全 文 ：第26卷 第2期 作　物　学　报 V o l. 26, N o. 2
2000 年3月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ar. , 2000
我国主要杂交水稻亲本的 RAPD 鉴定及遗传关系研究X
李云海　钱　前　曾大力　孙宗修
(中国水稻研究所农业部水稻生物学重点实验室, 浙江杭州, 310006)
提　要　用100个 RA PD 引物分析了具有广泛遗传资源代表性和较大应用面积的24个水稻雄性不育
系、3个保持系和3个生产中应用最广的恢复系。其中72个引物具有多态性。从中筛选出14个RA PD 引
物, 可检测出重演性较好的多态性片段47带, 能够有效地区分所有供试的雄性不育系及恢复系。杂交
水稻亲本的聚类分析结果表明: (1) 我国水稻雄性不育系遗传资源比较丰富, 但生产中主要应用的不
育系遗传背景单一。(2) 在籼稻内部, 不育系的遗传变异较恢复系少。(3) 应用面积较大的恢复系与雄
性不育系分别聚类于不同的类群, 且遗传关系较远。
关键词　杂交水稻亲本; RA PD; 遗传关系
Iden tif ica tion by RAPD Ana lys is and Stud ies on Genetic Rela tion sh ip
of M a in Paren ts of Hybr id R ice in Ch ina
L I Yun2H ai　Q IAN Q ian　ZEN G D a2L i　SUN Zong2X iu
(K ey L ab. f or R ice B iology , M inistry of A g ricu ltu re, P. R. Ch ina, Ch ina N ationa l R ice R esearch Institu te, H ang z hou,
Z hej iang 310006)
Abstract　Tw en ty fou r m ale sterile lines, th ree m ain ta iner lines and th ree resto re lines u sed
w idely in hyb rid rice w ere ana lyzed by RA PD w ith 100 random p rim ers. Seven ty tw o p rim ers
detected po lym o rph ism am ong rice lines tested. Fou rteen p rim ers w ere selected from them.
T hese fou rteen p rim ers cou ld detect 47 rep roducib le po lym o rph ism fragm en ts, by w h ich the
above resto re and m ale sterile lines w ere d ist ingu ished ind ividua lly. T hey w ere, therefo re,
recomm ended as candida tes fo r the iden t if ica t ion am ong m ale sterile lines、resto re lines and
hyb rids in rice. A s resu lts from clu ster ana lysis, it w as concluded: (1) R ice m ale sterile
lines have abundan t genet ic d iversity in ou r coun try. Genet ic background w as vu lnerab le a2
m ong rice m ale sterile lines u sed in la rge sca le. (2) In ind ica rice, genet ic varia t ion of the re2
sto re lines w as la rger than tha t of the m ale sterile lines. (3) T he resto re lines w ere clearly
clu stered apart from the m ale sterile lines.
