全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(4): 717−722 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由农业部公益性行业(农业)科研专项(200803056), 江苏省农业科技自主创新基金项目(CX[09]634), 江苏省重大科技支撑计划
项目(BE2008354), 江苏省产学研前瞻性联合研究项目(BY2010134)和江苏省自然科学基金项目(BK2008347)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王才林, E-mail: clwang@jaas.ac.cn, Tel: 025-84390307
第一作者联系方式: E-mail: tmengxiang@126.com, Tel: 025-84390317
Received(收稿日期): 2010-08-16; Accepted(接受日期): 2010-11-28.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00717
水稻 57H突变体 glup-t的遗传分析与基因定位
田孟祥 1,2 陈 涛 1 张亚东 1 朱 镇 1 赵庆勇 1 周丽慧 1 姚 姝 1
王艳平 1 王才林 1,*
1 江苏省农业科学院粮食作物研究所 / 江苏省优质水稻工程技术研究中心 / 国家水稻改良中心南京分中心, 江苏南京 210014; 2南京
农业大学农学院, 江苏南京 210095
摘 要: 谷蛋白是水稻胚乳中主要的贮藏蛋白, 约占总蛋白的 80%。谷蛋白最初在粗糙内质网表面以 57 kD 前体的
形式合成, 这些前体经加工转运等过程, 最终沉积在第二类蛋白体 PB-II 中, 裂解为成熟的酸碱性亚基。任一谷蛋白
转运步骤的缺陷都有可能导致谷蛋白 57 kD 前体的积累, 形成谷蛋白前体增加突变体, 即 57H 突变体。细老鼠牙是
一个 57H自然突变体, 其 57 kD谷蛋白前体增加而相应的 37~39 kD酸性和 22~23 kD碱性亚基减少, 此外, 该突变体
还表现为 13 kD醇溶蛋白大大增加。本研究以细老鼠牙与武运粳 7号、02428杂交获得的 F2群体为材料, 对 57H突
变体进行遗传分析和基因定位, 结果表明, 细老鼠牙的 57H突变性状受 1对隐性核基因控制, 暂命名为 glup-t。利用
简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)、插入缺失(insertion deletion, Indel)和酶切扩增多态性序列(cleaved ampli-
fied polymorphic sequence, CAPS)等分子标记的方法, 将该突变基因 glup-t定位在水稻第 4染色体长臂上的 CAPS4-3
与 Indel4-7、Indel4-8之间, 遗传距离均为 0.26 cM。
关键词: 水稻; 谷蛋白; 57H突变体; glup-t; 基因定位
Genetic Analysis and Mapping of glup-t Gene for 57H Mutant in Rice
TIAN Meng-Xiang1,2, CHEN Tao1, ZHANG YA-Dong1, ZHU Zhen1, ZHAO Qing-Yong1, ZHOU Li-Hui1,
YAO Shu1, WANG Yan-Ping1, and WANG Cai-Lin1,*
1 Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Jiangsu High Quality Rice R&D Center, Nanjing Branch of China National
Center for Rice Improvement, Nanjing 210014, China; 2 College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Glutelins are major storage protein and account for 80% of the total protein found in starchy endosperm in rice. They are
synthesized on rough endoplasmic reticulum as 57 kD precursors, and then processed into acidic and basic subunits in PB-II. Muta-
tion of the gene controlling the synthesis of glutelin will result in an formation with high amount of 57 kD glutelin precursor, named
57H mutant. In this study, we reported a novel rice 57H spontaneous mutant, Xilaoshuya, which showed increased amount of 57 kD
and 13 kD polypeptides, the decreased amounts of 37–39 kD and 22–23 kD polypeptides. Four F2 segregation populations derived
from crosses between Xilaoshuya and Wuyunjing 7, 02428 were used to study the inheritance and gene mapping for 57H mutant. The
results suggested that, the mutant trait in Xilaoshuya was controlled by a pair of recessive nuclear gene and designated tentatively as
glup-t. By means of molecular marker technique, the glup-t gene was mapped between CAPS4-3 and Indel4-7, Indel4-8 on the long
arm of chromosome 4, and all of the genetic distances to the three markers were 0.26 cM.
