全 文 ：　　
第26卷 第3期 作　物　学　报 V ol. 26, N o. 3
2000 年5月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ay, 2000
B t 转基因水稻“克螟稻”杂交后代二化螟抗性研究初报X
王忠华1　舒庆尧1, 3 　崔海瑞1　叶恭银2　吴殿星1　高明尉1
夏英武1　成雄鹰3　 Illim ar A ltosaar3
(1浙江大学原子核农业科学研究所, 浙江杭州　310029; 2 浙江大学植物保护系, 浙江杭州　310029; 3 加拿大渥太华大学
生物化学系, 加拿大渥太华 K IN 6N 5)
提　要　利用室内叶片快速鉴定法结合田间抗性调查, 研究了粳型B t 转基因水稻“克螟稻”与籼、粳稻
杂交后代对二化螟 (Chilo sup p ressalis) 的抗性。结果显示, 在与籼稻和粳稻的杂交后代 (F 1、F 2和BC1)
中, 都出现了对二化螟表现高抗的植株。用离体叶片法测定, 4个组合120株杂种 F 1和88株 GU S 阳性
(GU S+ )BC1株与30株克螟稻亲本相似, 2天内对二化螟初孵幼虫的死亡率高达100. 0% , 而用相应组合
的 GU S 阴性 (GU S- ) 株和非转基因亲本叶片饲喂的二化螟初孵幼虫4天内的死亡率仅为8. 33%～ 22.
8%。此外, 在未施用对鳞翅目害虫有毒性的农药的试验田, 共调查8个组合707株 GU S+ F 2植株和7个
组合177株 GU S+ BC1植株, 仅有大约1% 的植株出现枯心和白穗; 而对应的405株 F 2和182株BC, GU S-
株中分别有99. 3% 和99. 5% 出现了枯心。本实验的结果表明, 应用杂交、回交常规育种方法将克螟稻
的抗虫基因导入到新的推广水稻品种是可行的; 同时也反映了报告基因 GU S 仍可作为检测 cry lA b 的
简便而有效的手段。
关键词　B t 水稻; 克螟稻; cry lA b 基因; 二化螟抗性
Resistance of Progen ies from Crosses between B t Tran sgen ic R ice and
Conven tiona l R ice Var ieties to Str ipe Stem Borer Chilo supp ressa lis
WAN G Zhong2H ua1　SHU Q ing2Yao1　CU I H ai2R ui1　YE Gong2Yin2　WU D ian2X ing1　
GAO M ing2W ei1　X IA Ying2W u1　CH EN G X iong2Ying3　 Illim ar A lto saar3
(1 Institu te of N uclear A g ricultural S ciences, Z hej iang U niversity , H ua J ia Chi, H angzhou 310029; 2D epartm ent of P lant P ro2
tection, Z hej iang U niversity , H ua J ia Chi, H angzhou 310029; 3D epartm ent of B iochem istry , U niversity of O ttaw a, O ttaw a
K IN 6N 5 Canad a)
Abstract　L aborato ry bioassay and field evaluation w ere conducted to investigate the resistance
to stripe stem borer (SSB, Ch ilo sup p ressalis) of the p rogen ies of transgen ic rice lines KM D 1 and
KM D 2 con tain ing cry lA b gene crossed to conven tional rice varieties. T he results indicated that,
there w ere p lan ts w ith h igh resistance to SSB in all p rogen ies of F 1, F 2 and BC1 from crosses of
transgen ic rice to bo th indica and japon ica rice. U sing cut leaf feeding test, new ly hatched larvae
died 100. 0% w ith in 2 days w hen fed leaf tissues of 120 F 1 and 88 GU S positive BC1 p lan ts,
w h ile on ly 8. 3% to 22. 8% larvae died even by the fourth day fed leaf tissues from GU S negative
con tro l p lan ts. In the field w ithout pesticide sp ray, about 99% of 177 GU S positive BC1 p lan ts
X 浙江省科委“九五”重大项目和美国洛克菲勒基金资助项目 (RF97001# 556) , 3 通讯作者
收稿日期: 1998210207, 接收日期: 1999206221

and 707 GU S positive F 2 p lan ts w ere no t dam aged by SSB , w h ile 99. 3% and 99. 5% of GU S
negative F 2 (405) and BC1 (182) p lan tsw ere found w ith dead heart (s) , respectively. T he results
indicated that it is possible to in troduce transgene cry lA b in to o ther comm ercial varieties th rough
crosses and back crosses, and GU S assay could be a simp le m ethod to mon ito r cry lA b gene ex2
p ression and assist selection fo r resistan t p lan ts.