Key words　Paren ts of hyb rid rice; RA PD; Genet ic rela t ion sh ip
常规种子质量检测方法 (种子形态、石碳酸染色、幼苗形态等) 难以快速、可靠地鉴定众
多的杂交水稻。目前已开始探讨 RA PD 标记技术应用于杂交水稻纯度、真假鉴定的研
究[ 1～ 6 ]。但对于我国种植面积较大的众多杂交水稻亲本DNA 指纹的系统性研究工作尚为空
X 本文系国家攻关计划: 水稻种质资源指纹图谱及重要农艺性状基因的分子标记。
致谢: 安徽农业科学院王守海研究员、福建农业大学李维明教授、四川农业大学李仁瑞研究员、湖南杂交水稻研究
中心朱运昌副研究员、武汉大学梅启明副教授和本所张慧廉、陈深广和章善庆等先生惠赠部分实验材料, 程式华、
肖　晗、刘小川、庄杰云等先生对论文工作提出宝贵意见, 在此一并致谢。
收稿日期: 1998209204, 接收日期: 1999202215

白。本研究应用RA PD 标记技术分析了生产中正在应用及新育成的24个水稻雄性不育系、3
个保持系和3个生产中应用最广的恢复系。以期对这些杂交水稻亲本材料进行区分, 为杂交
水稻及其亲本的鉴定提供分子基础。在此基础上, 确定了杂交水稻亲本之间的亲缘关系、评
估其遗传多样性及利用现状, 并初步探讨了进一步利用杂种优势的途径。
1　材料与方法
1. 1　材料
本研究选用24个水稻胞质雄性不育系、3个保持系和3个恢复系作为实验材料 (详见表1)。
据统计, 这些水稻雄性不育系配制的杂交组合覆盖了我国杂交水稻种植面积的90% 左右, 同
时又具有广泛的代表性 (籼稻、粳稻; 野败型、红莲型、冈型、D 型、K 型、BT 型等)。3个恢
复系配制的杂交组合总计覆盖杂交水稻种植面积的65% 左右 (引自谢华安, 1996, 在863计划
两系杂交水稻专题研讨会上的报告)。其中V 20A 由湖南杂交水稻研究中心提供; 马协A、粤
泰A 由武汉大学生命科学院提供; 花2A 由福建农业大学遗传育种研究所提供; 8024A 由安
徽农业科学院水稻研究所提供; 冈46A、D 62A、D 汕A 由四川农业大学水稻研究所提供; 其
余材料均来自本所。所有供试材料种植于中国水稻研究所实验基地并进行田间性状观察, 以
确保实验材料的可靠性。
表1　实验材料
Table 1　M ater ia ls used in the presen t study
编号
N o.
名称
N am e
籼ö 粳
Indica ö Japonica
类型
T ype
应用面积 (hm 2)
U sed area
1 珍汕97A 籼 Indica 不育系 (野败) 7221000
Zhen shan97A CM S2W ild abo rtive
2 V 20A 籼 Indica 不育系 (野败) 1307000
CM S2W ild abo rtive
3 协青早A 籼 Indica 不育系 (矮败) 838000
X ie qingzhaoA CM S2A i bai
4 博白A 籼 Indica 不育系 (野败) 724000
Bo baiA CM S2W ild abo rtive
5 冈46A 籼 Indica 不育系 (冈型) 7220003
Gang46A CM S2Gang2type
6 D 汕A 籼 Indica 不育系 (D 型) 3990003 3
D shanA CM S2D 2type
7 D 62A 籼 Indica 不育系 (D 型)
CM S2D 2type
8 ˚ 232A 籼 Indica 不育系 (印水型)
CM S2Indonesia paddy rice2type
9 龙特甫A 籼 Indica 不育系 (野败)
L ong tefuA CM S2W ild abo rtive
10 金23A 籼 Indica 不育系 (野败)
J in 23A CM S2W ild abo rtive
11 枝A 籼 Indica 不育系 (野败)
Zh i A CM S2W ild abo rtive
12 青四矮A 籼 Indica 不育系 (红莲型)
Q ing siaiA CM S2Hong lian2type
13 粤泰A 籼 Indica 不育系 (红莲型)
Yue tai A CM S2Hong lian2type
14 8024A 粳 Japonica 不育系 (BT 型)
CM S2BT 2type
271　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26卷

续表1
编号
N o.
