全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(5): 802−808 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30671429)和重庆市自然基金项目(9266)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 朱利泉, E-mail: zhuliquan@swu.edu.cn; Tel: 023-68250794
第一作者联系方式: E-mail: rongxy666@126.com
Received(收稿日期): 2008-10-15; Accepted(接受日期): 2009-01-20.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00802
甘蓝自交不亲和基因MLPK与 SSP的 FISH定位
荣小营 1 朱利泉 1,* 王 永 1 高启国 2 陈晓丹 1 杨 洋 2 王小佳 2
1 西南大学植物生理生物化学实验室, 重庆 400716; 2 西南大学重庆市蔬菜学重点实验室, 重庆 400716
摘 要: 利用 FISH技术, 对自交不亲和基因 MLPK与 SSP在甘蓝有丝分裂前中期染色体、减数分裂早粗线期染色体
以及伸长 DNA纤维等 3种分辨率水平的靶 DNA载体上进行物理定位。结果表明, 在有丝分裂前中期, MLPK探针信
号位于一对近中着丝粒同源染色体的短臂中部, 距着丝粒的百分距离约为 53.41±3.16; SSP探针信号位于一对具有随
体的近端着丝粒同源染色体的长臂端部, 距着丝粒的百分距离约为 78.36±4.26。综合 3 种载体上的 FISH 结果表明,
MLPK与 SSP在甘蓝染色体组中可能都只有一个同源序列座位, 具有在单倍体基因组中的单拷贝性。重复 FISH杂交
表明, MLPK与 5S rDNA位于同一对染色体。依据 Armstrong的核型分析标准, 初步判断 MLPK与 SSP可能分别位于
甘蓝的 2号和 7号染色体, 与 S位点不存在连锁关系。另从比较基因组学角度对定位结果进行了讨论。
关键词: 甘蓝; MLPK基因; SSP基因; 荧光原位杂交; 自交不亲和性
Localization of MLPK and SSP Genes for Self-Incompatibility of Brassica
oleracea by Fluorescence in situ Hybridization
RONG Xiao-Ying1, ZHU Li-Quan1,*, WANG Yong1, GAO Qi-Guo2, CHEN Xiao-Dan1, YANG Yang2, and
WANG Xiao-Jia2
1 Plant Physiology and Biochemistry Laboratory of Southwest University, Chongqing 400716, China; 2 Key Laboratory in Olericulture of Chongqing,
Southwest University, Chongqing 400716, China
Abstract: In Brassica, self-incompatibility recognition is controlled by the multiallelic gene complex (S-haplotypes) at the
S-locus, which encodes both the male determinant S-locus pollen coat protein (SCR/SP11) and the female determinant S-locus
receptor kinase (SRK). Studies of MLPK and SSP genes for self-incompatibility of Brassica have been gradually widespread since
they were identified. However, the position and copy number of MLPK and SSP genes in Brassica oleracea genome are still un-
clear. In this paper, the localization of MLPK and SSP genes for self-incompatibility of Brassica oleracea on prometaphase chro-
mosomes, early pachytene chromosomes and extended DNA fibers was conducted successfully by fluorescence in situ hybridiza-
tion. The results indicated that MLPK probe was hybridized onto the short arm of a pair of homologous prometaphase chromo-
somes, and the percent distance from centromere to the signal point was about 53.41±3.16; SSP probe was hybridized onto the
long arm of a pair of homologous prometaphase chromosomes with the satellite, and the percent distance from centromere to the
signal point was about 78.36±4.26. Hybridization signals from three kinds of cytological targets with different FISH resolutions
showed that both MLPK gene and SSP gene might be located at a single-copy locus in Brassica oleracea genome. Repeated FISH
indicated that both MLPK and 5S rDNA probes were hybridized onto the same chromosomes. According to karyotype standard of
Armstrong, it was primarily inferred that MLPK gene was located on the chromosome 2, and SSP gene on the chromosome 7. The
results presumably revealed that neither MLPK nor SSP is linked to S-locus. And they locate respectively on the different chro-
mosomes in Brassica oleracea. In addition, the collinearity relationship of MLPK as well as SSP between Brassica and Arabidop-
sis thaliana was also discussed on the basis of comparative genomics.
Keywords: Brassica oleracea; MLPK gene; SSP gene; Fluorescence in situ hybridization; Self-incompatibility
芸薹属植物中普遍存在一个以 S 位点基因控制
的自交不亲和(self-incompatibility, SI)信号传导途径。
至今, 已鉴定出 S 位点糖蛋白(S-locus glycoprotein
gene, SLG)[1]、雌性决定因子 S位点受体激酶(S-locus
receptor kinase, SRK)[2-3]、雄性决定因子 S位点花粉
胞被蛋白(S-locus pollen coat protein, SCR/SP11)、臂
第 5期 荣小营等: 甘蓝自交不亲和基因 MLPK与 SSP的 FISH定位 803