Keywords: Rice; Glutelin; 57H mutant; glup-t; Gene mapping
与其他大多数以醇溶蛋白为主的禾谷类作物不同 ,
水稻种子中积累的是大量的谷蛋白, 其含量约占胚乳总
蛋白的 80%[1]。谷蛋白最初在粗糙内质网 (endoplasmic
reticulum, ER)表面以 57 kD前体的形式合成, 此后被转运
至 ER囊腔内切除信号肽, 再经高尔基体修饰并运输沉积
在贮藏液泡的第二类蛋白体(protein bodies II, PB-II)中,
718 作 物 学 报 第 37卷
最终大量的谷蛋白前体被裂解为成熟的酸性亚基(37~39
kD)和碱性亚基(22~23 kD)[2-4]。任一谷蛋白转运步骤的缺
陷都有可能导致前体的大量积累, 形成谷蛋白 57 kD前体
含量高的突变体。这种类型的水稻谷蛋白突变体也被人们
广泛简称为 57H突变体(high amount of 57 kD, 57H), 是研
究谷蛋白转运分子机制的重要资源[5-7]。
水稻 57H的突变性状受单基因控制, 且大多为隐性。
到目前为止, 至少已经定位了 esp-2[8]、glup-1[9]、glup-2[9]、
glup-3/osvpe1 (自然突变体)[10-11]、glup-4[12]、glup-5[13]、
glup-6[14]及 glup-7[15]等 8个 57H突变基因。这些突变体中
以 esp-2和 glup-3/ osvpe1的研究较为深入, 其中 esp-2参
与了内质网中谷蛋白前体的构象折叠 [16], 而 glup-3/
osvpe1 则是在蛋白贮藏液泡中负责蛋白前体的剪切成
熟[11]。目前对于谷蛋白整个调控网络的分子机理仍缺乏
足够的了解, 发现更多的突变体将有助于这一重要问题
的深入解析。通过水稻种子总蛋白的 SDS-PAGE 电泳分
析, 我们在对江苏省农业科学院粮食作物研究所 1 000多
份种质资源的筛选中, 发现了 1份来自云南籼稻名为细老
鼠牙的 57H 自然突变体[17]。通过对该突变体的主要农艺
性状及籽粒的形态特征等观察和分析, 并利用分子标记
对其突变基因进行了定位。
1 材料与方法
1.1 供试材料
突变体材料是 57H 自然突变体细老鼠牙, 来自云南
地方籼稻品种。常规材料是江苏粳稻武运粳 7号和广亲和
性粳稻 02428。
1.2 突变体主要性状的调查
调查突变体成熟时期的主要农艺性状(株高、穗长、
单株有效穗数、一次枝梗数、二次枝梗数、结实率、千粒
重等)、籽粒形态及种子总蛋白的表型特征等。
1.3 遗传分析与定位群体的构建
2009年 3月在海南将突变体细老鼠牙与武运粳 7号、
02428配制正反交组合, 收获 F1, 同年 5月将各 F1群体种
于江苏省农业科学院粮食作物研究所试验田, 收获 F2 种
子, 即为遗传分析群体。同时也将细老鼠牙/02428 的 F2
作为突变基因的定位群体。
1.4 种子总蛋白的 SDS-PAGE电泳
参照江绍玫等[18]的方法, 稍作修改提取种子总蛋白
并用 SDS-PAGE 电泳分析。将单粒糙米用碾钵碾成极细
的粉末, 全部转入一干净的 1.5 mL eppendorf 管, 加入 15
μL β-巯基乙醇浸润 20 min, 再加 285 μL 65℃温浴的蛋白
抽提液(5 mol L−1脲, 4% SDS, 20%甘油, 100 mmol L−1
Tris-HCl, pH 6.8, 并直接在提取液中加入少量的溴酚蓝
用作电泳的指示剂), 充分涡旋数秒钟, 室温静置过夜。半
粒种子的蛋白提取方法也同单粒提取, 只是所加试剂减
半。电泳上样前离心 10 min, 取 10 μL上清液进行 SDS-
PAGE电泳(分离胶 15%, 浓缩胶 7.5%)。电泳后用考马斯
亮蓝 R-250 (0.1%考马斯亮蓝 R-250, 25%异丙醇, 10%冰
醋酸)染色约 15 min, 以脱色液(10%冰醋酸, 5%乙醇)脱色
至条带清晰可见, 用数码相机拍照。
1.5 定位植株苗的培养与 DNA的提取
将用作定位的细老鼠牙/02428的 F2种子横切为大致
等长的两部分 , 含胚部分用于植株苗的培养 , 以提取基
因组 DNA。另一不含胚部分用于总蛋白的 SDS-PAGE电
泳, 为相应植株苗提供表型数据[19]。参照 Dellaporta等[20]
的方法提取 DNA。
1.6 分子标记分析
部分 SSR 引物序列从网站(http://www.gramene.org/)
获得 , 其余分子标记自行设计 , 由上海英潍捷基贸易有
限公司合成。参照赵庆勇等[21]的 PCR体系及扩增程序。
将 SSR与 Indel标记扩增的产物在 10%的垂直板聚丙烯酰
胺凝胶上电泳约 2 h, 用 0.1%硝酸银染色, 显色后数码相
