全 文 ：第 30 卷 第 3 期
2004 年 3 月 　289～292 页 　 　
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
　 　 Vol. 30 , No. 3
pp. 289～292 　Mar. , 2004
用微卫星 DNA 标记分析苎麻品种的亲缘关系
周建林1 　揭雨成2 , 3 　蒋彦波2 　胡　翔1 　张　健1 , 3 3 Ξ
(1 湖南师范大学生命科学学院 ,湖南长沙 410081 ;2 中国农业科学院麻类研究所 ,湖南长沙 410006)
摘 　要 　用 3 种微卫星标记分别分析了 20 个苎麻品种的 DNA。每种标记方法都能在苎麻品种间产生多态性的谱带。
ISSR 每个检测单位产生的DNA 条带最多 ,平均每个引物对扩增出 8 个DNA 条带 ;其次是 RAMP。虽然 SSR 每个检测单位
产生的条带数最少 ,但其扩增图谱中 ,87. 0 %的条带是多态性条带 ,高于 ISSR 和 RAMP。ISSR 和 RAMP 扩增图谱中多态
带的频率分别是 7912 %和 7516 %。从每次 PCR 扩增所能区分的基因型数值来看 , ISSR 最高 ,为 5167 ,SSR 次之 ,RAMP 最
低。根据微卫星标记分析的结果 ,对 20 个苎麻品种进行聚类分析并建立系统树。其结果与品种的地理分布和形态特征
基本吻合 ,表明微卫星 DNA 标记用于苎麻遗传关系分析是可行的。
关键词 　苎麻 ; 微卫星 DNA ; 亲源关系分析
中图分类号 : S563
Genetic Relation Analysis on Ramie Cultivars with Microsatellite Markers
ZHOU Jian2Lin1 , J IE Yu2Cheng2 , 3 , J IANG Yan2Bo2 , HU Xiang1 , ZHANGJian1 , 3 3
(1 College of Life Science , Hunan Normal University , Changsha 410081 , Hunan ; 2 Institute of Bast Fiber Crops , CAAS , Changsha 410006 , Hunan , China)
Abstract 　SSR , ISSR and RAMP were used to determine the genetic relationships among 20 cultivars in ramie. All of the
approaches were able to uniquely fingerprint each of the cultivars. The three assays differed in the amount of polymorphism
detected and bands scored. The number of bands scored per assay unit was 8. 0 for ISSR , which was the highest , while the
numbers for SSR and RAMP were 3. 0 and 4. 6 respectively. 87. 0 % of bands generated by SSR were polymorphic , while
the percentages of polymorphic bands for ISSR and RAMP were 79. 2 % and 75. 6 % respectively. With ISSR , for each
primer , an average 5. 67 phenotypes could be distinguished , with SSR and RAMP , the number of phenotypes per assay unit
were 5. 13 and 4. 50. According to the hierarchical clustering of a database of the polymorphism detected by SSR , ISSR
and RAMP , 20 cultivars of ramie could be divided into four types. The cultivars with the same root type and close geo2
graphic distribution were clustered in the same types. The result showed that SSR , ISSR and RAPM could be used to ana2
lyze the genetic relationships among ramie cultivars.
Key words 　Ramie ; Microsatellite DNA ; Genetic anlysis
　　苎麻是荨麻科 (Urticaceae)苎麻属 ( Bochmeria) 的
多年生草本植物。我国苎麻人工栽培的历史已有 5
000 年以上 ,栽培品种类型极为丰富。长期以来 ,许
多学者根据形态学特征、生育特性和经济性状等对
苎麻品种资源进行了分类整理[1 ] 。揭雨成等[2 ]首先
尝试应用 RAPD 标记分析苎麻品种间亲缘关系。但
是 ,RAPD 重复性、稳定性不太理想。微卫星 DNA 标
记是近年来发展起来的一种新的分子标记 ,由于微
卫星标记为共显性标记 ,具有丰富的多态性 ,且 PCR
扩增结果重复性好 ,被认为是研究遗传关系的最好
标记方法之一[3 ] 。本文比较了 SSR[3 ] 、ISSR[4 ] 和
RAMP[5 ]3 种基于微卫星 DNA 的分子标记在苎麻亲
缘关系分析上的应用结果 ,探讨了苎麻微卫星标记
的方法 ;同时 ,以三种微卫星标记技术对 20 个苎麻
主栽品种进行了亲缘关系分析 ,为苎麻品种资源的
分类和利用提供了参考依据。Ξ基金项目 :国家 863 计划项目 (2001AA241211)和国家自然科学基金课题 (30270849)资助。
作者简介 :周建林 (1964 - ) ,博士 ,副研究员 ,主要从事分子生物学教学和科研工作。3并列第一作者 :揭雨成 (1966 - ) ,男 ,湖南桃源人 ,副
研究员 ,博士 ,主要从事生理生化、生物技术与品种资源科研工作。3 3 通讯作者 :张 　健 (1963 - ) ,博士 ,特聘教授 ,长江学者 ,
主要从事基因敲除与转基因动物研究。
Received(收稿日期) :2002211208 ,Accepted (接受日期) : 2003201224.

