全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(4): 579586 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30971849)资助。
*
通讯作者(Corresponding authors): 朱利泉, E-mail: zhuliquan@swu.edu.cn, Tel: 023-68250794, Fax: 023-68251914; 王小佳, E-mail: wxj@swu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: lbsong-001@163.com **共同第一作者
Received(收稿日期): 2010-09-17; Accepted(接受日期): 2011-01-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00579
利用酵母双杂交法检测甘蓝 SCR与 SRK之间的相互作用
罗 兵 1,3 薛丽琰 1,** 朱利泉 1,* 张贺翠 1 彭一波 1 陈 松 1 杨 红 1
杨 昆 1 李成琼 2 王小佳 2,*
1 西南大学植物生理生物化学实验室, 重庆 400716; 2 西南大学重庆市蔬菜学重点实验室, 重庆 400716; 3常熟理工学院生物与食品工
程学院, 江苏常熟 215500
摘 要: 为深入研究甘蓝 S 位点受体激酶(SRK)和 S 位点富含半胱氨酸蛋白(SCR)间相互识别的分子机理, 以具有典
型自交不亲和性的甘蓝 D3 为材料, 利用巢式 PCR 分别扩增 SRK 胞外域(eSRK)和 SCR, 通过酵母双杂交检测二者之
间的相互作用, 并利用同源重组技术将 eSRK与 GAL4报告基因 DNA活化域融合(pGADT7eSRK)以及 SCR与 GAL4
报告基因 DNA结合域融合(pGBKT7SCR)。两种重组质粒分别转化酵母 Y187 和 Y2HGold 后未出现自激活现象。融
合的二倍体酵母(pGADT7eSRK×pGBKT7SCR)能在选择性固体培养基(SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA)上生长,
并且菌落呈蓝色。结果表明, eSRK与 SCR蛋白能够相互结合, 为深入研究二者作用位点成功建立了一个技术平台。
关键词: 甘蓝; S位点受体激酶(SRK); S位点富含半胱氨酸蛋白(SCR); 酵母双杂交
Detection of Interactions between SCR and SRK in Brassica oleracea L. by
Yeast Two-Hybrid System
LUO Bing1,3, XUE Li-Yan1,**, ZHU Li-Quan1,*, ZHANG He-Cui1, PENG Yi-Bo1, CHEN Song1, YANG
Hong1, YANG Kun1, LI Cheng-Qiong2, and WANG Xiao-Jia2,*
1 Plant Physiology and Biochemistry Laboratory of Southwest University, Chongqing 400716, China; 2 Key Laboratory in Olericulture of Chongqing,
Southwest University, Chongqing 400716, China; 3 College of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500,
China
Abstract: For further study on mechanism of the mutual recognition between S-locus receptor kinase (SRK) and S-locus Cys-
teine-rich protein (SCR) in Brassica, the extracellular domains of SRK (named as eSRK) and SCR were amplified by nested PCR
using Brassica oleracea L. “D3” with the trait of typical self-incompatibility (SI), and the interactions between eSRK and SCR
was detected by the yeast two-hybrid system. Then the full-length eSRK and the SCR were fused to the Gal4 DNA activation
domain (designated pGADT7eSRK) and the Gal4 DNA binding domain (designated pGBKT7SCR) by the gene homologous re-
combination technique respectively. Then the pGADT7eSRK plasmid and the pGBKT7SCR were transformed into the Y187
yeast strain and the Y2HGold yeast strain respectively. The two transformed yeast strains did not exhibit autoactivation. The dip-
loids, which were fused by the transformed Y2HGold yeast strain and the transformed Y187 yeast strain, grew on selective agar
plates (SD/–Ade/–His/– Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA), and the resulting colonies were blue, which strongly indicated that eSRK and
SCR could combine with each other.
Keywords: Brassica oleracea L.; Self-incompatibility; S-locus receptor kinase (SRK); S-locus cysteine-rich protein (SCR); Yeast
two-hybrid system
甘蓝自交不亲和性花粉和柱头相互识别的特异
性受一个带有复等位基因的多态性 S 基因座(S-locus)
所控制[1-2]。在 S 位点有 3 个高度多态性基因即 S-
受体激酶(S receptor kinase, SRK)编码基因[3-4], S-富
含半胱氨酸蛋白(S cystine rich, SCR)编码基因[5-6]和
S-糖蛋白(S glycoprotein, SLG)编码基因[7]。花粉的识
别特异性是由 SCR 控制[5,8-9], 而柱头的由 SRK 控
制[10-11]。SRK的胞外域(eSRK)与 SLG基因的序列相
似[3], 故称其为 S结构域。这 3个基因具高度多态性,
同一 S基因座的这 3个基因称为一个单倍型[12]。
580 作 物 学 报 第 37卷