重复蛋白(arm repeat containing, ARC1)、硫氧还蛋白
家族中的 THL1/THL2、水孔蛋白等传导元件[4-6]。但
目前这一信号传导途径仍不够完整 [7], 许多学者从
多方面进行了补充。Murase等[8]首先从芸薹属自交不
亲和传导途径中发现了一种由M位点编码的蛋白激酶
(M-locus protein kinase, MLPK), MLPK的隐性突变体
植株完全丧失 SI, 表明MLPK与芸薹属 SI信号传导
途径密切相关。最近, Kakita等[9]证实了 MLPK直接
与 SRK 相互作用, 参与了 SI 信号传导过程。2003
年, 吴能表用 32P 标记自交不亲和甘蓝受粉后的花
粉提取液中的蛋白质 , 经检测发现自花受粉后出现
了一条相对分子量约为 22.2 kD 的特异标记带, 并能
受到槲皮素的抑制, 说明该蛋白的磷酸化与 SI信号传
导密切相关, 是 SRK 的一种可能的磷酸化底物蛋白
(SRK substrate protein, SSP) [10-11]。
目前, MLPK、SSP等 SI信号传导元件编码基因
在甘蓝染色体上的物理定位以及与 S 位点的连锁关
系还不明确, 在甘蓝基因组中是否具有同源序列也
没有定论。这些问题的解决对于明确甘蓝 SI信号传
导元件编码基因之间的连锁关系以及阐明孢子体自
交不亲和性的机理具有十分重要的意义。本研究以
MLPK 和 SSP 基因序列为探针, 分别在甘蓝有丝分
裂前中期染色体、减数分裂早粗线期染色体以及伸
长 DNA纤维(extended DNA fibers, EDFs)等 3种靶
DNA 载体上进行荧光原位杂交(fluorescence in situ
hybridization, FISH), 旨在明确 MLPK和 SSP在甘蓝
染色体组中的物理定位, 为孢子体自交不亲和性的
深入研究提供新的内容。
1 材料与方法
1.1 供试材料
甘蓝(Brassica oleracea)自交不亲和品种 Ky57
和 Ay287来自西南大学重庆市油菜工程中心。
1.2 靶 DNA载体制备
参考 Hasterok等[12]和陈瑞阳等[13]方法稍加改进,
采用酶解去壁低渗法制备有丝分裂前中期染色体。
参考钟筱波等[14]方法稍加改进制备减数分裂早粗线
期染色体。参考钟筱波等[14]和 Yang 等[15]方法制备
伸长 DNA纤维(EDFs)。制片经 DAPI复染镜检, 可
在–20℃下干燥保存数月。
1.3 探针标记
插入甘蓝 SSP基因片段的 pMD18-T质粒由西南
大学杨洋博士惠赠。采用赵永斌等 [16]报道的引物
(P1： 5′-GCATGAGTGTTCAGGTTAAAGC-3′, P2：
5′-TGCTCTCTCGGTGGACGATTAT-3′), 克隆扩增
得到 MLPK 基因片段, 并经测序证实后作为探针。
采用随机引物法标记 MLPK 与 SSP 探针(DIG High
Prime, Roche)。甘蓝 5S rDNA探针由西南大学王永
博士提供, 采用 PCR法标记(DIG probe synthesis kit,
Roche)。
1.4 荧光原位杂交程序
1.4.1 杂交前处理 将染色体制片于 60℃烘箱
中干燥 3 h。依次用 100 μg mL−1 RNase A在 37℃酶
解 1 h、 1 μg mL−1 Pepsin 37℃处理 30 min、2% (W/V)
Cellulase 和 2% (W/V)Pectase 混合液 37℃解离 30
min、1% (W/V) TritonX100在 25℃处理 10 min, 每
次处理后均用 2×SSC漂洗 3×5 min。然后用 1% (V/V)
甲醛(50 mmol L−1 MgCl2, 1×PBS配制)于室温下固定
10 min, 2×SSC漂洗 3×5 min。然后经 70%、90%、
100%乙醇依次脱水, 烘干备用。
1.4.2 预变性 染色体制片(EDFs 除外)在 70%
(V/V)去离子甲酰胺(2×SSC稀释)中 70℃变性 2 min,
立即通过预冷的梯度(70%、90%和 100%)乙醇脱水
备用。杂交液(20 μL体系)含 50% (V/V)去离子甲酰
胺、7.5% (V/V)硫酸葡聚糖、2×SSC、1.5 ng μL−1探
针(EDFs-FISH 0.5 ng μL−1)、2% (W/V) SDS、0.5 μg
μL−1 ssDNA(鲑鱼精 DNA)。85℃变性 10 min, 立即
冰浴 10 min以上。
1.4.3 原位杂交 将杂交液加于制片上, 加盖玻
片, 密封, 85℃共变性 10 min, 然后于 37℃湿盒中杂
交 18~24 h。
1.4.4 杂交后洗脱及信号检测 室温 2×SSC中漂
洗 5 min, 然后在 37℃条件下(EDFs-FISH 为 40℃),
以 4×SSCT (0.2% Tween 20)、2×SSC和 1×PBS各洗
脱 5 min。每片加羊抗地高辛荧光素偶联物(Sheep
anti-Digoxigenin-Fluorescein, Roche) 20 μL, 37℃温
育 30 min后漂洗, 步骤同前, 时间改为每次 8 min。
然后加入兔抗羊荧光素偶联物 (Rabbit anti-Sheep-
Fluorescein, Roche) 20 μL, 温育和洗脱同前。用 5 μg
mL−1 的 DAPI 复染 , 加抗淬灭剂 , Nikon Eclipse
E600W荧光显微镜观察, Digital Sight DS-U2 CCD
捕捉收集图像 , 使用 NIS-Elements BR 2.20 和
Photoshop软件对图像进行叠加和处理。
2 结果与分析
2.1 适合于 3种伸长度的染色体 FISH体系的建立
在前中期和早粗线期染色体上采用的 FISH 程
序基本一致(方法 1.4)。而 EDFs-FISH中, 制片无需
804 作 物 学 报 第 35卷

