全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(9): 1505−1510 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30170567, 30600345, 30770131, 30771210, 31070278)和江苏高校优势学科建设工程项目资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 于恒秀, E-mail: hxyu@yzu.edu.cn, Tel: 0514-87979304, Fax: 0514-87972138
第一作者联系方式: E-mail: zygong@yzu.edu.cn, Tel: 0514-87979304, Fax: 0514-87972138
Received(收稿日期): 2011-01-12; Accepted(接受日期): 2011-05-20; Published online(网络出版日期): 2011-06-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110628.1012.024.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01505
水稻非整倍体无性繁殖过程中的遗传稳定性
龚志云 石国新 刘秀秀 裔传灯 于恒秀*
扬州大学江苏省作物遗传生理重点实验室 / 教育部植物功能基因组学重点实验室, 江苏扬州 225009
摘 要: 无性繁殖是保存非整倍体的一个有效手段。为研究该过程中非整倍体的遗传稳定性, 从水稻第 8 染色体短
臂端三体(2n+·8S)自交后代中筛选出相应的端四体(2n+·8S+·8S), 其田间性状表现为植株矮小, 叶片非常窄且内卷,
结实率差。在多年无性繁殖过程中, 该端四体所添加的其中 1 条·8S 容易丢失使无性系产生性状变异。通过 FISH 分
析发现该无性变异系的原始株中所添加的 2 条·8S 具有以下特点: 其中 1 条·8S 在着丝粒区域检测不到水稻着丝粒的
基本组分 CentO 序列, 但可以检测到水稻着丝粒的另一基本组分 CRR 序列, 该染色体可以稳定遗传; 另外 1 条·8S
在着丝粒区域同时检测不到 CentO和 CRR序列, 该染色体不能稳定遗传。而在最初保存的相应端三体亲本材料的·8S
中, 同时包含 CentO 和 CRR 序列。说明·8S 上的 CentO 和 CRR 在多年的组织培养过程中会随机丢失, 导致含有·8S
的非整倍体在无性繁殖过程中的遗传不稳定性。
关键词: 水稻; 非整倍体; 端着丝粒染色体; CentO; CRR
Genetic Stability of Rice Aneuploid during Its Asexual Propagation
GONG Zhi-Yun, SHI Guo-Xin, LIU Xiu-Xiu, YI Chuan-Deng, and YU Heng-Xiu*
Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province / Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education,
Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
Abstract: Telotetrasome is a kind of aneuploid with two additional identical telocentric chromosomes. To investigate the genetic
stability of rice aneuploid during its asexual propagation, a telotetrasome (2n+·8S+·8S) was selected from the progenies of a rice
telotrisome (2n+·8S), and preserved by asexual reproduction. But one of the extra short arms (·8S) was easy to be lost in the asex-
ual propagation offspring of 2n+·8S+·8S and led to morphological variations. FISH results indicated that one of the two extra ·8S
was short of detectable rice centromeric satellite repeat (CentO) and centromere-specific retrotransposon (CRR) and could not be
transmitted stably. The other extra ·8S contained CRR, but no detectable CentO and could be transmitted steadily. However, the
extra ·8S containes the CentO and CRR sequences simultaneously in the initial telotrisomic line (2n+·8S). These results showed
that CentO and CRR of the extra ·8S may be randomly lost and led inheritance instability in the aneuploid harbouring extra ·8S
during asexual propagation.
