全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(8): 1347−1353 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中央高校基本科研业务费专项(XDJK2009B019)和国家自然科学基金项目(31071072)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 何光华, E-mail: hegh@swu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: xff806954@163.com
Received(收稿日期): 2012-01-05; Accepted(接受日期): 2012-04-20; Published online(网络出版日期): 2012-06-04.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120604.1009.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01347
水稻早衰突变体 esl2的遗传分析及基因定位
徐芳芳 桑贤春 任德勇 唐彦强 胡宏伟 杨正林 赵芳明 何光华*
西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市重点实验室 / 南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400716
摘 要: 利用 EMS诱变水稻籼型恢复系缙恢 10号, 从其后代中鉴定出一个早衰突变体 esl2, 苗期正常, 孕穗期开始
叶尖和叶缘黄化衰老。与野生型相比, 孕穗期和抽穗期光合色素含量均显著下降, 抽穗期倒一叶的超氧化酶歧化酶
(SOD)活性、可溶性蛋白(SP)含量降低, 活性氧(ROS)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)和脯氨
酸(PRO)含量或活性增加。超微结构观察表明, esl2 衰老部位的细胞多中空且形状不规则, 伴随细胞裂解、细胞质溶
解等特征; 同时, 叶绿体结构异常, 叶绿体膜溶解、基粒模糊, 基质片层疏松, 类囊体发育异常。遗传分析表明, 该
突变体受 1 对隐性核基因调控。利用 1 005 株西农 1A/esl2 的 F2隐性定位群体, 最终将 Esl2 定位在第 4 染色体 SSR
标记 RM17122和 swu4-13之间, 物理距离约 244 kb, 这为 Esl2基因的克隆和功能研究奠定了基础。
关键词: 水稻(Oryza sativa L.); 早衰; 基因定位
Genetic Analysis and Gene Mapping of Early Senescence Leaf Mutant esl2 in
Rice
XU Fang-Fang, SANG Xian-Chun, REN De-Yong, TANG Yan-Qiang, HU Hong-Wei, YANG Zheng-Lin,
ZHAO Fang-Ming, and HE Guang-Hua*
Rice Research Institute, Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Engineering Research Center
of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Southwest University, Chongqing 400716, China
Abstract: An early senescence leaf mutant temporarily designated as esl2 was discovered in the progeny of an excellent indica
restorer line Jinhui 10 with seeds treated by ethyl methane sulfonate (EMS). The mutant kept normal at seedling stage and showed
etiolated senescence leaves from booting sage to the maturity, especially at tip and margin of leaf blade. By contrast with the wild
type, photosynthetic pigment contents decreased significantly at both booting stage and heading stage, superoxide dismutase
(SOD) activity and soluble protein contents decreased significantly, while the activities of peroxidase (POD) and catalase (CAT),