进行前处理和预变性, 杂交液中探针浓度以及杂交
后洗脱温度略有不同, 其余程序在 3种载体上可保持
一致,杂交效果均较好, 证明该方法的可行性。实验
中对 FISH体系作了如下几方面的条件优化。
MLPK和 SSP探针序列经 PCR扩增后, 产物转
化大肠杆菌, 菌液 PCR 检测后由上海英骏生物公司
测序。MLPK和 SSP 探针序列分别为 1 721 bp (图
1)和 1 251 bp (图 2)。在 20 μL杂交液体系中, 最低
探针浓度以达到靶核苷酸的最大饱和结合度为宜。
在 0.1~1.5 ng μL−1 (EDFs-FISH 0.5 ng μL−1)范围内,
杂交效率随着浓度的增加不断提高。
针对甘蓝前中期及早粗线期染色体较高的包裹
程度, 杂交前处理时采用不同的方法处理制片(表 1)
发现, 杂交前处理是否充分直接影响 FISH信号的检
出率和信噪比。另外, 染色体制片预变性不彻底或
变性过度都会直接影响 FISH的效果。对前中期及早
粗线期染色体在 70%去离子甲酰胺中的变性条件进
行探索(表 2)表明, 70℃变性 2 min取得较好的杂交
效果; 若变性时间稍长, 对前中期染色体的影响更
为明显。
杂交后洗脱先后尝试了 42℃~37℃等 6 种不同
温度条件。结果表明, 针对单、低拷贝探针的 3 级
洗脱, 37℃获得的杂交信号比较稳定, 背景影响较
小, 信噪比较高。对于 EDFs-FISH, 将温度提高到
40℃, 能更好地减少非特异信号, 提高信噪比。利用
抗体偶联物进行信号的级联放大, 对于杂交信号检
出率的提高至关重要。
2.2 MLPK和 SSP在甘蓝前中期染色体上的 FISH
MLPK和 SSP2种探针都只在 1对同源染色体上
检测到绿色杂交信号(图 3)。MLPK 探针信号位于 1
对近中着丝粒染色体的短臂中部(图 3-A, B); SSP探
针信号位于 1 对具有随体的近端着丝粒染色体的长
臂端部(图 3-C, D)。没有观察到同时出现在姊妹染色
单体上的双点信号现象。MLPK 探针信号检出率为
11.8%, SSP探针信号检出率为 9.1%。在图 3-A中观