名称
N am e
籼ö 粳
Indica ö Japonica
类型
T ype
应用面积 (hm 2)
U sed area
15 花2A 籼ö 粳 不育系 (野败)
H ua 2A Indica ö Japonica CM S2W ild abo rtive
16 马协A 籼 Indica 不育系 (马尾粘)
M a xieA CM S2M a w eizhan
17 协研A 籼ö 粳 不育系 (野败)
X ie yanA Indica ö Japonica CM S2W ild abo rtive
18 IR 258025A 籼 Indica 不育系 (野败)
CM S2W ild abo rtive
19 新露A 籼 Indica 不育系 (野败)
X in lu A CM S2W ild abo rtive
20 优1A 籼 Indica 不育系印水
You 1A CM S2Indonesia paddy rice2type
21 新香A 籼 Indica 不育系 (野败)
X in xiangA CM S2W ild abo rtive
22 K17A 籼 Indica 不育系 (K 型)
CM S2K2type
23 台2A 粳 Japonica 不育系 (BT 型)
T ai 2A CM S2BT 2type
24 双百 A 粳 Japonica 不育系 (BT 型)
Shuang baiA CM S2BT 2type
25 明恢63 籼 Indica 恢复系 6130000
M ing hui63 Resto re line
26 密阳46 籼 Indica 恢复系 904000
M i yang46 Resto re line
27 测64 籼 Indica 恢复系 1757000
Ce64 Resto re line
28 珍汕97B 籼 Indica 保持系
Zhen shan97B M ain tainer line
29 协青早B 籼 Indica 保持系
X ie qingzaoB M ain tainer line
30 ˚ 232B 籼 Indica 保持系
M aintainer line
　　3 冈型不育系应用面积　U sed area of Gang2type m ale sterile lines in hybrid rice
　3 3 D 型不育应用系面积　U sed area of D 2type m ale sterile lines in hybrid rice
1. 2　方法
1. 2. 1　DNA 提取方法　　参照1992年卢扬江、郑康乐[ 2 ]报道的方法提取水稻DNA。
1. 2. 2　RA PD 扩增　　RA PD 引物由加拿大 Sangon 公司生产。PCR 扩增仪为 Perk in
E lm er 9600型。RA PD 反应体系 (25 LL ) 含有10 mm o lö L T ris2HC l (pH 9. 0) , 50 mm o lö L
KC l, 2. 0 mm o lö L M gC l2, 1% T riton X100, dN T P 各为0. 2 mm o lö L , 20 ng 引物, 20～ 40
ng 水稻基因组DNA , 1单位 T aq 酶。扩增条件为95℃预变性3 m in, 然后94℃ 1 m in、40℃ 2
m in、72℃ 2 m in 共进行40个循环, 最后, 72℃ 5 m in。扩增产物用1. 5% 的琼脂糖凝胶电泳检
测。
1. 2. 3　数据分析方法　　按照扩增产物的有无进行记录, 1和0分别代表某一扩增片段的有
与无。根据N TM A S (N um erica l T axonom y and M u lt ivaria te A nalysis System V ersion 1. 60,
F. Jam es Roh lf) 中的 Jaccard 公式计算杂交水稻亲本材料间的相似系数, 应用平均距离法
(U PGM A )进行聚类分析, 通过N T SYS 程序运算。
3712期　　　　　　　李云海等: 我国主要杂交水稻亲本的RA PD 鉴定及遗传关系研究　　　　　　　　

2　结果与分析
2. 1　RAPD 扩增对杂交水稻亲本材料的区分结果
选用100个RA PD 引物对所有供试材料进行扩增, 其中72个引物具有多态性, 共产生清