and contents of reactive oxygen species (ROS), malondialdehyde (MDA) and praline increased significantly at heading stage in
the esl2 mutant. The assay of Transmission Electronic Microscope (TEM) observation was performed and demonstrated that the
most cells appeared irregular and void with endolysis and disrupted organelles at senescence part of the mutational leaf, concomi-
tantly, abnormal chloroplast appeared and showed dissolved membrane, indistinct grana, disorganized lamellar structure and in-
correct thylakoid. Genetic analysis suggested that the mutational trait was controlled by one nuclear recessive gene. Xinong 1A
was crossed with the esl2 and 1 005 mutational F2 single plants were used for gene mapping. Finally, Esl2 locus was mapped be-
tween SSR marker RM17122 and swu4-13 on the chromosome 4 with physical distance of 244 kb. This result provides a founda-
tion of Esl2 gene cloning by map-based strategy as well as its functional analysis.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.); Early senescence; Gene mapping
叶片是植物进行光合作用的重要器官, 其衰老
是一种受遗传和外界因子(如日照、病害、遮阴、高
温、干旱和水涝等逆境)影响的高度程序化过程, 是
植物生命科学领域研究的核心问题之一, 受到广泛
关注[1]。叶片早衰可导致光合能力降低, 引起灌浆不
足、结实率下降、千粒重变小等现象。水稻一旦早
衰, 将严重影响产量和品质, 如正常成熟期功能叶
寿命延长 1 d, 理论上可使水稻增产 2%, 实际增产
1348 作 物 学 报 第 38卷

1%左右[2]。从分子和遗传水平研究衰老机制, 克隆
调控基因并对早衰现象进行改良 , 是提高水稻单
产、改善其品质的有效途径之一。
叶片衰老涉及基因类型多、参与细胞代谢途径
也多 , 遗传机制较为复杂 , 在不同诱导因素下 , 调
控基因类型和数量通常也会变化[3]。关于叶片衰老
机理研究, 在拟南芥等双子叶模式植物上较多, 且
主要集中在逆境、暗处理等胁迫环境下叶片的诱发
衰老方面, 在水稻等单子叶植物中相对较少。目前,
有关水稻自然衰老研究, 在成熟期衰老和延迟衰老
方面已取得一定进展, 但对抽穗前早衰的分子机制
还不清楚。
在水稻中已经鉴定了大量的 SAGs (senescence-
associated genes), 但克隆的衰老调控基因较少, 主
要有 Os12[4]、Osh69[5]、Sgr(t)[6]、SGR[7]、Sgr[8]、
NYC1[9]、OsDos[10]、YGL1[11]、SPL28[12]和 NOE1[13],
定位的早衰基因主要有 Psl1[14]、Pse(t)[15]、Sms1[16]、
Psl3[17]和 Es-t[18]等。本研究利用 EMS诱变籼型恢复
系缙恢 10 号, 获得 1 个隐性早衰突变体 esl2 (early
senescence leaf 2, esl2), 孕穗期开始叶尖和叶缘部逐
渐黄化衰老, 定位于第4染色体上, 与目前报道的衰
老基因均不等位, 为一个新的早衰突变体。对其进
行了表型鉴定、理化分析和基因定位等相关研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
EMS诱变籼型恢复系缙恢 10号, 从后代中发现
一个早衰突变体 esl2, 连续多代种植, 突变性状表
型稳定遗传。西农 1A 是一个叶片正常的早籼不育
系。利用西农 1A/esl2 的 F2分离群体进行遗传分析
和基因定位。
1.2 农艺性状
成熟后分别选择缙恢 10号和 esl2小区中间 10株,
考查株高、有效穗、每穗实粒数、千粒重、结实率
等主要农艺性状。
1.3 生理指标测定
孕穗期和抽穗期, 上午 9:00, 分别取缙恢 10 号
(WT)和 esl2 的倒一、倒二、倒三全展叶 , 参考