机拍照。而 CAPS标记扩增的产物则先在 37℃下进行 3~4
h酶切反应, 酶切体系为 5 μL PCR产物、5 U限制性内切
酶、1 μL 10×buffer, 以灭菌 ddH2O补足至 10 μL。将酶切
产物在 2.5%琼脂糖凝胶上电泳分离, 以溴化乙锭(EB)染
色, 在紫外凝胶成像仪上观察并拍照。
1.7 目标基因局部染色体区段的遗传作图
根据分子标记带型数据 , 具有亲本细老鼠牙和
02428的带型的植株分别赋值 1和 2, 具有双亲带型(即杂
合带型)的植株赋值 3, 未能扩出以上带型的个体以“-”表
示 , 利用 Mapmaker(EXP3.0)软件进行连锁分析 , 再用
Kosambi函数将重组率转化为遗传距离(cM)[22]。
2 结果与分析
2.1 突变体的性状特征
突变体细老鼠牙植株较高(图 1-A), 单株有效穗数、
结实率等也表现较差(表 1), 生育期较长, 约为 160 d。种
皮外观呈红棕色(图 1-B), 胚乳透明(图 1-C)。种子总蛋白
的 SDS-PAGE 电泳发现, 除具有谷蛋白前体增加和酸碱
性亚基减少等特征外, 13 kD 醇溶蛋白含量显著升高, 突
变体的谷蛋白含量较低 , 仅约占胚乳总蛋白的 33.1%~
42.3%[17]。
表 1 突变体细老鼠牙的主要农艺性状
Table 1 Agronomic traits in the mutant Xilaoshuya
性状
Trait
数值
Value
株高 Plant height (cm) 212.6±4.81
穗长 Panicle length (cm) 30.6±4.87
单株有效穗数 No. of productive panicles per plant 6.8±1.17
一次枝梗数 Primary branch number 12.4±2.19
二次枝梗数 Secondary branch number 26.9±1.32
结实率 Seed setting percentage (%) 72.9±10.56
千粒重 1000-grain weight (g) 26.4±0.52
第 4期 田孟祥等: 水稻 57H突变体 glup-t的遗传分析与基因定位 719
图 1 细老鼠牙的性状
Fig. 1 Trait of Xilaoshuya
A: 细老鼠牙成熟期; B: 细老鼠牙籽粒糙米; C: 细老鼠牙籽粒精米。
A: Xilaoshuya at maturity stage; B: brown rice of Xilaoshuya;
C: milled rice of Xilaoshuya.
2.2 57H突变体的遗传分析
为了明确 57H 突变体细老鼠牙的遗传特性, 利用细
老鼠牙分别与广亲和粳稻品种 02428以及武运粳 7号进行
正反交, 配制了 4个杂交组合。经种子总蛋白的 SDS-
PAGE电泳检测后发现, 所有杂交组合的 F1均表现为谷蛋
白正常的野生型, 即 02428或武运粳 7的带型。而在各组
合 F1自交获得的 F2种子中, 野生型植株与突变型植株的
分离比均为 3 1∶ (χ2c<χ20.05=3.84; 表 2), 表明该突变性
状由一对隐性的核基因控制。部分 F2种子总蛋白的 SDS-
PAGE电泳图谱见图 2。
2.3 突变基因的初步定位
以细老鼠牙/02428 的 F2隐性单株作为定位群体, 而
隐性单株需通过蛋白表型来鉴定 , 其方法有两个 , 一是
通过 F3种子蛋白的表型来推测 F2的表型; 另一是把 F2种
子横切为大致等长的两部分, 含胚部分用于培养植株苗,
剩下部分用于蛋白电泳为相应植株提供表型数据, 即半
粒法。后一种方法工作量小且周期短, 但半粒培苗不易,
通过多次试验, 我们成功解决了这个难题。此次定位采用
了半粒法。
先用本实验室较均匀分布于水稻 12 条染色体上的
543 多对微卫星(SSR)标记对亲本细老鼠牙和 02428 进行
多态性筛选, 其中 172对引物在两亲本中表现多态, 多态
率为 31.68%。将有多态的 SSR 引物对 92 株隐性个体进
行扩增, 并利用 Mapmaker 3.0/EXP软件对检测结果进行
分析, 发现第 4染色体上的 RM471、RM3367和 RM1113
与目标基因表现出连锁关系, 其中 RM471 与 RM3367 位
于目标基因的同侧, 而 RM113居于目标基因的另一侧,这
3个标记的顺序和已定位的数据相一致, 距目标基因遗传
距离分别为 36.90、14.97和 38.50 cM, 暂命名为 glup-t。
在此基础上, 合成了目标区域内已公布的 14个 SSR标记,
检测到 RM3735 与 RM5714 标记在亲本间存在多态, 再
表 2 F1性状表现及 4个 F2群体分离情况