Keywords: Rice; Aneuploid; Telocentric chromosome; CentO; CRR
在植物细胞的分裂过程中, 正常染色体的错分
裂会形成端着丝粒染色体, 含有该染色体的非整倍
体可以用于基因定位、染色体(臂)上相关基因的剂
量效应分析[1-2]、细胞分裂过程中染色体行为研究、
以及同属不同染色体之间的分化及不同染色体组分
化的研究[3]。但非整倍体一般不能通过有性繁殖稳
定保存, 而是通过对非整倍体植株的腋芽进行无性
繁殖, 从而在试管中保存非整倍体材料, 是目前植
物非整倍体材料保存的主要方法之一[4-5]。
在无性繁殖过程中, 细胞中染色体通过有丝分
裂进行传递。其基本元件的完整性是染色体正常传
递的关键, 其中着丝粒是真核生物染色体基本元件
1506 作 物 学 报 第 37卷

之一。每条染色体必须拥有功能性着丝粒, 才能保
证染色体在分裂过程中的正常传递, 以维持物种染
色体组成的稳定性, 保证无性繁殖过程中上下代之
间不发生分离与变异。研究表明在不同物种中, 着
丝粒的功能是高度保守的, 但是组成着丝粒的 DNA
序列并没有同源性[6-8]。除发芽酵母的着丝粒由 125
bp左右的特异 DNA序列构成以外[9-11]。大多数生物
的着丝粒均由高度重复的DNA序列构成, 如裂殖酵
母、果蝇、人类、玉米及拟南芥等[12-20]。
在栽培稻中, 着丝粒 DNA 由串联重复序列(cent-
romeric satellite repeat, CentO)和着丝粒特异逆转座
序 列 (centromere-specific retrotransposon of rice,
CRR)组成[21], 其中 CentO 是着丝粒的核心序列, 但
在 12 条非同源染色体上 CentO 的拷贝数有很大差
别。其中, 第 8 染色体着丝粒区域 CentO 序列含量
最少, 但其着丝粒功能正常。另外, 通过与水稻着丝
粒另一重要组分——着丝粒特异组蛋白 CENH3 结
合的荧光免疫反应研究表明, 水稻中 CENH3 含量
在每条染色体的着丝粒区域是十分相近的[22], 说明
不同染色体上功能性着丝粒的 DNA 结合区域是特
定的, 与着丝粒特异DNA序列含量没有必然的联系。
本实验室在多年水稻非整倍体研究过程中, 分
离并获得第 8染色体短臂端四体(T7461)。并对其进
行无性繁殖保存。但该端四体在田间种植过程中出
现性状分离, 细胞学检查表明为其中添加的 1 条端
着丝粒染色体在有丝分裂过程中容易丢失。为了明
确该端着丝粒染色体的丢失是否与其着丝粒区域的
变异有关, 我们对 T7461 进行分子细胞学分析, 以
探明其端着丝粒染色体在无性繁殖过程中不稳定遗
传的细胞学机制。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2004 年田间种植水稻品种中籼 3037 第 8 染色
体的端三体后代, 发现变异株 T7461, 2005—2009年
田间种植 T7461 的无性繁殖后代(试管苗)。为便于
与原品种比较 , 也同时种植了普通中籼 3037作对
照。所有材料均种植于本校水稻试验农场, 常规水
肥管理。
1.2 染色体的制备
取新鲜根尖置 2 mmol L−1的 8-羟基喹啉中, 在
20℃下处理 2 h, 然后用甲醇∶冰醋酸(3 1)∶ 的固定
液固定; 取合适的幼穗用乙醇∶冰醋酸(3 1)∶ 的固
定液固定 ; 将固定后的材料置−20℃冰箱备用。按
Kurata 等[23]的方法进行有丝分裂的染色体制片。按
Wu等[24]的方法进行减数分裂的染色体制片。
1.3 常规镜检
用DAPI染色后在 Leica DMRXA荧光显微镜下
观察制好的玻片, 对于染色体分散好, 形态清晰的
细胞用气冷式数码相机(CCD)摄像。
1.4 荧光原位杂交
所用水稻着丝粒特异探针CentO和CRR均由美
国 Wisconsin-Madison 大学 Jiming Jiang 教授赠予;