Wellburn[19]的方法测定光合色素含量。同时, 选取抽
穗期WT和 esl2的倒一全展叶, 参照文献[20]用氮蓝
四唑(NBT)光化还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)
活性, 以抑制 NBT 光化还原的 50%为 1 个酶活力
单位(U); 愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性 ,
以 OD470 1 min增加 1为 1个酶活力单位(U); KMnO4
滴定法测定过氧化氢酶(CAT)活性 ; 硫代巴比妥酸
(TBA)法测定丙二醛 (MDA)含量 ; 考马斯亮蓝法
测定可溶性蛋白含量 (SP); 磺基水杨酸法测定游
离脯氨酸 (PRO)含量。羟胺法测定活性氧自由基
(ROS)含量 [21]。
1.4 细胞结构观察
参照何瑞锋等[22]的方法用电镜观察突变体和野
生型叶片细胞结构。以戊二醛和锇酸双重固定后 ,
利用不同梯度的乙醇逐级脱水, 再置换和包埋, 超
薄切片后 , 以醋酸双氧铀和柠檬酸铅液双重染色 ,
H600型透射电镜观察并照相。
1.5 DNA的提取
参照 Michelmore等[23]的 BSA法筛选连锁标记,
从 F2植株中分别选取 10株正常和 10株突变株剪取
等量叶片, 采用改良的 CTAB 法提取 DNA[24], 构建
正常基因池和突变基因池。碱煮法提取 F2群体中的
早衰单株 DNA用于连锁分析[25]。
1.6 SSR分析
参照 http://www.gramene.org/的 SSR 引物序
列。PCR总体积 12.6 μL, 包括 1.25 μL的 10×PCR
buffer, 0.75 μL的 25 mmol L−1 MgC12, 0.5 μL的
2.5 mmol L−1 dNTPs, 8.0 μL的 ddH2O, 1.0 μL的 10
μmol L−1引物, 1.0 μL的模板 DNA和 0.1 μL的 5 U
μL−1 Taq DNA聚合酶。PCR程序为 94℃预变性 3
min; 94 30 s℃ 、56 30 s℃ 、72 1 min, 35℃ 个循环;
72℃延伸 10 min。PCR产物经 10％的非变性聚丙
烯酰胺凝胶上电泳后快速银染和观察[26]。
1.7 遗传图谱的构建
选取西农1A/esl2 F2群体中的早衰单株为作图群
体。将具有西农 1A带型的单株记为 A, 具有 esl2带
型的单株记为 B, 具有 F1 带型的单株记为 H, 用
Mapmaker3.0 进行数据分析和作图[27], 用 Kosambi
函数[28]将重组率转化为遗传距离。
2 结果与分析
2.1 esl2的表型鉴定
esl2 主要表现为植株从孕穗期开始叶尖和叶缘
逐渐黄化衰老, 而叶基部保持绿色并不衰老, 衰老
性状一直持续到成熟(图 1)。与野生型相比, esl2 的
株高、有效穗、每穗粒数、每穗实粒数、千粒重、
结实率、籽粒的长度和宽度等农艺性状均显著降低
(表 1), 特别是每穗粒数和每穗实粒数降低最明显 ,
分别仅为对照的 39.5%和 27.9%。
第 8期 徐芳芳等: 水稻早衰突变体 esl2的遗传分析及基因定位 1349


表 1 野生型(WT)和 esl2农艺性状分析
Table 1 Agronomic traits of the wild type (WT) and the esl2 mutant
材料
Material
株高
Plant height
(cm)
有效穗
Effective
panicle
每穗粒数
Grain number
per panicle
每穗实粒数
Filled grain number
per panicle
千粒重
1000-grain
weight (g)
结实率
Seed setting
rate (%)
籽粒长
Seed length
(cm)
籽粒宽
Seed width
(cm)
WT 115.9 18.2 157 140 26.8 89.2 0.98 0.27
esl2 89.1** 13.7** 62 ** 39** 23.2 ** 62.9** 0.92** 0.24**
*在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上显著差异。* Significantly different at P<0.05; ** Significantly different at P<0.01.



图 1 孕穗期野生型(WT)和突变体 esl2的植株形态
Fig. 1 Plant morphology of the wild type (WT) and the esl2
mutant at the booting stage
A: 野生型(WT)和突变体 esl2的植株; B: 野生型(WT)和突变体
esl2的倒一叶。
A: Plants of the wild type (WT) and the esl2 mutant; B: The first
fully expanded leaf of the wild type and the esl2 mutant.