研究表明[4,13], 不仅在受粉时同一 S 单倍型的
SRK与 SCR相互结合导致自交不亲和的发生, 而且
从柱头质膜提取的天然 SRK蛋白以及烟草细胞产生
的标签融合 SRK 蛋白也能与同类 S 型的 SCR 蛋白
相互结合 , 而不与其他 S 型的 SCR 蛋白结合。
Shimosato 等[14]也证明 SCR 与同型 SRK 高度亲和,
并且 SCR 与 SRK 结合后会导致 SRK 自磷酸化, 从
而引发下游信号传导。SCR与 SRK胞外 S结构域编
码区(eSRK)相互识别[13], SRK的胞外结构域和 SCR
都有高变区域 [15], 两者之间的这种较大的变异性 ,
在进化上赋予 S 单倍型多态性。对这些多态性的 S
单倍型内部或 SCR与 eSRK之间的两两结合强度和
识别程度的研究, 对于自交不亲和性的调控具有十
分重要的意义。目前, 近 80%的蛋白质相互作用研
究都是利用酵母双杂交体系完成的[16]。酵母双杂交
系统与烟草细胞表达系统相比具有简单、方便等优
点。目前已成功利用酵母双杂交技术研究了 SRK与
两种类硫氧还蛋白 THL1、THL2 和臂重复蛋白
ARC1 之间的相互作用[17-19], 还利用酵母双杂交体
系对 SRK胞外域(eSRK)二聚体的形成以及自我识别
作用位点进行了研究[20], 本研究应用巢式 PCR克隆
自交不亲和信号传导中的雌雄决定因子, 建立适用
于 SRK 的 N-端胞外 S 结构域与 SCR 的相互作用的
酵母双杂交体系, 为深入研究 SRK与 SCR相互作用
的机理, 建立芸薹属自交不亲和性的全新测定方法,
实施 SRK-SCR 复合体聚合与解离的人为调控提供
理论和技术基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蓝高度自交不亲和材料 D3 由西南大学园艺
园林学院提供。酵母双杂交系统(Matchmaker Gold
Yeast Two-Hybrid System)、同源重组酶(In-Fusion
Advantage PCR Cloning Kit)购自 Clontech公司。限
制性内切酶、TaqDNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司。
mRNA提取试剂盒、反转录酶购自 TransGen公司。
1.2 总 RNA的提取与 cDNAs合成
收集甘蓝开花前 1 d的花柱和开花当日的花药,
提取柱头和花粉的总 RNA。以 Oligt18为引物, 按照
TransGen的说明书操作反转录成 cDNA。
1.3 SRK的 PCR扩增及酵母表达载体构建
采用巢式 PCR 特异扩增 SRK 的 S 结构域。外
引物为 PK1+PK2, 参照 Nishio 等[21]的引物设计(表
1)。以 PK1+PK2扩增时, 在 25 μL反应体系中, 取
2 μL cDNA作模板, 反应程序为 94 3 min; ℃ 循环中
94 45 s, 57℃ ℃ 45 s, 72 2 min℃ , 共 30个循环; 72℃
延伸 10 min。反应结束后取 2 μL PCR产物作为内引
物 PK1+PK3 (表 1)扩增的模板, 内引物扩增反应体
系和反应程序同外引物。PCR产物连接到 pMD19-T
载体, 用载体通用引物 M13F 和 M13R 进行菌落
PCR 鉴定, 取阳性克隆送北京奥科生物公司测序。
根据材料 D3、240、B3、E1、230、243和 G1测序
结果设计兼并引物 PK4 (表 1), 以引物 PK1+PK3扩
增产物为模板, 用内引物 PK4+PK3 扩增 eSRK, 反
应体系和反应程序同外引物。PCR 扩增片段通过同
源重组连接酵母双杂交表达载体 pGADT7(记为
pGADT7eSRK), 用载体 pGADT7 通用引物 T7 Se-
quencing primer (5′-TAATACGACTCACTATAGGG
CG-3′)和 3′AD Sequencing primer (5′-AGATGGTGC
ACGATGCACAG-3′)进行菌落 PCR 鉴定, 取阳性克
隆送北京奥科生物公司测序。
1.4 SCR的 PCR扩增及酵母载体构建
以外引物为 PC1+PC2, 参照 Watanabe 等[22]的
引物设计, 内引物为 PC3+PC4 (表 1)。以外引物
PC1+PC2 进行扩增时, 在 25 μL 反应体系中, 取 2
μL cDNA作模板, 反应程序为：94 3 min; ℃ 循环中：
94 30 s, 45 30 s, 72 1℃ ℃ ℃ min共 42个循环; 72℃延
伸 10 min[22]。反应结束后取 2 μL PCR产物作为内引
物 PK3+PK4扩增的模板, 反应程序 94 3 min; ℃ 循
环中 94 30 s, 60 30℃ ℃ s, 72 1 min℃ 共 30个循环;
72℃延伸 10 min。PCR产物通过同源重组连接到酵
母双杂交表达载体 pGBKT7(记为 pGBKT7SCR), 用
载体 pGBKT7 通用引物 T7 Sequencing primer
(5′-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3′) 和 3′BD
Sequencing primer (5′-TTTTCGTTTTAAAACCTAA
GAGTC-3′)进行菌落 PCR 鉴定, 取阳性克隆送北京
奥科生物技术有限公司测序。
1.5 酵母感受态制备和转化
参考 Clontech 公司 Gold Yeast Two-Hybrid
System标准的操作方法。将酵母菌Y187和Y2HGold
分别接种于 3 mLYPDA 液体培养基中, 30℃培养
8~12 h, 取 5 μL菌液转至新的 50 mL YPDA液体培
养基, 30℃培养至 OD600约为 0.15~0.30, 700×g离心
收集菌体, 再将菌体转接至新的100 mL YPDA液体培
养基, 30℃培养至 OD600约为 0.4~0.5, 700×g离心收集
菌体 , 用无菌水洗涤酵母细胞后重悬于适量 1.1×
TE/LiAc中。
第 4期 罗 兵等: 利用酵母双杂交法检测甘蓝 SCR与 SRK之间的相互作用 581