Key words　T ransgen ic rice; cry lA b; R esistance; Ch ilo sup p ressalis
自80年代中期以来, 利用转基因技术将苏云金杆菌杀虫蛋白基因 (简称B t 基因) 导入农
作物, 使其获得抗虫性的研究已取得巨大进展, B t 玉米、B t 棉花、B t 马铃薯等已开始商业化
应用[ 1, 2 ]。在水稻中, 也已有不少获得B t 转基因抗虫植株的报道, 如转 cry lA a 植株[ 3 ] , 转
cry lA b 植株[ 4～ 7 ], 转 cry lA c 植株[ 7, 8 ]。笔者利用农杆菌介导法成功地将密码子经过优化的B t
基因 cry lA b 导入了多个水稻品种[ 9 ] , 并从粳稻品种秀水11的转基因后代中获得了遗传稳定且
对二化螟等7种鳞翅目害虫表现高抗的B t 转基因抗虫水稻“克螟稻”[ 9～ 11 ]。能否将克螟稻的高
抗性通过常规杂交育种方法转移到其它推广品种中是直接影响克螟稻利用价值的重要方面,
也是在转基因作物育种中需要加以明确的重要内容, 但迄今少见这类报道, 本实验对此作了
探索。
1　材料与方法
1. 1　亲本材料
本试验用于杂交转育的克螟稻由晚粳稻品种秀水11的2个R 0转基因植株培育而成, 其遗
传转化和纯系培育过程见笔者的相关报道[ 9, 10 ]。克螟稻中含串联排列的 cry lA b、g us (编码 B2
葡糖苷酸酶) 和 hp t (编码潮霉素磷酸转移酶) 等基因[ 10, 11 ]。1997年用于杂交时, 2份克螟稻材
料尚处于较低世代, 其中克螟稻1号 (简称 KM D 1) 当年编号为 PR 16, 为R 3代纯合株系) ; 克
螟稻2号 (简称 KM D 2) 当年编号为 TR 77, 为R 2代纯合株系。
与克螟稻杂交的感虫亲本有: 早籼稻浙辐504、浙辐123、嘉早935; 晚粳稻秀水63、丙
9402、丙9331; 籼型杂交稻保持系龙特甫B、˚ 32B; 籼型恢复系明恢77、密阳46。
1. 2　杂交后代培育
杂交时, 选取正处于开花期的稻穗, 用44 ℃温水去雄, 再用克螟稻花粉授粉。回交时,
由于多数籼粳交 F 1代为高度不育, 因此用作母本, 感虫品种用作父本。在开花前对 F 1代植株
进行 GU S 测定, 选用 GU S 阳性株作回交和自交留种。
1. 3　GUS 测定
GU S 反应用叶片法测定, 方法参照R ueb 等[ 12 ]。
1. 4　抗虫性测试
二化螟抗性鉴定分室内测定和田间抗性调查2种。室内采用由笔者建立的离体叶片快速
测法加以测定。即在分蘖盛期剪取3～ 4 cm 长的叶片, 放入小试管, 在叶片两端各用一小片
浸有100 LL ö L 苯骈咪唑的滤纸, 以保持叶片新鲜。试管用脱脂棉花塞口, 以利气体交换。每
个试管接3～ 5头二化螟初孵幼虫, 接虫后第2天和第4天检查食叶面积和幼虫死亡率。
田间抗性是在不喷防治鳞翅目害虫的农药的田块, 通过考察稻苗的枯心数评价植株对二
化螟的抗性程度, 试验于1998年在学校实验农场完成。
1133期　　　　　　　　王忠华等: B t 转基因水稻“克螟稻”杂交后代二化螟抗性研究初报　　　　　　　　　

2　结果与分析
2. 1　F1植株的抗性
由表1可见, 与感虫亲本相比, KM D 2 对二化螟毒杀作用明显, 表现为第2天时, 就达到
100. 0% 的幼虫死亡率和极小的食叶面积。因为幼虫在第2天就已全部死亡, 因此 KM D 2食叶
面积在第2天后没有变化。相反, 饲喂亲本品种叶片的幼虫在第2天基本没有死亡, 第4天时的
死亡率以浙辐504最高, 但也仅12. 67%。
表1　　克螟稻 KMD 2与常规水稻品种杂种 F1植株叶片对二化螟初孵幼虫的毒性
Table 1　　Leaf tissue tox ic ity of F1 plants between KMD 2 and conventional r ice var ieties to newly hatched larvae