2.2 esl2生理特性
孕穗期 esl2 倒一叶的叶绿素 a (Chl a)含量为
0.951 mg g−1 FW, 是野生型的 26.3%; 叶绿素 b (Chl b)
含量 0.259 mg g−1 FW, 是野生型的 26.5%; 类胡萝
卜素(Car)含量 0.390 mg g−1 FW, 是野生型的 34.2%,
均极显著下降。倒二叶和倒三叶的光合色素含量下
降幅度略小于倒一叶, 且呈现一定的差异, 但与野
生型相比, 均达到了极显著水平。抽穗期 esl2 的光
合色素含量也极显著下降, 变化趋势与孕穗期基本
一致。与野生型相比, 倒一叶、倒二叶和倒三叶的
叶绿素 a (Chl a)含量分别下降了 41.1%、29.4%和
42.9%, 叶绿素 b (Chl b)含量分别下降了 56.1%、
41.4%和 55.6%, 类胡萝卜素(Car)含量分别下降了
26.0%、15.6%和 30.2% (图 2)。
SOD、POD和 CAT是保护酶系统中重要的抗氧
化物酶, 可清除植物体内过多的氧自由基和其他过



图 2 孕穗期和抽穗期野生型(WT)和突变体 esl2的光合色素含量比较
Fig. 2 Comparison of photosynthetic pigment contents between the wild type and the esl2 mutant at the booting and heading stages
respectively
a~c: 孕穗期野生型(WT)和突变体 esl2倒一、倒二、倒三叶的光合色素含量; d~f: 抽穗期野生型(WT)和突变体 esl2倒一、倒二、倒三
叶的光合色素含量。
a–c: Photosynthetic pigment contents of the first, second and third leaf respectively in the wild type and the esl2 mutant at the booting stage;
d–f: Photosynthetic pigment contents of the first, second and third leaf respectively in the wild type and the esl2 mutant at the heading stage.
1350 作 物 学 报 第 38卷

氧化物, 使自由基维持在一个基本水平, 从而防止
自由基的毒害, 增强抗氧化能力。叶片衰老过程中,
SOD、POD 活性降低, 引起活性氧含量增加, 使活
性氧不能被及时清除, 导致膜质过氧化, 产生大量
的 MDA, 而 MDA 能与蛋白质结合引起蛋白质分子
间交联, 使整个细胞的结构和功能受到伤害, 是导
致叶片衰老加速的重要原因。蛋白质降解是叶片衰
老的基本特征 , 蛋白质水解酶的数量和活性增加 ,
各种蛋白质水解反应加强, 致使 SP含量下降。
esl2突变体的 ROS含量(8.544 μg g−1 FW)与野
生型(6.044 μg g−1 FW)相比极显著增加, 从而产生了
较多的超氧阴离子自由基( O−2 )。突变体 SOD 活性
(159.365 U g−1 FW)仅为野生型(247.712 U g−1 FW)的
64.3%, SOD 清除 ROS 产生的自由基的能力下降。
POD、CAT 比野生型有所提高, 但差异未达到显著
水平。esl2的 MDA含量相比野生型极显著增加, 说
明膜脂过氧化加重影响细胞膜的正常功能; PRO 大
量上升, 加大渗透调节物质来保护细胞膜的完整性,
避免细胞调控的丧失; 同时 esl2的 SP含量比野生型
有所降低, 说明在叶片衰老的过程中伴随 SP 的降
解。如图 3 所示。上述生理指标的结果与 esl2 外观
表现的症状完全吻合。
2.3 细胞学观察
为进一步了解 esl2 细胞结构, 对抽穗期倒一叶
叶尖(图 4-A)、叶基部(图 4-F)细胞结构进行了电镜
察。结果发现, 野生型叶尖部(图 4-B, D)和叶基部(图
4-G, I)在细胞和叶绿体结构上均无明显差异, 细胞
呈圆形或椭圆形, 细胞质分布均匀, 细胞核多居中;
叶绿体内有正常的基粒、片层和淀粉颗粒。而 esl2
则发生了显著变化, 叶尖部(图 4-C, E)细胞形状不规
则 , 多数已经裂解 , 细胞质溶解 , 整个细胞大部分
中空 , 死亡特征明显 , 叶绿体结构异常 , 叶绿体膜
溶解, 基粒模糊, 基质片层疏松, 类囊体发育异常;
esl2叶基部(图 4-H, J)细胞形状不规则, 叶绿体基粒
模糊、片层疏松。esl2 叶尖部比叶基部的细胞降解
更彻底 , 几乎中空 , 叶绿体数目剧减 , 基粒更模



图 3 抽穗期野生型(WT)和突变体 esl2的生理学特性
Fig. 3 Physiological characters of the wild type and the esl2 mutant at the heading stage
a: 活性氧自由基(ROS)(μg g−1 FW); b: 超氧化物歧化酶(SOD)(U g−1 FW); c: 过氧化物酶(POD)(OD470 min−1 g−1 FW); d: 过氧化氢酶
(CAT)(µmol H2O2 g−1 min−1); e: 丙二醛(MDA)(μmol g−1); f: 可溶性蛋白(SP)(μg mL−1); g: 脯氨酸(PRO)(μg g−1)。*在 0.05水平上差异显
著; **在 0.01水平上差异显著。
a: reactive oxygen species ( O−2 ) (μg g−1 FW); b: superoxide dismutase (SOD) (U g−1 FW); c: peroxidase (POD) (OD470 min−1 g−1 FW);
d: catalase (CAT) (µmol H2O2 g−1 min−1); e: malondialdehyde (MDA) (μmol g−1); f: soluble protein (SP) (μg mL−1); g: proline (PRO)
(μg g−1). * Significantly different at P<0.05; ** Significantly different at P<0.01.