表 1 扩增 SRK 的 S结构域和 SCR的引物
Table 1 Primers used for amplification of the S domain of SRK and SCR
名称
Name
基因
Gene
引物序列
Sequence (5′–3′)
位置
Position
参考文献
Reference
pK1 SRK ATGCAAGGTGTACGATACATCTATCATCATTCTTAC 外显子 1 Exon 1 Nishio et al.[21]
pK2 SRK GATCAGAAGAAGCAGAACAGTAACTCCAACAGTC 外显子 2 Exon 2 Nishio et al.[21]
pK3 SRK TCATCTGCAGCTCGAGCGAGGTCAACTGCAGCCAATCTGAAATAAAGRTYTTGAC 外显子 1 Exon 1 本研究 This study
pK4 SRK GGAGGCCAGTGAATTCATSTAYKTCAACACTTTGTCGTC 外显子 1 Exon 1 本研究 This study
pC1 SCR ATGAAATCNGNTNTTTATGCTTTANTATGTTTC 外显子 1 Exon 1 Watanabe et al.[22]
pC2 SCR ACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT 多聚 A Poly A Watanabe et al.[22]
pC3 SCR CATGGAGGCCGAATTCCAAGRAGTGGAAGCTAAT 外显子 2 Exon 2 本研究 This study
pC4 SCR GCCGCTGCAGGTCGACACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAAT 多聚 A Poly A 本研究 This study
下画线为同源重组序列。Homologous recombination sequences are underlined.

将 0.1 μg 待转化的重组质粒 pGADT7eSRK 和
pGBKT7SCR分别加入 1.5 mL的离心管中, 再分别
加入 0.1 mg鱼精 DNA, 在含质粒 pGADT7eSRK的
离心管中加入 50 μL Y187 感受态细胞, 在含质粒
pGBKT7SCR的离心管中加入 50 μL Y2HGold感受
态细胞, 混匀, 再分别加入 0.5 mL PEG/LiAc 溶液,
混匀。30℃培养 30 min, 分别加入 20 μL DMSO,
42℃水浴热激 15 min, 离心, 用 1 mL YPD plus me-
dium重悬, 30℃培养 45 min, 离心并用 1 mL 0.9%
NaCl 重悬, 取适量酵母 Y187 涂于 SD/–Leu 固体培
养基上, 酵母 Y2HGold涂于 SD/–Trp固体培养基上,
30℃倒置培养 3~5 d至阳性克隆出现。
1.6 自身转录激活活性鉴定
参考 Clontech 公司 Gold yeast two-hybrid sys-
tem 标准的操作方法。将酵母 Y187 分别涂在 SD/
–Leu、SD/–Leu/X-a-Gal、SD/–Leu/–Trp和 SD/–Leu/
X-a-Gal/Aureobasidin A (aureobasidin A, 以下简称
AbA)固体平板上, 酵母 Y2HGold分别涂在 SD/–Trp、
SD/–Trp/X-a-Gal、SD/–Leu/–Trp和 SD/–Trp/X-a-Gal/
AbA 固体平板上。30℃培养 3~4 d, 观察 eSRK 和
SCR片段在酵母体内有无自身转录激活活性。
1.7 酵母双杂交及其蛋白相互作用的检测
参考 Clontech 公司 Gold Yeast Two-Hybrid
System小规模转化方法。从已转化好的酵母菌 Y187
和 Y2HGold中分别挑取 1个阳性克隆于带有 500 μL
2×YPDA的 1.5 mL离心管中, 混匀, 30℃培养 20~24
h, 取适量分别涂 SD/–Trp、SD/–Leu和 SD/–Leu/–Trp
固体培养基上, 30℃倒置培养 3~5 d 至阳性克隆出
现。再挑取 SD/–Leu/–Trp固体培养基上的阳性克隆
分别涂在 SD/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA 和 SD/–Ade/
–His/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA固体培养基上, 30℃培
养 3~5 d观察菌落能否呈蓝色。
2 结果与分析
2.1 基因的克隆及分析
本研究设计的内引物 pK3相对于 pK1的连锁关
系如图 1所示, 两者位于外引物 pK1和 pK2之内, 分
别位于 SRK胞外结构域的 3′端和 5′端。以外引物 pK1
和 pK2扩增产物为模板, 利用内引物 pK1和 pK3扩
增, PCR产物经 0.7% (W/V)琼脂糖凝胶电泳检测, 能
得到 1.3 kb左右的特异条带(未附图)。将回收产物连
接到 pMD19-T载体, 测序结果表明扩增产物为 SRK
序列。设计的内引物 pK4相对于 pK3的连锁关系如
图 1所示, 两者位于外引物 pK1和 pK3之内。以 pK1
和 pK3扩增的 PCR产物为模板, 利用内引物 pK4和
pK3 扩增, 产物经 0.7%琼脂糖凝胶电泳检测, 得到
1.2 kb左右的特异条带(图 2), 这与预期目标大小一
致。将产物回收并利用同源重组技术连接到
pGADT7 载体, 重组质粒(pGADT7eSRK)测序结果
表明, 扩增的 eSRK为 1 218 bp, 编码 406个氨基酸
残基。



图 1 扩增 SRK S结构域的引物在核苷酸序列上的位点
Fig. 1 Sites of nucleotide sequences used as primers for S
domain of SRK
箭头代表引物。Arrows indicate the primers.