of str iped stem borer (Chilo suppressa l is)
材料
M aterials
检测株数
No. of
tested p lants
食叶面积 L eaf tissue area consum ed
(mm 2 ö larva)
2d 4d
幼虫死亡率 L arvae
mortality (% )
2d 4d
浙辐504 Zhefu 504 15 3. 67±0. 24 12. 67±1. 18 0. 0 0. 0
Zhefu 504 ö KMD 2 F1 30 0. 17±0. 07 0. 17±0. 07 100. 0 100. 0
秀水63 Xiushui 63 15 4. 61±1. 02 10. 00±1. 69 0. 0 11. 1
Xiushui 63 ö KMD 2 F1 30 0. 14±0. 09 0. 14±0. 09 100. 0 100. 0
˚ 32B 15 5. 24±1. 60 9. 37±2. 23 0. 0 11. 1
˚ 32B ö KMD 2 F1 30 0. 14±0. 07 0. 14±0. 07 100. 0 100. 0
明恢77 M inghui 77 15 5. 72±0. 69 10. 39±1. 27 0. 0 0. 0
M inghui 77 ö KMD 2 F1 30 0. 12±0. 06 0. 12±0. 06 100. 0 100. 0
KMD 2 30 0. 21±0. 10 0. 21±0. 10 100. 0 100. 0
　　所有克螟稻与常规感虫品种的杂交 F 1植株都表现出了与 KM D 2相似的毒性。第2天的幼
虫死亡率都达到了100. 0% , 同时平均食叶面积比 KM D 2更小, 而常规品种植株接虫4天
表2　　克螟稻与常规水稻品种杂交 F2代植株的田间二化螟抗性 (杭州, 1998)
Table 2　　F ield resistance to str iped stem borer (Chilo supp ressa lis) of F2 plants of crosses
between Bt transgen ic r ice and conventional r ice var ieties (Hangzhou, 1998)
杂交组合
Crosses
GU S 阳性株
GU S positive p lants
调查株数
No. of
observed
带枯心株数 (% )
No. w ith dead
heart ( s)
GU S 阴性株
GU S negative p lants
调查株数
No. of
observed
带枯心株数 (% )
No. w ith dead
heart ( s)
浙辐504 Zhefu 504 ö KMD 1 76 0 (0. 0) 53 52 (98. 1)
浙辐123 Zhefu 123 ö KMD 1 84 1 (1. 2) 53 53 (100. 0)
嘉早935 J iazao 935 ö KMD 1 67 2 (3. 0) 66 65 (98. 5)
丙9402 B ing 9402 ö KMD 1 139 2 (1. 4) 46 46 (100. 0)
浙辐504 Zhefu 504 ö KMD 2 93 1 (1. 1) 73 73 (100. 0)
浙辐123 Zhefu 123 ö KMD 2 87 0 (0. 0) 45 44 (95. 6)
嘉早935J iazao 935 ö KMD 2 107 1 (0. 9) 36 36 (100. 0)
秀水63 Xiushui 63 ö KMD 2 54 0 (0. 0) 32 32 (100. 0)
小计 Subto tal 707 7 (1. 0) 405 402 (99. 3)
KMD 1 150 0 (0. 0) - -
KMD 2 150 0 (0. 0) - -
秀水11 Xiushui 11 - - 150 120 (80. 0)
后幼虫死亡率仅为11.
