衰老关
联的基因(Osl2、Osh6、Osl20等)中有 11个与自然衰老和
黑暗诱导衰老相关。
目前 , 关于水稻叶片早衰基因的报道还较少 , 主要
有定位于第 2染色体的 PSL1[12]、第 7染色的 PSE(T) [13]、
第 8染色体的 PSL2[14]和第 7染色体的 PSL3 [15]。本研究
报道的新型早衰突变体 lad, 初步将突变基因定位于第 11
染色体, 其表型与前者有明显的区别, psl1 显著的形态特
征是自苗期开始抽出心叶后 , 抽出的叶片就开始变黄衰
老; pse(t)叶片抽穗期首先在老叶上出现褐色斑点, 接着
整张叶片黄化衰老 , 灌浆期叶鞘与上层叶片也迅速黄化
衰老; psl2 叶片在抽穗前倒四叶开始衰老, 抽穗时倒三叶
衰老, 穗完全抽出后, 倒二叶开始变黄衰老, 到灌浆期完
成后剑叶完全衰老死亡; 而 psl3则从第 6叶开始表现衰老,
叶片从上部到基部衰老程度逐渐减轻 , 叶下部和叶鞘则
基本保持绿色, 叶尖呈现黄化现象; 而本研究发现的 lad 主
要表型为在第 5叶完全抽出前植株正常, 第 5叶完全抽出
后直到成熟, 早衰表型出现, 且当叶片开始衰老的时候叶
尖先出现黄色, 然后叶尖逐渐枯死。因此, lad是一个新的
叶尖早衰突变体。对 lad基因的进一步精细定位、克隆与
功能分析对揭示叶片衰老的分子机制有积极的作用。
172 作 物 学 报 第 38卷

表 2 LAD连锁的 SSR引物序列
Table 2 Sequence of SSR markers interlocked with LAD
标记
Marker
正向引物
Forward sequence (5–3)
反向引物
Reverse sequence (5–3)
SWU11-5 CATTTGATTAAAGGCAAGACAAGAAC GGTTCGTTTCGCTTCCCTC
SWU11-19 GGGAAGGAGATGTGCGGTG CCTCATAATCTACCCGCAAAGG
SWU11-25 CTTCTGTAGTCGTACAGCACATTC AGTGGCCTGCTATGTATGCA
SWU11-27 AAGAGCGTTTGTGGGAGTTTAAT GCCTCACCTGATGTGTCTATTC



图 3 早衰基因 LAD的遗传图谱
Fig. 3 Genetic mapping of the gene LAD controlling
premature leaf senescence

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科学出版社生物分社新书推介
《10000个科学难题——农业科学卷》
“十一五”国家重点图书出版规划项目:10000个科学难题
“10000 个科学难题”编委会 著
书号: 978-7-03-032166-4
定价: 260 元
本书是教育部、科学技术部、中国科学院和国家自然科学基金委员会
联合组织开展的“10000 个科学难题”征集活动的重要成果, 书中的难题均
由国内外知名的农业科学专家撰写。书中收集了有关农业科学很多分支学
科及农业科学的应用等方面的大量问题, 以及当今一些重要的农业科学问
题。本书可供高等院校和科研单位农业科学领域的研究生、科研人员阅读
参考, 也可供对农业科学感兴趣的其他读者阅读。有兴趣的读者可以在此
基础上就其中的某一问题进行深入探索和研究, 研究生也可以在导师的指
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