第 8期 徐芳芳等: 水稻早衰突变体 esl2的遗传分析及基因定位 1351




图 4 野生型(WT)和突变体 esl2叶片的细胞结构
Fig. 4 Leaf cell structure of the wild type and the esl2 mutant
A, F: 抽穗期野生型(WT)和突变体 esl2的倒一叶叶尖部和叶基部; B, C: 野生型(WT)和突变体 esl2的叶尖部细胞结构; D, E: 野生型
(WT)和突变体 esl2的叶尖部叶绿体结构; G, H: 野生型(WT)和突变体 esl2的叶基部细胞结构; I, J: 野生型(WT)和突变体 esl2的叶基
部叶绿体结构。
A, F: the tip and lower part of the first fully expanded leaf phenotypes in the wild type and the esl2 mutant at the heading stage; B, C: the cell
structure of the tip parts of in the wild type and the esl2 mutant; D, E: the chloroplast structure of the tip parts of in the wild type and the esl2
mutant; G, H: the cell structure of the lower parts of in the wild type and the esl2 mutant; I, J: the chloroplast structure of the lower parts of in
the wild type and the esl2 mutant.

糊、片层更疏松。
2.4 esl2的遗传分析
西农 1A/esl2杂交组合 F1植株叶片表现正常, F2
出现分离, 从 4 221单株中获得突变体 1 005株, 经
χ2 测验, 正常株∶衰株符合 3∶1 分离比[χ2=3.18<
3.84 (χ2(0.05,1))], 表明 esl2受 1对隐性核基因控制。
2.5 esl2基因定位
在均匀分布于水稻 12条染色体上的 480对 SSR
标记中, 有 98对在西农 1A和 esl2之间显示多态性。
经进一步分析, RM17111和 RM17154在正常基因池
和突变基因池之间表现差异, 推测可能与 esl2 位点
连锁。利用 72株 F2突变株将 esl2定位在 RM17111
和 RM17154 之间, 遗传距离分别为 1.2 cM 和 1.3
cM。在标记 RM17111和 RM17154间进一步合成引
物, 其中有 4对在亲本间表现多态性。利用 1 005株
西农 1A/esl2 的 F2定位群体, 最终把 Esl2 基因定位
在RM17122和 swu4-13 (F: 5′-ACGTGCGAAGGATT
GGGATTAGT-3′; R: 3′-CGCAGCAACGTGATGCTTC
C-5′)之间, 包含 3个部分重叠的BAC克隆AL606441、
AL606447和 AL731582, 遗传距离分别为 0.2 cM和
0.2 cM, 物理距离约为 244 kb (图 5)。该区段包含了
45 个注释基因, 其中有 5 个 β-葡萄糖苷酶糖基水解
酶, 3 个受体类蛋白激酶, 1 个 C2H2锌指蛋白, 1 个
WRKY蛋白, 1个苯甲酸磷酸核糖转移酶, 1个 AMP
结合酶等。
3 讨论
叶片衰老是一个高度程序化过程, 遗传机制为