1 　材料与方法
1. 1 　材料
　　供试品种 20 个 ,来自湖南、四川、贵州、湖北、江
西、云南和陕西等 7 个省 ,包含深根丛生型、中根散
生型和浅根串生型等 3 种类型 (表 1) 。
表 1 供试品种的来源、产地和根型
Table 1 Origin and root types of the ramie cultivars tested
代号
Code
品种名称
Cultivar
产地或来源
Origin
根型
Root type
1 红皮小麻 四川达农 深根丛生
2 耒阳黄壳麻 湖南耒阳 深根丛生
3 平江丛蔸麻 湖南平江 深根丛生
4 来宾苎麻 云南宜威 深根丛生
5 串根白麻 贵州息蜂 中根散生
6 割麻 贵州罗甸 中根散生
7 米麻 贵州罗甸 中根散生
8 山阳苎麻 陕西山阳 中根散生
9 红圆麻 贵州咸宁 中根散生
10 关岭圆麻 2 号 贵州关岭 深根丛生
11 宜春鸡骨麻 江西宜春 中根散生
12 巫溪大叶胖 四川巫溪 中根散生
13 泸县青皮 四川泸县 中根散生
14 大叶子 1 号 四川武胜 中根散生
15 西宁线麻 四川巫溪 中根散生
16 广济黄尖 湖北广济 中根散生
17 南坪苎麻 1 号 云南普洱 中根散生
18 湘苎 3 号 湖南农大 中根散生
19 江西细叶麻 江西 浅根串生
20 藤形茎鸡骨白 湖北农科院 浅根串生
1. 2 　方法
DNA 提取按郭安平等[6 ]的方法进行。
SSR 分析参照 Khadari 等[7 ]的方法进行 ,所用引
物是 Khadari 等[7 ]从无花果基因组中分离的 8 对微
卫星引物。
ISSR 分析参照 Wiesner 等[4 ]的方法进行。3 个
引 物 序 列[4 ] 分 别 为 : 5′2YHY ( GA ) 1523′、5′2
VRV(CT) 1523′、5′2VRV(TG) 1523′。
RAMP 反应总体积为 25μL ,其中含 10 mmol/ L
Tris2HCl (pH813) ,50mmol/ L KCl ,215mmol/ LMgCl2 ,
0. 2 mmol/ L 各种 dNTP ,两个引物 (1 个 ISSR 引物和
1 个 10 碱基随机引物) 各 0. 4μmol/ L , 50 ng DNA ,1
U Taq 酶。由于两个引物理论退火温度相差较大 ,
因此采用 Touchdown PCR 扩增 :94 ℃变性 2 min ,随后
20 个循环 ,每个循环 94 ℃变性 45 s ,56～37 ℃(每个
循环降 1 ℃)退火 45 s ,72 ℃延伸 1 min ,接着 94 ℃变
性 45 s ,36 ℃退火 45 s ,72 ℃延伸 1 min ,循环 30 次 ,
最后 72 ℃延伸 5 min。
扩增产物在 3 %琼脂糖凝胶上电泳 ,在紫外灯
下观察并照相。Taq 酶、dNTP 均购自大连宝生物公
司 ,PCR 引物在上海生工公司合成。PCR 仪为 Ep2
pendorf 公司的 Mastercycler gradient。凝胶成像分析
系统为上海天能 GIS21000 型。
每个样品的扩增条带按有或无记录 ,扩增条带
存在时赋值为 1 ,否则为 0。采用 SPSS10. 0 for win2
dows 统计分析软件中的系统聚类分析程序 ,距离测
量选用相关系数距离法 ( Pearson correlation) ,用类间
平均连锁法 (Between2groups linkage)进行聚类分析并
建立系统树。
2 　结果与分析
2. 1 　SSR、ISSR和 RAMP分析产生的谱带比较
　　用 3 种微卫星标记分别分析 20 个苎麻品种的
DNA ,每种标记方法都能在苎麻品种间产生多态性
的谱带 (表 2、图 1) 。ISSR 每个检测单位 (对于 SSR、
RAMP ,检测单位指的是每个引物对 ;对于 ISSR 指的
是每个引物)产生的 DNA 条带最多 ,其次是 RAMP ,
而 SSR 每个检测单位产生的条带数最少。但是 ,
SSR扩增图谱中 ,87. 0 %的条带是多态性条带 ,高于
ISSR 和 RAMP。ISSR 和 RAMP 扩增图谱中多态性带
的频率分别是 79. 2 %和 75. 6 %。从每次 PCR 扩增
所能区分的基因型数值来看 , ISSR 最高 ,为 5167 ,即
用 ISSR 标记分析该 20 个品种 ,平均每次能区分
5167 个品种 ,SSR 次之 ,RAMP 最低。说明用 ISSR 标
记分析 ,效率最高。
表 2 SSR、ISSR和 RAMP分析产生的谱带比较
Table 2 Analysis of SSR, ISSR and RAMP generated band pattern
标记
Marker