Table 2 Performances of F1 and segregation data for four F2 populations
F2 组合
Cross combination
F1 正常谷蛋白
Normal
57 kD谷蛋白前体增加
Increase amount of 57 kD
总数
Total
χ2
(3:1) P
02428/细老鼠牙 02428/Xilaoshuya 谷蛋白正常 Normal 291 109 400 0.96 0.25–0.50
细老鼠牙/02428 Xilaoshuya/02428 谷蛋白正常 Normal 308 92 400 0.75 0.25–0.50
武运粳 7号/细老鼠牙 Wuyunjing 7/Xilaoshuya 谷蛋白正常 Normal 312 88 400 1.76 0.10–0.25
细老鼠牙/武运粳 7号 Xilaoshuya/Wuyunjing 7 谷蛋白正常 Normal 304 96 400 0.16 0.50–0.75
图 2 细老鼠牙/02428的部分 F2总蛋白的 SDS-PAGE分析
Fig. 2 SDS-PAGE analysis of total protein in partial individuals in F2 of Xilaoshuya/02428
M: 蛋白质分子量标准; P1: 02428; P2: 细老鼠牙; ﹟: F2的隐性个体。
M: protein marker; P1: 02428; P2: Xilaoshuya; ﹟: recessive individuals in F2.
720 作 物 学 报 第 37卷
利用这两个标记对 92 个隐性个体进行分析, 将 glup-t 突
变基因初步定位于这两个标记之间, 与这 2个标记的遗传
距离分别为 2.22 cM和 2.81 cM (图 3-A)。
2.4 突变基因的精细定位
为了更好地精细定位突变基因 glup-t, 将定位的隐
性个体数由初定位的 92 株扩大到 388 株, 并根据初定位
标记 RM 3735与 RM 5714之间的日本晴 BAC克隆序列
开发了 22对 SSR标记, 检测发现仅有 T 4-21标记在两个
亲本间存在多态性, 所得标记不能满足定位需要。我们又
先后设计了 16个标记(1个 SSR、12个 Indel及 3个 CAPS),
筛选后获得 4对多态性标记, 分别为 T 4-23、Indel 4-7、
Indel 4-8和 CAPS 4-3 (表 3)。用这 5对标记对 388个隐性
单株进行检测, 标记 T 4-23、CAPS 4-3重组单株数分别
为 4 个和 2 个, 且各标记重组单株呈包含关系; 标记 T
4-21重组单株数为 3个, 而 Indel 4-7、Indel 4-8重组单株
数均为 2个, 且前者重组单株个数亦包含后两者(图 3-B)。
CAPS 4-3表现为重组基因型的单株在 Indel 4-7、Indel 4-8
标记处则表现为非重组基因型, 反之亦然。通过相关软件
分析, 最终将 57H 突变基因 glup-t 定位于 BAC 克隆
OSJNBa0091D06的 Indel 4-7、Indel 4-8和 CAPS 4-3分子
标记之间, 这 3 个标记与目标基因的遗传距离均为 0.26
cM, 覆盖 115 kb的物理距离(图 3-B)。
表 3 本研究中开发的亲本间有多态性的分子标记
Table 3 Primer sequences of the polymorphic molecular markers developed in this study
标记
Marker
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
片段大小
Fragment size (bp)
F TTCTATTTGCTGCACCATGC T4-21
R ACACCGGAGACTTGGAACAC
145
F AGTTGTGGAATGGGGCTTTT T4-23
R CTGTCTTCTCGTAACCACCC
137
F CTCACCTCCGTCCATCTTGT Indel4-7
R GTGTGATTTTGGGCTCTTGG
145
F CACTCCGTTGTTCTCCATCA Indel4-8
R TGAATATGAACAGGTGGTGC
127
F CTGCTTTTGTTTCGGTGTGA ﹟CAPS4-3
R GAGTATTGGAAGCGGCGTTA
309
F: 正向引物; R: 反向引物; ﹟: 内切酶 Sac II。F: forward primer; R: reverse primer; ﹟: restriction enzyme Sac II.