图 1 MLPK基因片段 PCR扩增电泳图
Fig. 1 PCR products of MLPK fragment
1：DL2000 DNA marker; 2：MLPK基因片段 PCR产物。
1: DL2000 DNA marker; 2: PCR products of MLPK fragment.



图 2 SSP基因片段 PCR扩增电泳图
Fig. 2 PCR products of SSP fragment
1：DL2000 plus DNA marker; 2：SSP基因片段 PCR产物。
1: DL2000 plus DNA marker; 2: PCR products of SSP fragment.

表 1 杂交前不同处理对有丝分裂前中期染色体 FISH信号检出率与信噪比的影响(MLPK探针)
Table 1 Effects of pretreatments on rate of detected signal and ratio of signal-to-noise in prometaphase FISH(MLPK probe)
RNA酶 Aa
RNase A
胃蛋白酶 b
Pepsin
纤维素酶和果胶酶
2%(W/V) cellulase &
2% (W/V) pectase
1%(W/V)
TritonX100
处理
Treat-
ment 37℃/1 h 37℃/30 min 37℃/30 min 25℃/10 min
信号检出率 c
Rate of
detected signal
(%)
信噪比
Ratio of
signal-to-noise
1 + − − − 3.7 B
2 + + − − 8.9 C
3 + + + − 10.9 D
4 + + − + 10.3 E
5 + + + + 11.8 F
6 − − − − 1.1 A
a：RNA酶 A浓度为 100 μg mL−1; b：胃蛋白酶浓度为 1 μg mL−1; c：信号检出率(%)=检测到杂交信号的细胞数/观察细胞总数×100%;
+：进行处理; −：不处理; A~F：信噪比逐步提高。
a: the working concentration for RNase A is 100 μg mL−1; b: the working concentration for pepsin is 1 μg mL−1; c: rate of detected signal
(%)=cell number of detected hybridization signal/observed cell total number×100%; +: treatment; −: without treatment; A–F: enhanced ratio
of signal-to- noise gradually.
第 5期 荣小营等: 甘蓝自交不亲和基因 MLPK与 SSP的 FISH定位 805


表 2 不同染色体变性条件对 FISH结果的影响(MLPK探针)
Table 2 Effects of chromosome denaturation conditions on FISH (MLPK Probe)
信号检出率 Rate of detected signal(%)
处理
Treatment
变性条件
Denaturation condition
(℃/min)
前中期染色体
Prometaphase chromosomes
早粗线期染色体
Early pachytene chromosomes
1 65/2.0 0(++) 0(++)
2 65/3.0 2.1(+) 6.7(+)
3 70/2.0 11.8(+) 31.4(+)
4 70/2.5 3.5(−) 30.8(+)
5 70/3.0 0.2(−−) 30.3(+)
+：染色体形态良好; −：染色体膨胀变形。
+: good chromosome configuration; −: chromosome distortion or dilating.

察到 2个 MLPK 探针信号; 而在图 3-B中染色体基
本成同源配对, 杂交信号所在染色体部分重叠导致
只观察到 1个信号。在图 3-C和图 3-D中 SSP探针
也有类似情况出现。由此表明, 靶 DNA载体的质量
对于杂交效果有直接的影响。在图 3中, 各信号点的
强度、大小等有一定的差异, 推测可能与染色体自
身的空间状态有关。当靶染色体以一定的解螺旋方
式出现时 , 探针可以更容易进入 , 提高了探针与靶
DNA的结合率, 信号强度和检测灵敏度会相应提高。



图 3 MLPK与 SSP在甘蓝有丝分裂前中期染色体上
的荧光原位杂交
Fig. 3 FISH of MLPK and SSP genes on prometaphase chro-
mosomes of Brassica oleracea
A~B: MLPK杂交信号; C~D: SSP杂交信号; 标尺为 10 μm。
A–B: FISH signals of MLPK; C–D: FISH signals of SSP.
Scale bars=10 μm.