复杂, 通常涉及叶绿素、光合效率、自由基代谢和
蛋白质含量等变化[29-30]。植物衰老最明显的特征是
叶片颜色变黄衰老, 随着叶片的衰老, 叶绿体超微
结构发生明显变化, 蛋白丰度下降[31-33]。本文报道
的 esl2 突变体从孕穗期开始, 叶尖至叶缘逐渐黄化
衰老, 光合色素含量极显著下降。超微结构观察发
现, 黄化部位的细胞多数裂解、大而中空、且伴有
细胞质溶解现象 ; 同时发现 , 叶绿体结构不规则 ,
类囊体发育异常, 片层疏松, 呈现明显的衰老特征。
理化分析表明, 与野生型相比, esl2突变体叶片中的
1352 作 物 学 报 第 38卷



图 5 Esl2基因在第 4染色体上的分子定位
Fig. 5 Molecular mapping of Esl2 on chromosome 4

ROS 含量显著升高, SOD 酶活性显著降低, PRO 和
MDA 含量增加, 而 SP 含量降低, 膜脂过氧化水平
增加可能是导致细胞膜损伤, 从而引起 esl2 衰老的
主要原因。
对于水稻自然早衰 , 目前仅报道了 psl1[14]、
pse(t)[15]、sms1[16]、psl3[17]和 es-t[18]等少数几个突变
体, psl1为苗期早衰, pse(t)为斑点衰老, psl3为显性
早衰, es-t 为铁锈斑点早衰, sms1 为褐色斑点早衰,
调控基因均未被克隆。esl2 与已报道早衰突变体表
型明显不同, 主要表现为苗期正常, 孕穗期开始才
从叶尖和叶缘部逐渐黄化、衰老, 而中下部保持绿
色不衰老。遗传分析和基因定位发现, esl2受单隐性
核基因控制, 位于第 4染色体 SSR标记 RM17122和
swu4-13之间, 物理距离约 244 kb。尚未见该区段内
衰老基因的报道, 进一步表明 esl2 是一个新的早衰
突变体。
随着分子生物学技术的发展, 近年来, 克隆了
几个灌浆后自然衰老和延迟衰老基因。其中, Os12[4]
和 Osh69[5]在衰老时期的叶片中特异表达, 在根和
茎里几乎不表达。Sgr(t)[6]、SGR[7]、Sgr[8]是等位基
因突变, 编码叶绿体转运肽蛋白, NYC1[9]编码叶绿
素 b 还原酶亚基, 直接参与叶绿素 b 还原酶复合体
的形成 , 二者均通过抑制叶绿素降解途径延缓衰
老。OsDOS[10]编码一个 CCCH-type锌指蛋白, 在叶
片衰老和幼穗分化过程中表达下降, 负相调控 JA信
号转导途径延迟水稻叶片衰老。此外, NOE1[13]编码
一个过氧化氢酶, 诱导产生 NO, 引起细胞死亡, 从
而导致水稻早衰。基因信息学分析发现, 在 Esl2 定
位区间, 有 45个注释基因。我们对其中 C2H2锌指蛋
白的编码基因进行了测序, 但在野生型和突变体之
间没有发现序列差异, 表明 esl2 可能受一类新的基
因调控, 这为下一步基因的克隆和水稻早衰机制研
究奠定了基础。
4 结论
esl2 是一个叶片早衰突变体, 光合色素含量显
著下降, ROS、SOD、POD、CAT、MDA、SP、PRO
含量或活性均发生了变化。其早衰部位细胞形状不
规则、多数裂解, 整个细胞大部分中空, 且伴随细胞
质溶解等现象; 叶绿体数目减少 , 质膜溶解 , 基粒
模糊, 基质片层疏松, 类囊体异常。该突变受 1对隐
性核基因控制 , 定位于第 4 染色体 SSR 标记
RM17122和 swu4-13之间约 244 kb的范围内, 这为
下一步基因的克隆和功能研究奠定了基础。
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