端粒 DNA 探针 pAtT4 引自美国康奈尔大学; 第 8
染色体短臂上的特异分子细胞学标记 a0005O22 和
a0070J19 来自美国 Clemson 大学 BAC 库中心。用
digoxigenin-11-dUTP 和 Biotin-16-dUTP 标记探针,
按 Jiang等[25]的方法标记、杂交和检测。
1.5 杂交后检测与图象处理
通过抗地高辛抗体偶联罗丹明偶联物(anti-di-
goxigenin-Rhodamine)或抗生物素抗体偶联 FITC 偶
联物 (anti-biotin-FITC)检测 FISH 信号 , 染色体用
DAPI反染。镜检中获得清晰图像后, 以气冷式数码
相机(CCD)摄像, 并将图像输入计算机中, 以 Leica
QFISH软件调节对比度和亮度。
2 结果与分析
2.1 T7461的获得及分子细胞学鉴定
T7461 是 2004 年从中籼 3037 第 8 染色体短臂
端三体(2n+·8S)[4]自交后代中发现的形态变异株。对
其鉴定发现每个体细胞中有 26条染色体, 比正常中
籼 3037 体细胞染色体多 2 条, 进一步比较发现, 在
每一个细胞的 26条染色体中, 有 2条长度比正常染
色体短(图 1-A 箭头所示)。由于 T7461 来源于第 8
染色体短臂的端三体, 所以初步判断其细胞中多出
的 2 条染色体有可能是由第 8 染色体短臂组成。进
一步选用第 8 染色体短臂的特异分子细胞学标记
a0005O22 进行 FISH 分析。由于 a0005O22 是单拷
贝序列, 为了提高检测的灵敏性和准确性[26], 我们
选择 T7461的粗线期染色体进行 FISH分析, 并且从
同源染色体粗线期配对形成的二价体结构可以确定
2个小染色体是否是同一来源。用 digoxigenin-11-
dUTP标记的 a0005O22与 T7461粗线期染色体进行
原位杂交 , 再以 anti-digoxigenin-Rhodamine 检测 ,
在荧光显微镜下 , digoxigenin-11-dUTP 标记的
a0052116经 anti-digoxigenin-Rhodamine检测之后呈
第 9期 龚志云等: 水稻非整倍体无性繁殖过程中的遗传稳定性 1507


现红色荧光(图 1-B), 为此, 在检测中凡是显示有红
色杂交信号的即为第 8染色体。在 T7461细胞中除
了正常的 1 对已联会形成二价体的第 8 染色体上有
红色杂交信号外, 另外还有 1 个二价体结构上也有
红色的杂交信号(图 1-B中箭头所示), 与正常的同
源染色体联会形成的二价体相比, 这个二价体比较
短, 并且配对非常好, 说明它们的确是细胞中的 2
条小染色体。因此可以确定 T7461中添加的 2条小
染色体的确是来源于第 8 染色体的短臂, 即 T7461
是第 8 染色体短臂的端四体。田间性状表现为植株
矮小、叶片非常窄并卷曲, 结实率极差(图 2-A)。我
们对其进行腋芽培养并进行无性繁殖保存。

图 1 T7461的 FISH分析
Fig. 1 FISH analysis of T7461
A: T7461体细胞前中期染色体, 红色为端粒信号; B: T7461的粗
线期染色体, 红色为 a0005O22信号。
图中染色体都以 DAPI染色, 标尺均为 5 μm。
A: Prometaphase chromosomes of a somatic cell in T7461, the red
color denotes the signal of telomere; B: Pachytene stage chromo-
somes of T7461, the red color denotes the signal of a0005O22.
Chromosomes were counterstained with DAPI in all images. Scale
bars: 5 μm in two images.