本文设计的内引物 pC3相对于 pC4的连锁关系
如图 3 所示, 两者位于外引物 pC1 和 pC2 之内, 分
别位于 SCR 信号肽剪切位点和 mRNASCR的 ployA
位点。以内引物 pC3和 pC4扩增的巢式 PCR产物, 经
582 作 物 学 报 第 37卷

1%琼脂糖凝胶电泳检测, 能得到 300 bp左右的特异
条带(图 4), 这与预期大小一致。将产物回收并利用
同源重组技术连接到 pGBKT7 载体, 重组质粒测序
结果表明, 扩增产物为 SCR 序列, 产物为 319 bp,
编码 58个氨基酸残基, 3′非翻译区(3′UTR)为 127 bp,
18 bp为 polyA。



图 2 eSRK基因 RT-PCR电泳图
Fig. 2 Electrophoretic pattern of RT-PCR products of eSRK
1: DL2000 marker; 2: eSRK RT-PCR产物。
1: DL2000 marker; 2: RT-PCR products of eSRK.



图 3 扩增 SCR的引物在核苷酸序列上的位点
Fig. 3 Sites of nucleotide sequences used as primers for SCR
箭头代表引物。Arrows indicate the primers.



图 4 SCR基因 RT-PCR电泳图
Fig. 4 Electrophoretic pattern of RT-PCR products of SCR
1: DL2000 marker; 2: SCR RT-PCR产物。
1: DL2000 marker; 2: RT-PCR products of SCR.

上述 2对内引物 PCR产物的序列聚类分析(图 5
和图 6)表明, D3材料 SRK序列与芸薹属的 S3单倍
型基本一致, 相似度达到 99.99%。而 SCR序列与芸
薹属的 S3单倍型完全一致。



图 5 eSRK基因分子进化树
Fig. 5 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of eSRK
Bo: Brassica oleracea.



图 6 SCR基因分子进化树
Fig. 6 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of SCR
Bo: Brassica oleracea.

2.2 酵母表达载体的鉴定
按照前述方法利用同源重组构建 pGADT7
eSRK 和 pGBKT7SCR 酵母表达载体。在空载质粒
pGADT7中, 通用引物 T7 Sequencing primer和 3′AD
Sequencing primer 之间约为 200 bp, 因此, 分别以
pGADT7 和 pGADT7eSRK 为模板 , 用引物对 T7
Sequencing primer和 3′AD Sequencing primer扩增时,
理论上应分别扩增出 200 bp和 1.4 kb (包含载体的
200 bp)左右的片段。实验结果和理论目标大小完全
一致(图 7)。在空载质粒 pGBKT7中没有与引物 pC3
和 pC4 相匹配的序列, 因此, 分别以 pGBKT7 和
pGBKT7SCR 为模板, 用引物 pC3 和 pC4 扩增鉴定
时, 理论上前者不能扩增出任何片段, 后者能够扩
增出 300 bp左右的片段, 实验结果和理论目标大小
同样完全一致(图 8)。测序结果表明 SRK和 SCR的
插入位点、序列和方向皆正确, 说明酵母表达载体
构建成功。
第 4期 罗 兵等: 利用酵母双杂交法检测甘蓝 SCR与 SRK之间的相互作用 583




图 7 重组质粒 pGADT7eSRK的 PCR鉴定
Fig. 7 Analysis of PCR of pGADT7eSRK
1: DL2000 marker; 2: pGADT7 PCR产物;
3: pGADT7 eSRK PCR产物。
1: DL2000 marker; 2: PCR products of pGADT7;
3: PCR products of pGADT7eSRK.