1%。F 1的平均食叶面
积第2天时, 仅为常规
品种的 1 ö 48～ 1 ö 21,
第4天时则更小至1 ö 65
以下。
2. 2　F2植株的田间抗
性
1998 年夏, 在杭
州田间自然发虫条件
下, 对8个杂交 F 2群体
受二化螟为害的情况
作了调查, 结果见表
2。由于自秧田期起就
未施任何农药, 因此
二化螟为害十分严重。
对照秀水11每丛枯心
数最多的达6个, 带枯心植株的比例高达80. 0% , 而克螟稻亲本未受螟虫为害 (表2)。在杂交
213　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26卷

F 2代群体中, GU S 阳性株在田间表现很强的抗虫性, 仅少量植株出现了枯心, 带枯心植株率
平均仅为1. 0% ; 而 GU S 阴性株则表现很强的感虫性, 每丛水稻枯心数高的达8个以上, 带枯
心植株率平均高达99. 3% (表2)。
2. 3　BC1植株的抗性
2. 3. 1　室内快速鉴定　　与 F 1植株一样, 利用叶片速测法对BC1植株对二化螟的毒性进行
了快速鉴定, 结果见表3。BC1群体中 GU S+ 株与 F 1及克螟稻供体亲本一样, 对二化螟初孵幼
虫具有100% 的毒杀作用, 食叶面积平均仅为0. 33mm 2, 而 GU S- 植株表现很强的感虫性, 接
虫4天后死亡率仅为15. 3% , 食叶面积平均高达10. 21 mm 2。
表3　　克螟稻与常规水稻品种的 BC1植株叶片对二化螟初孵幼虫的毒性
Table 3　　Leaf tissue tox ic ity of BC1 plants between Bt transgen ic r ice and conventional r ice var ieties
to newly hatched larvae of str iped stem borer (Chilo supp ressa lis)
回交组合
Backcrosses
GU S 反应
Reaction
植株数
No. of
p lants
食叶面积　L eaf tissue area
consum ed (mm 2 ö larva)
2d 4d
幼虫死亡率　L arvae
mortality (% )
2d 4d
ZF504 ö KMD 2 GU S+ 30 0. 38±0. 15 0. 38±0. 15 100. 0 100. 0
∥ZF504 GU S- 30 5. 62±1. 65 10. 21±2. 85 1. 7 8. 3
JZ935 ö KMD 2 GU S+ 10 0. 16±0. 07 0. 16±0. 07 100. 0 100. 0
∥JZ935 GU S- 9 5. 30±1. 40 10. 76±3. 43 7. 0 14. 8
ZF 504 ö KMD 1 GU S+ 30 0. 44±0. 12 0. 44±0. 12 100. 0 100. 0
∥ZF 504 GU S- 30 5. 57±1. 76 10. 29±3. 14 7. 4 17. 5
L TH ö KMD 1∥ GU S+ 18 0. 16±0. 06 0. 16±0. 06 100. 0 100. 0
L TH GU S- 19 6. 68±2. 69 9. 80±3. 73 7. 0 22. 8
总计 Total GU S+ 88 0. 33±0. 11 0. 33±0. 11 100. 0 100. 0
GU S- 88 5. 80±1. 89 10. 21±3. 20 5. 3 15. 3
　　ZF504: 浙辐504 Zhefu 504; JZ935: 嘉早935 J iazao 935; L TH: 龙特甫B Long2Te2Fu B
表4　　Bt 克螟稻与常规水稻品种回交一代植株的田间二化螟抗性 (杭州, 1998)
Table 4　　F ield resistance to str iped stem borer (Chilo supp ressa lis) of BC1 plants of
crosses between Bt transgen ic r ice and conventional r ice var ieties (HangZhou, 1998)
回交组合
Back crosses
GU S 阳性株 GU S positive p lant
调查株数
No. of
observed
带枯心株数%
No. w ith dead
heart ( s)
GU S 阴性株 GU S negative p lant
调查株数
No. of
observed
带枯心株数 (% )
No. w ith dead
heart ( s)
ZF 504 ö KMD 1∥ZF 504 57 2 (3. 5) 59 58 (98. 3)