晰多态性片段142条。为了用尽可能少的具有较好重演性的引物区分供试材料, 从中挑选出
14个RA PD 引物 (S1、S6、S8、S9、S19、S56、S58、S66、S69、S78、S83、S88、S93、S100) ,
在30份杂交水稻亲本材料间共检测出扩增结果稳定的多态性片段47条。它们能够有效区分所
有供试的不育系和恢复系材料。
在上述14个引物中发现5个RA PD 引物, 能够区分覆盖我国杂交水稻种植面积80% 左右
的10个水稻雄性不育系材料 (表2、图1)。
表2　10个应用面积较大的水稻雄性不育系D NA 指纹图
Table 2　D NA f ingerpr in ts of ten widely-used male ster ile l ines in r ice
引物
P rim er
序列 (5′- 3′)
Sequence (5′- 3′)
不育系序号 (Series N o. )
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
S1 GT T TCGCTCC - - - - - - + - - +
S8 GTCCA CA CGG + + - + + + - + - -
+ - - - - - - - - -
S19 GTCCA CA CGG - - + + - - + - + -
+ + + - + + - + - +
S83 GA GCCCTCCA + - - + - + - + - +
- + + + - - + - + +
S93 GA GCCCTCCA + + - - + + - - - +
　　+ 、- : 分别代表随机扩增多态性片段的有无　　+ o r- rep resen ts the po lymo rph ic state
仅记录具有较好重复性的多态性片段　T he rep roducib le and po lymo rph ic fragm ents w ere reco rded
不育系序号同表1　T he sam e series N o. as T able 1
图1 引物 S1的扩增结果, 不育系序号同表1
F ig. 1　T he amp lified resu lts of p rim er
S1, T he sam e series N o. as T able 1
　　3个保持系与对应的水稻雄性不育系之间经过100个
RA PD 引物筛选, 未发现具有明显差异性的带谱, 主要原
因是在长期的繁种过程中, 不育系被相应的保持系连续回
交, 核的置换程度较高, 因此难以探测其差异。
2. 2　杂交水稻亲本遗传关系分析
根据72个多态性引物的扩增结果, 经聚类分析, 可分
为籼、粳两大类群 (图2)。粳稻类群共包括4个不育系材料,
其中8024A、台2A、双百A 为粳型不育系, 研早A 是籼粳
交不育系。
在籼稻类群内, 籼粳交不育系花2A 偏籼且与其它水稻
雄性不育系有较远的遗传距离。生产中应用面积较大的3个
恢复系明恢63、密阳46和测64被聚类在一起, 三者间的遗
传变异较大。其余水稻雄性不育系按其遗传关系的远近可
分为4类, É 类: 包括6个雄性不育系材料。它们在生产中的
应用面积总计覆盖杂交稻总种植面积的70% 左右, 这些不育系间的遗传变异较小。其中珍汕
471　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26卷

97A、D 汕A、˚ 232A、V 20A、冈46A 和优1A 都含有珍汕97的血缘。˚ 类: 协青早A、马协
A、龙特浦A、D 62A、K17A、博白A、枝A、粤泰A、新香A 9个不育系, 它们间的遗传变异
较É 类不育系大。其中协青早A、马协A 含有协青早的血缘。博白A、枝A 由广西博白县选
育, 具有一定的亲缘关系。¸ 类: 包括金23A、新露A 和 IR 258025A 3个不育系, 其遗传变异
相对较大。Ì 类: 仅包括青四矮A 1份材料, 与其他籼型不育系的遗传距离相对较远。
图2　30份杂交水稻亲本相似性树状图, 编号同表1
F ig. 2　D endrogram of sim ilarity among 30 paren ts of hybrid rice, T he sam e series N o. as T able 1
从以上聚类分析可以看出: (1) 从总体上看, 我国水稻雄性不育系遗传资源比较丰富,