图 8 重组质粒 pGBKT7SCR的 PCR鉴定
Fig. 8 Analysis of PCR of pGADT7eSRK
1: DL2000 marker; 2: pGADT7 PCR产物;
3: pGADT7eSRK PCR产物。
1: DL2000 marker; 2: PCR products of pGADT7;
3: PCR products of pGADT7eSRK.
2.3 自激活鉴定
以 pGADT7eSRK和 pGBKT7SCR重组质粒分别
转化酵母菌 Y187和 Y2HGold, 30℃培养 3 d后, 转
化酵母Y187和Y2HGold分别在 SD/–Leu和 SD/–Trp
平板上长出白色菌落, 菌落 PCR 也能扩增出相应的
目的条带(未附图), 未转化的酵母在相应的缺陷性
固体培养基上没有菌落生长, 说明重组质粒转化酵
母成功。转化酵母 Y187 和 Y2HGold 分别在 SD/
–Leu/X-α-G 和 SD/–Trp/X-α-G 平板上长出的菌落呈
白色和淡蓝色, 而分别在 SD/–Leu/X-a-Gal/AbA 和
SD/–Trp/X-a-Gal/AbA平板上不能生长, 并且二者也
不能在 SD/–Trp/Lue 平板上生长。而阳性对照
[Y2HGold(pGBKT7-53)×Y187(pGADT7-T)]在 SD/
–Leu/X-a-Gal/AbA 和 SD/–Trp/X-a-Gal/AbA 平板上
皆有菌落生长, 并且菌落呈蓝色(表 2)。这说明 eSRK
和 SCR片段均不能自激活MEL1和 AUR1-C等报告
基因, 无自身转录激活活性。
2.4 相互作用鉴定
将质粒 pGADT7eSRK 转入酵母 Y187 记为 N1,
质粒 pGBKT7SCR转入酵母Y2Hgold记为N2 (表 3)。
以 X-α-gal 为底物对蛋白相互作用作定性检测。N1
和 N2 分别只在 SD/Leu 平板和 SD/Trp 平板上长
出菌落, 在SD/Trp/Leu平板不能长出菌落(表2和表
3)。将 N1 和 N2 结合的二倍体酵母(pGADT7eSRK×
pGBKT7SCR)记为 Y, 二倍体酵母(pGBKT7SCR×
pGADT7)、(pGADT7eSRK×pGBKT7)、(pGBKT7-
Lam×pGADT7-T)和(pGBKT7-53×pGADT7-T)分别
记为 N3、N4、N5 和 P。实验组的全部二倍体酵母
在 SD/Trp/Leu 平板上均可长出菌落(表 3), 但只有

表 2 质粒转化酵母的自激活检测
Table 2 Self-activation results of the transformed yeast strains
编号
Number
酵母菌种(质粒)
Yeast strain (plasmid)
选择培养基
Selective agar plate
菌斑
Colony
颜色
Color
SD/–Leu 有 Yes 白色 White
SD/–Leu/X-a-Gal 有 Yes 白色 White
SD/–Leu/–Trp 无 No 无 No
1 Y187(pGADT7eSRK)
SD/–Leu/X-a-Gal/AbA 无 No 无 No
SD/–Trp 有 Yes 白色 White
SD/–Trp/X-a-Gal 有 Yes 淡蓝 Light blue
SD/–Leu/–Trp 无 No 无 No
2 Y2HGold(pGBKT7SCR)
SD/–Trp/X-a-Gal/AbA 无 No 无 No
SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白色 White 3 Y2HGold(pGBKT7-53)×Y187(pGADT7-T)
SD/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA 有 Yes 蓝色 Blue
SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白色 White 4 Y2HGold (pGBKT7-Lam)×Y187(pGADT7-T)
SD/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA 无 No 无 No
584 作 物 学 报 第 37卷

表 3 酵母中 eSRK和 SCR的相互作用
Table 3 Interactions between eSRK and SCR in yeast
编号
Number
酵母菌种(质粒)
Yeast strain (plasmid)
选择培养基
Selective agar plate
菌斑
Colony
颜色
Color
SD/–Leu 有 Yes 白色 White N1 Y187(pGADT7eSRK)
SD/–Leu/–Trp 无 No 无 No
SD/–Trp 有 Yes 白色 White N2 Y2HGold(pGBKT7SCR)
SD/–Leu/–Trp 无 No 无 No
SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白色 White
SD/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA 有 Yes 蓝色 Blue
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/ 有 Yes 白色 White
Y Y2HGold
(pGBKT7SCR)×Y187(pGADT7eSRK)
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA 有 Yes 蓝色 Blue
SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白色 White N3 Y2HGold(pGBKT7SCR)× 187(pGADT7)
SD/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA 无 No 无 No
SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白色 White N4 Y2HGold(pGBKT7)×Y187(pGADT7eSRK)
SD/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA 无 No 无 No
SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白色 White
SD/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA 有 Yes 蓝色 Blue
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/ 有 Yes 白色 White
P Y2HGold(pGBKT7-53)×Y187(pGADT7-T)
SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA 有 Yes 蓝色 Blue
SD/–Leu/–Trp 有 Yes 白色 White N5 Y2HGold(pGBKT7-Lam)×Y187(pGADT7-T)
SD/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA 无 No 无 No

Y 和 P 能够在 SD/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA 平板上生
长, 并且菌落呈蓝色(表 3)。Y在 SD/–Ade/–His/–Leu/
–Trp平板上也能长出菌落(表 3), 说明在实验组Y中
的报告基因 HIS3、AUR1-C和 ADE2都被激活, Y还
能在 SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA 平板上
生长并且菌落呈蓝色(图 9), 说明 MEL1报告基因也
能被激活。说明甘蓝 D3材料的 SRK和 SCR之间存
在相互作用。