ZF 123 ö KMD 1∥ZF 123 3 0 (0. 0) 3 3 (100. 0)
JZ 935 ö KMD 1∥JZ 935 11 0 (0. 0) 12 12 (100. 0)
L TH ö KMD 1∥L TH 21 0 (0. 0) 20 20 (100. 0)
M Y 64 ö KMD 1∥M Y 46 21 0 (0. 0) 23 23 (100. 0)
ZF 504 ö KMD 2∥ZF 504 56 0 (0. 0) 56 56 (100. 0)
JZ 935 ö KMD 2∥JZ935 8 0 (0. 0) 9 9 (100. 0)
小计 Subto tal 177 2 (1. 1) 182 181 (99. 45)
KMD 1 150 0 (0. 0) - -
KMD 2 150 0 (0. 0) - -
秀水 11 Xiushui 11 - - 150 120 (80. 0)
　　ZF 504: 浙辐504 Zhefu 504; JZ 935: 嘉早935 J iazao 935; M Y46:
密阳46 M iyang 46; L TH: 龙特甫B Long2Te2Fu B
2. 3. 2　田间抗螟
性　　在不喷农药
的条件下, 对回交
一代植株的田间抗
性进行了调查。由
表4可见, 回交一
代 GU S 阳性株枯
心率仅为 1. 1% ,
而 GU S 阴性株枯
心率高达99. 45%。
由此表明, 回交一
代植株与克螟稻亲
本一样, 对二化螟
具有极强的毒杀作
用。
3133期　　　　　　　　王忠华等: B t 转基因水稻“克螟稻”杂交后代二化螟抗性研究初报　　　　　　　　　

3　讨论
运用转基因技术将重要性状的基因, 如本实验的 cry lA b 基因, 导入水稻的意义, 一方面
决定于转化株及其自交后代的表达水平是否达到预期的目标, 另一方面则在于该转基因能否
通过和其它同种乃至近缘种的品种杂交、回交, 培育出新的品种。这是因为, 一方面, 转基因
植株本身往往由于体细胞变异等原因农艺性状会变差, 影响其直接利用价值[ 13～ 15 ]; 另一方
面, 目前的转基因技术在转化生产上应用的品种时成功率较低, 很难获得转化植株, 因此,
应用杂交育种技术将目的基因转移到推广品种中常常是必需的环节。本实验用笔者已经获得
的B t 水稻克螟稻株系KM D 1和KM D 2为材料与常规水稻品种杂交, 对其后代的抗虫性进行了
分析, 以明确克螟稻中 cry lA b 基因的利用价值。据笔者所知, 这是国内、外首次在转基因水稻
中所作的这类试验。
从本实验的结果看, 所有 F 1和 F 2、BC1群体中的绝大多数 GU S 阳性株都保持了转基因亲
本的抗二化螟特性, 这一方面表明转基因与水稻中的固有基因一样, 可通过杂交、回交等手
段进行转育, 另一方面也表明 KM D 1、KM D 2是两份利用价值很高的抗螟虫种质资源。F 1代
植株所具有的与 KM D 1、KM D 2相似的抗虫性表明, 只要育成一个抗虫杂交亲本, 如不育系
或恢复系, 通过配组即可获得抗虫的杂交稻组合。
从本试验的结果还可看出, 杂交后代植株中报告基因 GU S 和目的基因 cry lA b 表现为紧
密连锁遗传和协同表达, 这为 cry lA b 基因的间接选择奠定了基础。也就是说, 根据 GU S 反
应特性, 在苗期即可剔除不含 cry lA b 基因的植株, 从而大大提高育种效率。
在本试验所用的非转基因亲本中, 一些品种如浙辐123等, 虽然没有做详细的抗性测定,
但据笔者的日常观察, 这些品种与浙辐504、˚ 32B 等一样对二化螟是高感的。国内、外也已
有很多学者对现有水稻的种质进行筛选, 但未发现抗二化螟的材料[ 16, 17 ]。由此可见, 在克螟
稻与这些品种的杂交后代中出现的抗二化螟植株的抗性基因应是来自克螟稻。
参　考　文　献
1　Krattiger A F, Insect R esistance in C rops: a Case S tud y of B acillus T huring iensis (B t) and its T ransf er to D evelop ing Coun2
tries. ISAAA B riefs No. 2. ISAAA : Ithaca, N Y. 1997, 42
2　舒庆尧, 吴　刚, 崔海瑞等. 程家安, 周伟军主编, 跨世纪农业研究, 北京: 中国环境科学出版社, 1998, 392～ 399
3　谢道听, 范云六, 倪丕冲. 中国科学 (B 辑) 1991, 21 (8) : 830～ 834
4　Fujimoto H , K Itohet, M Yam amoto et al, B ioö T echnology , 1993, 11: 1151～ 1155
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