2.3 MLPK和 SSP在甘蓝减数分裂早粗线期染色
体上的 FISH
MLPK 和 SSP 探针在甘蓝减数分裂早粗线期染
色体上(图 4-A, B), 1个分裂相内最多只观察到 2个同
源杂交信号。而 2 个杂交信号相距较远, 由此说明,
该时期同源染色体尚未完全联会, 介于偶线期和粗
线期之间, 即为早粗线期染色体。但据形态来看应
该更靠近偶线期, 其 FISH的检测灵敏度和分辨率较
之粗线期会更高[17]。MLPK探针信号检出率为 31.4%,
多数分裂相可观察到 2 个同源杂交信号, 如图 4-A
两个分裂相中观察到 4个信号点; SSP探针信号检出
率为 20.4%, 多数分裂相中观察到的是单个信号点
(图 4-B)。2 种探针之间, 信号检出率、强度、大小
都表现出一定的差异。
2.4 MLPK 和 SSP 在甘蓝伸长 DNA 纤维上的
FISH
在 EDFs上(图 4-C, D), MLPK和 SSP探针都呈
现单个的绿色杂交信号点。根据我们课题组 5S
rDNA的 EDFs-FISH的拷贝数及杂交信号的分布(另
文发表), 可以推算出制备的 EDFs 的伸展度约为 7
kb μm−1, 按照显微镜分辨率 0.2 μm计算, EDFs的
FISH分辨率水平可以达到 1.5 kb左右。本研究中所
用的探针大小分别为 1 721 bp和 1 251 bp, 因此, 推
测两种探针信号在 EDFs 上呈现的单个点即代表该
探针序列的 1 个拷贝。由于制备 EDFs 所用的细胞
核密度较大以及DNA纤维拉伸时多成束存在, 因而
在同一视野下观察到的 EDFs 应出自多个不同的细
胞核。因此, 在 EDFs制片上尽管观察到多个杂交信
号点, 但它们应位于多个细胞核拉伸出的 EDFs 上
即属于不同的染色体组。另外, 前中期和早粗线期
染色体 FISH 表明, MLPK 和 SSP2 种探针都只在 1
对同源染色体上检测到杂交信号。而 EDFs-FISH结
果显示在每一条(或束)DNA纤维上只有 1个信号点,
1条 DNA纤维对应于 1 条染色体,由此推断, MLPK
与 SSP 在 1 条染色体上可能只有 1 个拷贝。MLPK
和 SSP 探针信号的强度、大小皆表现出一定的个体
差异性。
806 作 物 学 报 第 35卷



图 4 MLPK与 SSP在甘蓝减数分裂早粗线期染色体和伸长
DNA纤维上的荧光原位杂交
Fig. 4 FISH of MLPK and SSP probes on early pachytene
chromosomes and extended DNA fibers in Brassica oleracea
A：MLPK在早粗线期染色体上的杂交信号; B：SSP在早粗线期
染色体上的杂交信号; C：MLPK在伸长 DNA纤维上的杂交信号;
D：SSP在伸长 DNA纤维上的杂交信号; 标尺为 10 μm。
A: FISH signals of MLPK on early pachytene chromosomes; B:
FISH signals of SSP on early pachytene chromosomes; C: FISH
signals of MLPK on extended DNA fibers; D: FISH signals of SSP
on extended DNA fibers. Scale bars=10 μm.

2.5 MLPK和 SSP在甘蓝染色体组内的物理定位
本研究采用的 3种靶 DNA载体的 FISH空间分
辨率逐步提高, 从 Mb 数量级到 kb 数量级不等, 其
中, EDFs的分辨率最高可以达到 1.5 kb左右。综合
分析 MLPK 和 SSP 在 3 种分辨率水平的靶 DNA 载
体上的 FISH结果表明, MLPK与 SSP在甘蓝染色体
组中可能都只有 1 个同源序列座位, 二者在甘蓝单
倍体基因组中为单拷贝基因。采用重复 FISH, 将
MLPK、SSP 及甘蓝 5S rDNA 探针先后在同一张前
中期染色体制片上进行杂交, 其同一分裂相的结果
表明, 在甘蓝染色体组内, MLPK和 5S rDNA探针信
号位于同一对染色体上(图 5-A, B), SSP探针信号位于
另一对同源染色体上(图 5-C)。依据 Armstrong 等[18]
的核型分析标准, 5S rDNA位于 2号染色体, 4号和 7
号染色体具有随体。再参考染色体的平均相对长度、
着丝粒指数等参数(表 3), 初步判断, 在甘蓝染色体组
中, MLPK 位于 2 号染色体的短臂中部(图 5-A, D),
信号距着丝粒的百分距离约为 53.41±3.16; SSP位于
具有随体的 7号染色体的长臂端部(图 5-C, D), 信号
距着丝粒的百分距离约为 78.36±4.26。