2.2 T7461 无性变异系的染色体数目及 CentO
鉴定
2005—2009年正季将 T7461的试管苗移至大田
种植。2005年未出现性状分离, 而 2006—2009年均
产生性状分离, 出现变异株。对 2007年正季种植的
20株 T7461进行性状调查和染色体数目鉴定, 结果
如表 1 和图 2 所示。为了叙述方便, 把 T7461 中未
出现变异性状的植株称为原始株; 出现变异性状的
植株称为变异株。
从表 1 可知 , 在该端四体的无性繁殖后代中
80%植株均表现为最初保存的原始株性状, 但同时
出现了 10%宽窄叶的嵌合株(图 2-B)以及 10%变异
株, 变异株叶片的宽度介于正常株与 T7461 原始株
之间(图 2-C)。原始株染色体数目为 2n=26, 细胞中
除 24 条正常染色体外 , 另外添加 2 条较短的染色
体。为了明确这 2 条短染色体是否是端着丝粒染色
体, 以 Biotin-16-dUTP 标记着丝粒特异 DNA 序列
(CentO), 将标记过的 CentO与变异株体细胞前中期
染色体进行 FISH 分析。经 anti-biotin-FITC 检测杂
交信号呈现绿色荧光。在荧光显微镜下, 可以清楚
观察到绿色信号位于每条染色体的着丝粒区域(图
2-D)。但除 12对正常染色体有绿色杂交信号外 , 原
始株中的 2条短染色体末端均没有 CentO信号(箭头
所示)。以同样方法对变异株进行 FISH 分析, 发现
变异株染色体数目为 2n=25 (图 2-E), 其中 1条为无
CentO信号的短染色体(箭头所示)。嵌合体中的宽叶
株染色体数目为 2n=25, 窄叶株染色体数目为 2n=26,
以 Biotin-16-dUTP标记的 CentO为探针与嵌合体的
宽叶株和窄叶株的有丝分裂前中期细胞分别进行
FISH分析, 发现嵌合体的窄叶株中较正常水稻多出
2 条没有 CentO 的小染色体, 与图 2-D 中所示相似;
而宽叶株仅多出 1 条没有 CentO 的小染色体, 与图
2-E中所示相似。
2.3 T7461中变异株的 CentO和 CRR鉴定
为了进一步明确 T7461 中宽叶的变异株及宽窄
叶嵌合体中的宽叶株是否是原来的第 8 染色体短臂
端四体丢失了 1 条·8S, 从而成为第 8 染色体短臂端
三体材料。利用 digoxigenin-11-dUTP标记第 8染色
体短臂上的特异分子细胞学标记 B A C 克隆
a0005O22作为探针, 对 T7461变异株的粗线期染色
体进行 FISH 分析, 经 anti-digoxigenin-Rhodamine
检测杂交信号呈现红色荧光(图 3-A)。图中箭头所示
的染色体在粗线期发生部分自联, 呈单价体状态。
并且有红色杂交信号, 说明该染色体确为第 8 染色
体的短臂。从前面的分析我们已知该染色体不含有
水稻着丝粒基本成分之一 CentO 序列, 为了明确水
稻着丝粒另一基本成分 CRR 是否存在 , 同样以

表 1 T7461无性繁殖后代性状表现与染色体数目鉴定
Table 1 Phenotype and chromosome numbers of the asexual propagation offspring of T7461
植株
Plant
植株表型
Plant phenotype
染色体数目
No. of chromosome
植株数
No. of plant
出现频率
Frequency (%)
原始株 Original plant 叶非常窄, 植株矮小 Small with very narrow leaves 26 16 80
嵌合体 Chimera 宽窄叶的嵌合 Chimera of narrow and very narrow leaves 25–26 2 10
变异株 Variant 叶较窄 Narrow leaves 25 2 10
1508 作 物 学 报 第 37卷


图 2 无性变异系 T7461的原始株及变异株的形态及体细胞染色体鉴定
Fig. 2 The traits and FISH analysis of the original line and variant of T7461
A: 原始株的植株形态; B: 嵌合体植株形态; C: 变异株的植株形态; D: 原始株的有丝分裂中期染色体, 绿色为 CentO信号; E: 变异株
的有丝分裂中期染色体, 绿色为 CentO信号。图中染色体都以 DAPI染色, 所有标尺均为 5 μm。
A: Morphology of the original plant; B: Plant morphology of the chimera; C: Plant morphology of the variant; D: Mitotic metaphase chro-
mosomes of the original line; E: Mitotic metaphase chromosomes of the variant. Chromosomes were counterstained with DAPI in all images.