图 9 酵母中 eSRK和 SCR之间相互作用分析
Fig. 9 Analysis of the interactions between eSRK and SCR in
yeast on the SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA plate
1: eSRK×SCR; 2: SRK ×pGBKT7; 3: SCR×pGADT7; 4: eSRK;
5: SCR.
3 讨论
体内实验表明同一 S 单倍型的 SCR 与 SRK 结
合导致自花花粉萌发失败[4,23]。体外实验也证明从柱
头质膜提取的天然蛋白 SRK[4]和烟草细胞表达的融
合蛋白 SRK[13]都与同一 S单倍型的 SCR特异结合。
因此, 研究单倍型依赖的 SCR与 SRK相互作用是了
解芸薹属自交不亲和分子机理的关键。目前普遍认
为 SCR 与 SRK 的胞外结构域(eSRK)相互识别[13],
eSRK 是结合 SCR 的直接区域, 并且参与不同 S 单
倍型的识别[4,13]。在不同单倍型中, SCR与 SRK相互
结合有一些差异。烟草细胞表达的融合蛋白 eSRK6
能和 SCR6 结合, 但和 SCR13 的结合非常弱[13]。而
烟草细胞表达的融合蛋白 eSRK8不能和 SCR8结合,
融合蛋白 tSRK8(包括胞外域、跨膜结构域和部分膜
邻近结构域)与 SCR8 有很高的亲和力[14]。在 S8S8
单倍型中, SCR与 SRK紧密结合需要受体 SRK锚定
在膜上, 而在 S6S6单倍型中, 不需要受体 SRK锚定
在膜上 , 也不需要第二结合位点或其他分子的参
与。这种差异可能是由于不同单倍型中受体复合物
结构不同, 或者是受体 SRK特异结合位点不同[24]。
Shimosato 等[14]在研究 SCR 高亲和结合位点方面做
出的杰出工作也许可以解释这种不同的实验现象。
他们证明只有 SRK固定在质膜上, SRK与 SCR才能
高亲和结合。这种高亲和结合在 eSRK与 SCR之间
没有检测到, 除非固定 eSRK为二聚体形式。他们认
为二聚体的形成是 SRK 与 SCR 相互高亲和结合的重
要前提, 而膜环境能够有效地促进二聚体的形成[14]。
对于 eSRK6能和 SCR6相互结合的现象, Shimosato
第 4期 罗 兵等: 利用酵母双杂交法检测甘蓝 SCR与 SRK之间的相互作用 585