检测单位数
No. of assay
units
带的总数
Total No. of
bands
多态带
No. of polymorphic
bands
每个检测单位产生的带数
Number of bands
per assay unit
每个检测单位能区分的基因型数
Number of phenotypes
per assay unit
SSR 8 24 21(87. 0 %) 3. 0 5. 13
ISSR 3 24 19(79. 2 %) 8. 0 5167
RAMP 9 41 31(75. 6 %) 4. 6 4. 50
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图 1 SSR( A) 、ISSR( B)和 RAMP( C) 3 种标记产生的谱带比较
Fig. 1 Comparison of patterns generated by SSR( A) ,
ISSR( B) and RAMP( C)
2. 2 　利用 3 种标记提供的相似系数信息进行聚类
分析
根据 3 种微卫星标记分析所得的结果 ,采用
SPSS 10. 0 统计软件对 20 个苎麻地方品种进行聚类
分析 ,结果见图 2。20 个苎麻基因型可划分 4 组 ,第
一组包括大叶子 1 号 (代号 14) 、西宁线麻 (代号
15) 、巫溪大叶胖 (代号 12) 、泸县青皮 (代号 13) 、串
根白麻 (代号 5) 和广济黄尖 (代号 16) ;第二组包括
耒阳黄壳麻 (代号 2) 、平江丛蔸麻 (代号 3) 、红皮小
麻 (代号 1) 、来宾苎麻 (代号 4) 和关岭圆麻 2 号 (代
号 10) ;第三组包括江西细叶麻 (代号 19) 和藤形茎
鸡骨白 (代号 20) ;第四组包括割麻 (代号 6) 、米麻
(代号 7) 、宜春鸡骨麻 (代号 11) 、湘苎 3 号 (代号
18) 、南坪苎麻 1 号 (代号 17) 、红圆麻 (代号 9) 和山
阳苎麻 (代号 8) 。各组又可分成几个亚组。各组内
或亚组内的品种在地理分布、根型上具有一定的相
关性。如第一组和第四组的品种都是中根散生型 ,
第二组的品种都是深根丛生型 ,第三组的品种都是
浅根串生型。在地理分布上 ,第一组内各品种来自
四川、贵州和湖北 3 个相邻的省 ,其中来自四川的 4
个品种亲缘关系更近 ,聚在同一亚组内。在其他的
组内也可发现同样的现象 ,即地理分布越近的品种 ,
图 2 苎麻基因型的聚类分析图
Fig. 2 Dendrogram of ramie genotypes based on
microsatellite markers
在树状图上靠得越近。
3 　讨论
SSR 引物一般在属内是保守的 ,但也有报道[8 ]
在科内也是保守的。由于尚未见与苎麻同属、甚至
同科的植物的 SSR 引物的报道 ,我们尝试用与苎麻
同目的植物无花果 ( Ficus carica L. )的 SSR 引物扩增
苎麻的微卫星重复序列 ,也得到了扩增 ,说明这些引
物在荨麻目内是保守的。但随着遗传距离的增加 ,
引物的适用性会逐渐降低。本研究中 ,虽然无花果
的 SSR 引物能在苎麻 DNA 中扩增 ,但多态性比文献
报道[3 ,7 ]的大为降低。因此 ,进行 SSR 分析应尽量
使用所要研究物种的自身特异的引物。ISSR 和
RAMP分析 ,不需要获得所要研究物种的特异性引
物。对于苎麻这样的物种 ,其基因组序列不清楚 ,也
没有近缘的物种的 SSR 引物的报道 ,采用 ISSR 和
RAMP两种方法进行遗传关系分析 ,不失为一种比
较不同基因组之间微卫星分布的快速、有效的方法。
这两种标记方法 ,特别是 ISSR 方法 ,越来越被研究
者所认识和采用。这两种标记比 SSR 标记简单 (不
需分离特异性引物) ,比 RAPD 方法重复性好、多态
性丰富[4 ] 。从本研究的结果来看 ,用这两种标记技
术也能检测到苎麻品种间的多态性。但 ISSR 扩增
图谱条带比较多 ,带型没有 SSR 方法扩增的带型清
晰。RAMP 比 ISSR 扩增的条带少 ,且带型清晰 ,但
192　3 期 周建林等 :用微卫星 DNA 标记分析苎麻品种的亲缘关系 　　　

每个检测单位所能检测到的基因型比 ISSR 方法少。
对于苎麻品种间的亲缘关系 ,传统的方法是采
用地理分布、形态特征等进行分析。本研究尝试用
微卫星 DNA 标记进行苎麻品种间的亲缘关系研究 ,
其结果与其地理分布和形态特征 (根型) 基本吻合 ,
表明微卫星 DNA 标记用于苎麻遗传关系分析是可
行的。
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