Scale bars: 5 μm in all images.


图 3 无性变异系 T7461的原始株及变异株的 FISH分析
Fig. 3 FISH analysis of the original line and variant of T7461
A: 变异株粗线期染色体, 红色为第 8染色体短臂上的特异分子
细胞学标记(BAC克隆: a0005O22), 绿色为 CRR信号; B: 原始
株的粗线期染色体, 红色为 a0005O22信号, 绿色为 CRR信号;
C: B图的粗线期染色体二次杂交图, 红色为CentO信号, 绿色为
a0005O22信号; D: 原始株的有丝分裂前中期染色体, 红色为
CentO信号, 绿色为 CRR信号; E: D图的红色 CentO信号; F: D
图的绿色 CRR信号。图中染色体都以 DAPI染色, 所有标尺均
为 5 μm。
A: Chromosomes of the variant at pachytene stage, the red signals
indicated a specific marker (BAC: a0005022) on the short arm of
chromosome 8, the green signals were for CRR; B: Chromosomes
of the original line at pachytene stage, the red signals were for
a0005022 and the green signals were for CRR; C: Secondary hybrid
results of chromosomes in pachytene stage of Fig B, the red signals
were for CentO, the green signals were for a0005O22; D: Chromo-
somes of the original line at mitosis prometaphase, the red signals
were for CentO, the green signals were for CRR. E: CentO signals
(red) of Fig. D. F: the CRR signals (green) of Fig. D. Chromosomes
were counterstained with DAPI in all images. Scale bars: 5 μm in
all images.

Biotin-16-dUTP标记 CRR作为探针与该变异株粗线
期染色体进行 FISH 分析。经 anti-biotin-FITC 检测
杂交信号呈现绿色荧光(图 3-A)。发现单价体染色体
末端有绿色 CRR杂交信号(箭头所示)。对嵌合体的
宽叶株进行同样分析, 获得相似结果。说明 T7461
原始株在无性繁殖过程中发生体细胞无性系变异 ,
丢失了端四体中添加的 1 条·8S, 从而回复成第 8 染
色体短臂的端三体材料。但该端三体材料中仍然保
留的·8S 在着丝粒区域也发生变异, 因为该端三体
材料在最初保存时, 其所添加的·8S 着丝粒区域含
有 CentO[4], 但在该回复的端三体中所添加的·8S 已
不含有 CentO, 而只含有 CRR序列。
2.4 T7461中原始株的 CentO和 CRR鉴定
为了进一步分析原始株中容易丢失的·8S 着丝
粒区域的 DNA序列组成, 分别以 CRR、第 8号染色
体短臂特异分子细胞学标记 BAC克隆 a0005O22和
CentO 为探针与 T7461 原始株的粗线期染色体进行
FISH分析(图 3-B, C)。从图 3-B可以看出箭头所示
的红色 a0005O22 杂交信号二价体比较短, 说明该
端四体中添加的 2条·8S发生联会, 并且在二价体末
端有绿色的 CRR杂交信号, 结合图 3-C中箭头所示
的染色体进行分析 , 表明该二价体的末端没有
CentO信号, 有 CRR信号。但由于二价体中 2个·8S