图 3 细老鼠牙中突变基因的定位
Fig. 3 Mapping of mutated gene in Xilaoshuya
A: 突变基因被定位到第 4染色体长臂 SSR标记 RM3735和 RM5714之间。B: 细老鼠牙中突变基因的精细定位。
连锁图下标注的数字为重组的单株数。
A: the mutated gene was mapped between markers RM3735 and RM5714 on the long arm of chromosome 4. B: high-resolution mapping of the mu-
tated gene in Xilaoshuya. The number of recombinants is indicated below the map.
3 讨论
水稻 57H 突变体的研究始于日本, 现已有 8 个 57H
突变基因被定位。从总蛋白的表型特征来看, 除具有 57
kD 前体增加外, 已报道的各个 57H 突变体不尽相同。
glup-1、glup-2 高量蓄积谷蛋白前体, 但成熟的酸碱性亚
基却没有明显的变化, 还减少了 26 kD球蛋白的蓄积[7, 9];
glup-3除了高量蓄积谷蛋白前体、少量蓄积成熟型谷蛋白
亚基之外 ,并没有减少其他贮藏蛋白质的蓄积 [7, 10, 23];
esp-2、glup-4、glup-5、glup-6 和 glup-7 不仅高量蓄积谷
第 4期 田孟祥等: 水稻 57H突变体 glup-t的遗传分析与基因定位 721
蛋白前体、少量蓄积成熟型谷蛋白的酸碱性亚基, 而且显
著减少了 13 kD醇溶谷蛋白 b组分和 26 kD球蛋白的蓄
积[7-8,13,15,24-25]。这些 57H突变体不同的蛋白特征, 可能是
突变基因所参与的蛋白调控机制不同所致。
相关基因克隆和功能研究有助于了解蛋白合成及调
控的分子生物学机理, 包括 ER中蛋白的折叠、转运以及
前体在蛋白体中的剪切成熟等。拟南芥中通过一系列的贮
藏蛋白前体增加突变体鉴定出了多个贮藏蛋白生物合成
途径的调控基因, 如 AtELP[26]、AtVSR1[27-28]、AtVPS29[29]、
MAIGO2[30]、KAM2/GRV2[31]及 βVPE[32]等。比起拟南芥,
水稻在这方面的研究显得逊色颇多, 虽然已有多个基因
被定位, 但仅有 esp-2和 osvpe1等少数几个的研究较为透
彻。 esp-2 突变体缺失了蛋白质二硫键异构酶 (protein
disulfide isomerase, PDI), 并产生了大量的小的蛋白体 ,
该蛋白体中同时包含谷蛋白前体和富硫醇溶蛋白, 且这
两种蛋白以二硫键的形式交联在一起, 影响了谷蛋白前
体的折叠。与 esp-2不同, osvpe1是一个液泡加工酶基因,
它特异识别谷蛋白前体 306 位天冬酰胺并在其碳端将前
体剪切形成成熟的酸碱性亚基, 在 osvpe1 突变体中, 在
外显子区域发生了单核苷酸的突变, 导致 269位的半胱氨
酸变为甘氨酸 , 产生了基因突变 , 因此在该突变体中谷
蛋白前体不能被有效剪切。esp-2与 osvpe1的突变均导致
水稻谷蛋白前体的大量积累, 从蛋白调控位置来看, esp-2
位于内质网中, 处于调控网络的上游, 而 osvpe1 位于蛋
白贮藏液泡中 , 处于下游 , 目前尚未发现有影响蛋白转
运的突变体的报道。
本实验室筛选到的 57H 突变体细老鼠牙, 与已报道
的突变体略有不同, 除具有高含量的 57 kD前体和低含量
的酸碱性谷蛋白亚基外, 其 13 kD的醇溶蛋白显著增加。
其突变性状由 1对隐性核基因控制, 该突变基因 glup-t在
水稻第 4 染色体的长臂上, 位于标记 CAPS 4-3 与 Indel
4-7、Indel 4-8之间, 与 3个标记的遗传距离均为 0.26 cM,
覆盖了 115 kb的物理距离。经对比发现, 在该区域内已报
到了一个 57H基因 glup-3/osvpe1 (约 4 414 bp)[10-11], 本研
究定位的 glup-t 是否与其具等位性尚待进一步研究。但
glup-t的 13 kD的醇溶蛋白显著增加, 而 glup-3/osvpe1是
否也具有相同的表型尚未报道。种子蛋白质测定显示, 在
该突变体中, 谷蛋白的含量仅约为 33.1%~42.3%, 与低谷
蛋白种质 lgc-1 (约 34.4%~46.5%)的谷蛋白含量相当, 可
作为低谷蛋白种质资源加以利用[17]。因此, 突变体 glup-t
无论对理论研究还是育种工作都具有重要的意义。
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