认为是高密度非移动的 eSRK 可以自发形成寡聚体
形式, 从而导致 eSRK与 SCR之间发生结合[14]。
本实验以 eSRK 片段代替 SRK 与 SCR 相互作
用。由于相同 S 单倍型的 SRK 胞外结构域(eSRK)
序列与 SLG序列具有很高的相似性[25], 为了特异扩
增 eSRK, 本实验采用巢式 PCR扩增 SRK胞外结构
域编码区序列。外引物为 pK1和 pK2 (表 1), pK1位
于起始密码子位置(图 1), 依据不同单倍型 SRK 信
号肽保守性设计。pK2位于 SRK特有的跨膜结构域
即第二外显子(表 1 和图 1)。内引物 pK3 位于 SRK
第一外显子 3′端(图 1), 依据胞外结构域(eSRK) 3′端
的保守性设计。因此, 以外引物 pK1和 pK2扩增产
物作为模板, 用内引物 pK1和 pK3可特异扩增得到
含有信号肽序列的 SRK 胞外结构域。生物体中, 信
号肽在引导蛋白质到达相应区域后就被切割, 具有
生物功能的成熟蛋白质基本都不具有信号肽序列 ,
而且信号肽的存在还可能影响蛋白质之间的相互作
用 , 故研究蛋白质间的相互作用时需要除去信号
肽。本实验依据甘蓝自交不亲和材料 D3、240、B3、
E1、230、243 和 G1(eSRK)测序结果设计兼并引物
pK4, pK4位于 SRK成熟肽起始编码位置(图 1)。故
以引物 pK1和 pK3扩增产物为模板, 用引物 pK3和
pK4就可特异扩增得到 SRK胞外结构域编码区成熟
肽序列(eSRK)。不同 S等位基因型的 SCR氨基酸序
列高度多态, 差异达 60%以上[5,13,22]。为了特异扩增
SCR的全序列, 本实验也采用巢式 PCR方法。外引
物为 PC1+PC2 (表 1), PC1 依据信号肽保守性设计,
PC2 依据 mRNA 的 ployA 特征设计(表 1 和图 4)。
由于 D3、240、B3、E1、230、243和 G1材料的 SRK
核苷酸序列与 S3、S7、S36、S64的相同或高度相似
度, 为了扩增与 SRK 相同单倍型的 SCR, PC3 依据
S3、S7、S36 和 S64 在信号肽剪切位置的保守氨基
酸而设计(图 4)。PC4 依据 PC2 设计(表 1 和图 4)。
以 PC1和 PC2的扩增产物为模板, 利用 PC3和 PC4
可特异扩增得到包括 SCR 成熟肽编码区、3′非翻译
区(3′UTR)和 polyA的序列, 但由于 SCR成熟肽编码
区与 3′非翻译区(3′UTR)之间有终止密码子, 故翻译
得到的蛋白为 SCR 成熟肽(图 4)。Exspay 在线分析
结果表明, 甘蓝 D3 的 eSRK 基因胞外结构域编码
406个氨基酸, 包含 SRK蛋白 B-Lectin结构域、SLG
结构域、PAN_APPLE结构域, 覆盖了几乎全部 SRK
蛋白成熟肽的胞外域。SCR 基因编码 58 个氨基酸,
包含 SCR蛋白家族中保守的 8个半胱氨酸和 1个甘
氨酸。这说明本实验扩增得到序列是完整的 eSRK
和 SCR成熟肽序列。D3材料 SRK序列与芸薹属的
S3 单倍型基本一致(图 5), 相似度达到 99.99%, 在
3端仅有一个氨基酸差异。而 SCR 序列与芸薹属的
S3 单倍型完全一致(图 6), 说明本实验扩增得到的
eSRK 和 SCR 是同一 S 单倍型。以上结果说明, 本
实验获得的 eSRK和 SCR可以作为研究 SRK与 SCR
之间相互识别的材料, 这为研究二者的分子作用机
理奠定了基础。
本研究证明 D3材料的全长 eSRK和 GAL4报告
基因 DNA 活化域的融合蛋白(pGADT7eSRK 猎物)
以及 SCR 和 GAL4 报告基因 DNA 结合域的融合蛋
白(pGBKT7SCR, 诱饵)都没有展现自激活现象(表
2)。将二倍体酵母 Y、N3、N4、N5 和 P 分别涂在
SD/–Leu/–Trp平板上都能长出白色菌落(表 3), 说明
这些质粒都分别成功转入了二倍体酵母。而将它们
分别转接种在 SD/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA平板上后,
只有二倍体酵母 Y 和阳性对照 P 能长出菌落, 并
且菌落呈蓝色(表 3)。说明在二倍体酵母中 , 只有
pGADT7eSRK与 pGBKT7SCR之间以及 pGBKT7-53
与 pGADT7-T之间具相互作用, 而 pGADT7eSRK与
pGBKT7、pGADT7 与 pGBKT7SCR 以及 pGBKT7-
Lam与 pGADT7-T之间都不相互作用。而且二倍体
酵母 Y 在 SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA 平
板上也能长出菌落, 并且菌落呈蓝色(表 3和图 9)。
说明在酵母双杂交体系中 eSRK和 SCR之间能紧密
结合。该结果表明本实验已成功建立了研究 SRK和
SCR 之间相互作用的酵母双杂交体系, 为研究二者
相互作用位点成功建立了技术平台, 为深入了解植
物自交不亲和分子机理奠定了基础。
酵母双杂交系统是研究蛋白质-蛋白质相互作
用的强有力工具, 可以用来检测在酵母细胞中蛋白
质-蛋白质相互作用, 分析其亲合性。本研究首次将
酵母双杂交系统应用于 SRK 与 SCR 的相互作用研
究。与原核表达系统相比, 本方法能更加真实地反
映二者在真核细胞中相互作用机制。与烟草细胞表
达系统相比 , 本方法操作更简便 , 周期更短 , 同时
不需要制备抗体, 避免了因制备抗体导致增加的实
验成本。并且本实验的结果皆以精美的菌落展示 ,
观测非常方便。本实验还首次利用 SRK的 N-端胞外
S 结构域研究其与 SCR 之间的相互作用。在以后的
试验中可以通过碱基突变或缺失突变等方式, 利用
酵母双杂交系统即可方便地确定 S 受体激酶的 SCR
识别位点或识别模体。这对于倍受关注的芸薹属自
交不亲和性的深入研究和利用, 具有重要的理论和
586 作 物 学 报 第 37卷