末端紧密结合在一起, 无法判断是不是 2 个染色体
臂发生断裂的区域都有 CRR信号的存在。
为了进一步明确 CRR 在 2个·8S上分布情况,
利用 CRR 和 CentO 作为探针对 T7461 原始株体细
胞有丝分裂前中期染色体进行 FISH 分析 (图
第 9期 龚志云等: 水稻非整倍体无性繁殖过程中的遗传稳定性 1509


3-D~F)。从图中可以看出箭头所示的 2条·8S上都没
有CentO的分布, 但CRR在两者末端的分布有差别,
其中白色箭头所示的·8S 上有 CRR 的存在, 而在黄
色箭头所示的·8S 上没有 CRR 的存在。结合前面对
变异株的分析, 表明既检测不到 CentO 又检测不到
CRR的端着丝粒染色体在无性繁殖过程中是不稳定
的, 在少数细胞中会发生丢失, 导致第 8 染色体端
三体的出现。
3 讨论
在体细胞无性系的繁殖过程中, 重复 DNA 会
减少 , 在其他研究中也曾报道 , 但没有分析重复
DNA的类型[27-28]。在本研究涉及到各类端着丝粒的
非整倍体材料中, 没有观察到其他端着丝粒的非整
倍体材料染色体臂易丢失的现象, 这可能与体细胞
无性系变异过程中仅仅有少量重复序列丢失有关。
而第 8 染色体短臂末端所含有的 CentO 和 CRR 最
少[21], 所以容易完全丢失。但是从 T7461 中所添加
的 2 个·8S 来看 , 它们来源于端三体材料中的同一
个·8S, 也就是说在最初保存时它们的末端着丝粒是
一样的 , 都是含有水稻功能性着丝粒基本成分
CentO和 CRR[4]。但在长期的无性繁殖过程中其中 1
条·8S 发生了 CentO 和 CRR 的丢失, 而另外 1 条仅
发生了 CentO的丢失。
当染色体发生断裂以后, 2个染色体臂都可能带
有原来部分着丝粒的成分, 形成 2个新的端着丝粒。
并且着丝粒蛋白组分会向周边延伸, 导致着丝粒功
能区扩张至着丝粒周围 DNA序列。所以染色体断裂
能够导致潜在的着丝粒被激活 , 成为功能性着丝
粒[29-30]。在本研究中, 当·8S 仅发生 CentO 丢失时,
水稻着丝粒的另一基本组分 CRR 可以独立充当功
能性着丝粒 , 保证染色体在分裂过程中的正常传
递。说明水稻染色体的着丝粒区域的 DNA只要拥有
两个基本成分 CentO和 CRR中的一个, 就能正常传
递。但是当 CentO和 CRR全部丢失后, 可能由另一
DNA序列来发挥新着丝粒的功能。但是这段发挥着
丝粒功能的DNA序列是不稳定的, 在少数细胞中不
能正常传递, 导致·8S的丢失。因而会在第 8染色体
端四体的材料的无性繁殖后代出现端三体材料, 而
导致该无性系田间性状的分离。已有报道表明, 人
类染色体的着丝粒基本 DNA组成成分 α-卫星 DNA
也会在个别染色体上检测不到, 但该染色体可以传
递, 并形成新着丝粒[31]。由于研究材料的限制, 在
人类中无法进行该染色体是否稳定传递的研究。通
过本研究, 在水稻中获得了与人类相似的结果, 且
水稻材料可以无性繁殖, 便于进一步分析该染色体
传递及研究水稻中潜在新着丝粒。
4 结论
在水稻第 8 染色体短臂端四体(2n+·8S+·8S)的
无性繁殖后代中出现了宽窄叶分离, 是由于其中的
1 条·8S 端着丝粒染色体丢失造成; 原端四体中的 2
条·8S端着丝粒染色体中, 1条·8S在着丝粒区域检测
不到水稻着丝粒的基本组分 CentO 序列, 但可以检
测到水稻着丝粒的另一基本组分 CRR序列, 在无性
繁殖过程中该染色体可以稳定遗传; 另外 1条·8S在
着丝粒区域同时检测不到 CentO和 CRR序列, 该染
色体不能稳定遗传, 容易丢失, 使端四体回复为端
三体。而在端四体相应的端三体亲本材料的·8S 中,
同时含有 CentO 和 CRR 序列。说明·8S 上的 CentO
和 CRR在多年的组织培养过程中会被随机丢失, 导
致含有·8S 的非整倍体在无性繁殖过程中的遗传不
稳定性。
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