有籼型不育系、粳型不育系、籼、粳交不育系。就生产应用而言, 我国水稻雄性不育系遗传背
景比较单一。覆盖杂交水稻种植面积70% 左右的水稻雄性不育系分布在 É 类中, 且DNA 的
多态性较低。(2) 在籼稻类群内, 水稻雄性不育系的遗传变异较恢复系少。(3) 生产中主要应
用的水稻恢复系与雄性不育系遗传关系相对较远, 从一定程度上反映了遗传距离与杂种优势
正相关[ 7 ]。
3　讨论
RA PD 标记的稳定性一直是令人关注的问题。由于RA PD 引物较短 (10 bp )、退火温度
低, 重复性相对于R FL P 等技术较差。但在严格的条件下, 一些引物的扩增片段具有较高的
重复性[ 5、6 ]。本实验室近年来的实践也表明: 如果建立比较完善的反应体系, 通过筛选足够多
的引物, 总能找到配对率较高、重复性较好、完全能够胜任于品种鉴定的一些引物。本实验
筛选的14个引物均进行了3次重复实验, 扩增结果稳定。
RA PD 标记对杂交水稻亲本材料具有较好的区分效果。实验选用的14个 RA PD 引物能
够有效区分所有供试的雄性不育系及恢复系材料, 甚至是遗传背景极为相近的不育系, 如珍
5712期　　　　　　　李云海等: 我国主要杂交水稻亲本的RA PD 鉴定及遗传关系研究　　　　　　　　

汕97A、D 汕A 和˚ 232A。因此, 筛选在杂交水稻亲本材料间具有较高多态性和较好重演性
的RA PD 引物, 建立杂交水稻亲本DNA 指纹图谱, 结合田间性状特征, 将对杂交水稻及其
亲本的鉴定具有重要价值。
目前RA PD 标记技术在解决重大种子纠纷案件和新品种、新种质分子鉴定等方面发挥
着重大作用。但是从经济学的角度考虑, 要使RA PD 技术普遍应用于生产实践仍有相当长的
距离。虽然RA PD 技术相对于其它分子标记技术而言, 费用较低, 但仍需要精密的 PCR 仪和
其它试剂。这种费用是目前一般生产单位难以承受的。同时, 水稻质量检测的最终目的是保
证田间性状的表型一致, 而DNA 指纹技术检测的灵敏度远比田间检测的灵敏度高, 因此还
需要形成分子技术及田间检测指标相统一的标准。
我国水稻雄性不育系遗传资源丰富, 但是生产中应用面积较大的雄性不育系数量不多,
且往往含有珍汕97或协青早血缘, 遗传背景比较单一。为了避免遗传脆弱性, 防止因遗传单
一造成的潜在农业问题, 需要加大不育系及保持系的开发力度, 使生产中的不育系向多极化
发展。另外, 生产中推广的籼型不育系的恢复系尤其是野败型不育系的恢复系基本上含有东
南亚地区品种或品系的血缘[ 8 ]。其中明恢63、密阳46和测64均含有 IR 血缘, 尽管遗传背景较
不育系广, 但同样存在着一定的局限性, 这也正是3个恢复系被聚为一起的原因。本研究表明
在籼稻类群内, 生产中应用最广的恢复系与雄性不育系分别聚类于不同的类群, 且遗传距离
较远。这与生产中推广的一些种植面积较大的杂交组合 (汕优63等) , 杂种优势已经得到充分
利用的现实相吻合。这也从另一方面提示利用现有的这些籼型不育系、恢复系配制超高产组
合的可能性较小。为了实现杂交水稻的超高产, 有待于开发新的稻种资源、充分利用籼粳间
遗传变异 (粳型或籼粳交不育系、恢复系)、引进新的有利基因。为了更好的了解和利用我国
水稻遗传资源, 有必要在分子水平上建立水稻骨干亲本遗传关系图, 用以指导亲本选配、加
快育种进程。
参　考　文　献
1　陈洪, 钱前, 朱立煌等. 科学通报, 1996, 41 (9) : 833～ 836
2　卢扬江, 郑康乐. 中国水稻科学, 1992, 6 (1) : 47～ 48
3　马文宾, 庄杰云, 彭应财等. 遗传, 1998, 20 (2) : 1～ 4
4　钱前, 陈洪, 孙宗修等. 中国水稻科学, 1996, 10 (4) : 241～ 242
5　邵启明, 斐炎, 侯磊等. 西南农业大学学报, 1996, 18: 148～ 151
6　杨蜀岚, 伏健民, 杨仁崔等. 福建农业大学学报, 1998, 27 (1) : 6～ 9
7　X iao J , L i J , Yuan L et al. T heor A pp l Genet, 1996, 92: 637～ 643
8　罗崇善. 作物杂志, 1988, (3) : 1～ 4
671　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26卷