图 5 MLPK与 SSP在甘蓝染色体组中的物理定位
Fig. 5 Physical localization of MLPK and SSP genes by FISH
on chromosomes of Brassica oleracea
A：MLPK杂交信号; B：5S rDNA杂交信号; C：SSP杂交信号; D：
甘蓝中期染色体核型图; 标尺为 10 μm。
A: FISH signals of MLPK; B: FISH signals of 5S rDNA C: FISH
signals of SSP; D. The karyotype of metaphase in Brassica oleracea;
Scale bars=10 μm.
3 讨论
随着国际芸薹属基因组计划(MBGP)深入开展,
在 A、B、C基因组测序等方面已取得了不同程度的
进展, 为本研究利用 NCBI 和 MBGP(http://www.
brassica.info/resource/)数据库, 深入分析讨论 MLPK
和 SSP 在甘蓝染色体组内的定位提供了可能。对
MLPK和 SSP探针序列在 GenBank、Brassica DB、

表 3 MLPK与 SSP在甘蓝染色体上的定位
Table 3 Localization of MLPK and SSP genes on Brassica oleracea Chromosomes
基因
Gene
染色体
Chromosome
相对长度
Relative length
(%)
着丝粒指数
Centromere index
信号距着丝粒百分距离
Percentage distance from the centromere to
the signal site(%)
臂比
Ratio of arm
MLPK 2S 11.89±0.59 36.22±2.68 53.41±3.16 1.44±0.19
SSP 7L 10.28±1.17 25.6±1.07 78.36±4.26 1.96±0.86
S: 短臂; L: 长臂。S: short arm; L: long arm.
第 5期 荣小营等: 甘蓝自交不亲和基因 MLPK与 SSP的 FISH定位 807