实际意义。
4 结论
建立了酵母双杂交法检测甘蓝 SRK 与 SCR 相
互作用的新方法, 检测到甘蓝 SRK的胞外域与 SCR
在酵母细胞内能够相互结合, 从而为研究二者的相
互识别位点以及筛选化学调控试剂等建立了研究平
台。这对深入研究 SRK 与 SCR 相互作用的分子机
制以及在农业上充分利用二者相互作用特点调控生
产等都具有重要的意义。
References
[1] Bateman A J. Self-incompatibility systems in angiosperms: III.
Cruciferae. Heredity, 1955, 9: 53–68
[2] Wheeler M J, Graaf B H J, Hadjiosif N, Perry R M, Poulter N S,
Osman K. Identification of the pollen self-incompatibility deter-
minant in Papaver rhoeas. Nature, 2009, 459: 992–995
[3] Stein J C, Howlett B, Boyes D C, Nasrallah M E, Nasrallah J B.
Molecular cloning of a putative receptor protein kinase gene en-
coded at the self-incomaptibility locus of Brassica oleracea. Proc
Natl Acad Sci USA, 1991, 88: 8816–8820
[4] Takayama S, Shimosato H, Shiba H, Funato M, Che F S, Wata-
nabe M, Iwano M, Isogai A. Direct ligand-receptor complex in-
teraction controls Brassica self-incompatibility. Nature, 2001,
413: 534–538
[5] Schopfer C R, Nasrallah M E, Nasrallah J B. The male determi-
nant of self-incompatibility in Brassica. Science, 1999, 286:
1697–1700
[6] Suzuki G, Kai N, Hirose T, Nishio T, Takayama S, Isogai A,
Watanabe M, Hinata K. Genomic organization of the S locus:
identification and characterization of genes in SLG/SRK region
of S9 haplotype of Brassica campestris (syn. rapa). Genetics,
1999, 153: 391–400
[7] Nasrallah J B, Yu S M, Nasrallah M E. Self-incompatibility
genes of Brassica oleracea: expression, isolation and structure.
Proc Nat Acad Sci USA, 1988, 85: 5551–5555
[8] Shiba H, Takayama S, Iwano M, Shimosato H, Funato M, Naka-
gawa T, Che F S, Suzuki G, Watanabe M, Hinata K, Isogai A. A
pollen coat protein, SP11/SCR, determines the pollen S-specifi-
city in the self-incompatibility of Brassica species. Plant Physiol,
2001, 125: 2095–2103
[9] Rong X-Y(荣小营), Zhu L-Q(朱利泉), Wang Y(王永), Gao
Q-G(高启国), Chen X-D(陈晓丹), Yang Y(杨洋), Wang X-J(王
小佳). Localization of MLPK and SSP genes for self-incompati-
bility of Brassica oleracea by fluorescence in situ hybridization.
Acta Agron Sin (作物学报), 2009, 35(5): 802–808 (in Chinese
with English abstract)
[10] Takasaki T, Hatakeyama K, Suzuki G, Watanabe M, Isogai A,
Hinata K. The S receptor kinase determines self-incompatibility
in Brassica stigma. Nature, 2000, 403: 913–916
[11] Gao Q-G(高启国), Song M(宋明), Niu Y(牛义), Yang K(杨昆),
Zhu L-Q(朱利泉), Wang X-J(王小佳). Test of interaction be-
tween THL1 and SRK from Brassica oleracea L. in self-incom-
patibility signaling process. Acta Agron Sin (作物学报), 2008,
34(6): 1–10 (in Chinese with English abstract)
[12] Nasrallah J B, Nasrallah M E. Pollen-stigma signaling in the
sporophytic self-incompatibility response. Plant Cell, 1993, 5:
1325–1335
[13] Kachroo A, Schopfer C R, Nasrallah M E, Nasrallah J B. Al-
lele-specific receptor-ligand interactions in Brassica self-incom-
patibility. Science, 2001, 293: 1824–1826
[14] Shimosato H, Yokota N, Shiba H, Iwano M, Entani T, Che F S,
Watanabe M, Isogai A, Takayama S. Characterization of the
SP11/SCR high-affinity binding site involved in self/nonself
recognition in Brassica self-incompatibility. Plant Cell, 2007, 19:
107–117
[15] Higashiyama T. Peptide signaling in pollen-pistil interactions.
Plant Cell Physiol, 2010, 51: 177–189
[16] Oender K, Niedermayr P, Hintner H, Richter K, Koller L, Trost
A, Bauer J W, Hundsberger H. Relative quantitation of pro-
tein-protein interaction strength within the yeast two-hybrid sys-
tem via fluorescence β-galactosidase activity detection in a high-
throughput and low-cost manner. ASSAY Drug Dev Technol,
2006, 4: 709–719
[17] Bower M S, Matias D D, Fernandes C E, Mazzurco M, Gu T,
Rothstein S, Goring D R. Two members of the thioredoxin-h
family interact with the kinase domain of a Brassica S locus re-
ceptor kinase. Plant Cell, 1996, 8: 1641–1650
[18] Gu T, Mazzurco M, Matias D D, Sulaman W, Goring D R. Bind-
ing of a novel arm repeat protein to the kinase domain of the S
locus receptor kinase. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95: 382–
387
[19] Mazzurco M, Sulaman W, Helen E, Cock J M, Goring D R. Fur-
ther analysis of the interactions between the Brassica S receptor
kinase and three interacting proteins (ARC1, THL1 and THL2) in
the yeast two-hybrid system. Plant Mol Biol, 2001, 45: 365–376
[20] Naithani S, Chookajorn T, Ripoll D R, Nasrallah J B. Structural
modules for receptor dimerization in the S-locus receptor kinase
extracellular domain. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104:
12211–12216
[21] Nishio T, Kusaba M, Sakamoto K, Ockendon D J. Polymorphism
of the kinase domain of the S-locus receptor kinase gene (SRK)
in Brassica oleracea L. Theor Appl Genet, 1997, 95: 335–342
[22] Watanabe M, Ito A, Takada Y, Ninomiya C, Kakizaki T, Taka-
hata Y, Hatakeyam K, Hinata K, Suzuki G, Takasaki T, Satta Y,
Shiba H, Takayama S, Isogai A. Highly divergent sequences of
the pollen self-incompatibility (S) gene in class-I S haplotypes of
Brassica campestris (syn. rapa) L. FEBS Lett, 2000, 473:
139–144
[23] Nasrallah M E, Liu P, Broyles S S, Boggs N A, Nasrallah J B.
Natural variation in expression of self-incompatibility in Arabi-
dopsis thaliana: implications for the evolution of selfing. Proc
Natl Acad Sci USA, 2004, 101: 16070–16074
[24] Kemp B P, Doughty J. S cysteine-rich (SCR) binding domain
analysis of the Brassica self-incompatibility S-locus receptor
kinase. New Phytol, 2007, 175: 619–629
[25] Fujimoto R, Sugimura T, Nishio T. Gene conversion from SLG
to SRK resulting in self-compatibility in Brassica rapa. FEBS
Lett, 2006, 580: 425–430