BrGP-BAC 中的 Blastn 同源性比对发现, 在拟南芥
(Arabidopsis thaliana)中与 MLPK序列同源性最高的
是位于拟南芥 2 号染色体上的 BAC 克隆 F8N16
(GenBank 登录号为 AC005727.3)。进一步通过拟南
芥数据库TAIR (http://www.arabidopsis.org)比对发现,
F8N16位于拟南芥 2 号染色体的 12.4 Mb处。芸薹
属与拟南芥之间的比较基因组学研究表明, 甘蓝、
白菜与拟南芥之间存在广泛的共线性关系[19-20]。拟
南芥 2号染色体在甘蓝第 2、3、4、9连锁群上存在
共线性区域, 其中拟南芥 2 号染色体上的 12.2 Mb
到 13.8 Mb 区域与甘蓝的第 4 连锁群同源 [20-21],
MLPK 的同源序列就位于此共线性范围内。在白菜
(Brassica rapa)中与 MLPK 序列同源性最高的是
BAC克隆KbrB068E07 (GenBank登录号为AC189432.2),
相似性达 97%以上 , KbrB068E07 克隆中应含有
MLPK 在白菜基因组中的同源序列。利用 NIAB-
KOREA (http://www.brassica-rapa.org/KBGP/)提供的
白菜与拟南芥之间的基因组比较图谱比对发现 ,
KbrB068E07 与拟南芥 2 号染色体上 12.2~12.5 Mb
这一区域同源, 由上述推断, MLPK 位于甘蓝的第 4
连锁群即第 2号染色体[22], 这与我们的 FISH定位结
果一致。SSP序列经同源比对发现, 拟南芥中同源性
最高的是T13C7克隆(GenBank登录号为AC007109.7),
通过 TAIR 比对, T13C7 位于拟南芥 2 号染色体 8.8
Mb 处,与甘蓝第 7 连锁群具有共线性关系[21], 据此
SSP应位于甘蓝第 4号染色体[22], 与我们的 FISH定
位结果稍有出入。研究表明, 芸薹属与拟南芥之间
的共线性关系较为复杂, 不排除该区域在进化过程
中发生大量易位、断裂现象的可能; 另外, 甘蓝的第
4、7 号染色体上都有随体, 其中 4 号较小, 观察困
难, 而 7 号相对较大, 比较容易观测[18], 因此, SSP
应位于 4 号或 7 号染色体, 杂交结果显示 SSP 探针
信号所在染色体的随体较为明显,因而倾向 SSP位于
7号染色体, 但还有待进一步确认。
本研究中所用的早粗线期染色体与晚粗线期相
比更加细长, FISH 的检测灵敏度和分辨率更高。而
且杂交信号正好位于常染色质所占比例较高的区域,
这更有利于信号的检出。但研究发现, 早粗线期染
色体上杂交信号检出率与前中期染色体相比提高幅
度并不明显。Wang等[23]研究表明, 采用 Cy3直接标
记单拷贝序列作探针在玉米粗线期染色体上杂交 ,
3.4 kb序列检出率为 70%, 3.1 kb序列检出率为 63%,
而 4.1 kb序列因 5′端存在同源性不高的反向重复转
座子序列而使其检出率仅为 40%。在油菜染色体上
定位 SLG和 SLR1时也发现, SLG探针因与靶染色体
同源性较低而只在 1条同源染色体上检测到信号[24]。
本研究所用探针与早粗线期染色体来自不同的甘蓝
品种。因此, 推测 MLPK 和 SSP 的非编码区序列在
甘蓝品种间可能存在一定程度的进化趋异性, 杂交
中探针与靶DNA载体同源性不高, 导致杂交信号检
出率相对较低, 但还有待进一步的研究。前中期和
早粗线期染色体 FISH表明, 检测中进行信号的级联
放大与否, 对杂交效果影响显著。Howell 等[22]用插
入片段为 1 880 bp的质粒作探针时, 直接用 Cy3检
测不到, 但用 3 级链亲和素-Cy3 则可以检测到, 而
插入序列为 3.3 kb的质粒探针则可以用 Cy3直接检
测到。这些都表明 , 信号级联放大可以有效提高
FISH 灵敏度和信号检出率, 尤其是对于单、低拷贝
探针效果更为明显。研究发现, MLPK和 SSP在 3种
载体上 FISH信号的强弱、大小都表现出一定的个体
差异。其原因是 DNA 变性过程中, 靶 DNA 有可能
部分丢失; 且在杂交过程中探针与靶DNA随机相遇
而结合, 靶 DNA 有些区域得到充分结合, 有些区域
则很少或没有结合[25]。另外,检测中荧光的反复被激
发, 也可能导致某些信号变弱甚至淬灭。
目前, 已证实MLPK与 SRK之间存在直接的相
互作用, MLPK作为 SRK 受体复合物的核心因子作
用将会是以后芸薹属自交不亲和性研究中的热点[9]。
在 SI 信号传导途径中, SSP 可能作为 ARC1 发挥泛
素连接酶作用的调节因子而起作用[11,26]。已有研究表
明, S位点位于甘蓝第 6连锁群即第 9号染色体[22,24]。
因此, 在甘蓝染色体组中 MLPK、SSP与 S位点之间
不存在连锁关系, 分别位于不同的染色体, 并且在
单倍体基因组中都是单拷贝的。MLPK 和 SSP 在甘
蓝染色体组中的定位可以为 SSP 等自交不亲和基因
结构和功能的研究打下良好的基础 , 有助于明确
SSP是否作为 SI信号传导途径的下游元件。MLPK、
SSP 以及 S 位点在甘蓝染色体组中的分布特点对于
SI 基因表达调控时空特性的研究具有重要意义, 这
对于阐明 SI 信号传导途径中 MLPK 与 SRK 以及其
他元件之间的相互关系具有积极的促进作用。
4 结论
在甘蓝染色体组中, MLPK与 SSP可能都只有一
个同源序列座位, 初步证明二者在单倍体基因组中
的单拷贝性, 与 S 位点基因之间不存在连锁关系,
808 作 物 学 报 第 35卷

且分别位于不同的染色体上。MLPK和 SSP可能分别
位于甘蓝的 2 号和 7 号染色体。本研究建立的 FISH
杂交体系, 经实践证明适用于 3种伸长度染色体的荧
光原位杂交。
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