全 文 ：第 29 卷 第 1 期 作　物　学　报 V o l. 29, N o. 1
2003 年 1 月　 49～ 53 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 49～ 53　 Jan. , 2003
从油菜 (B rass ica nap us L. cv. Topas)裂外壁小孢子培育出胚状体与小
植株Ξ
田　辉　孙蒙祥3
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 湖北武汉 430072)
摘　要　油菜 (B rassica nap us L. cv. Topas)小孢子经高温 (32℃)预培养导致外壁开裂, 形成裂外壁小孢子。微室饲养
培养技术结合定位追踪观察证实裂外壁小孢子具有胚胎发生能力。33. 3% 的裂外壁小孢子能启动细胞分裂, 其中
13. 3% 的裂外壁小孢子能持续分裂, 并遵循胚胎发生途径。与完整小孢子不同, 第一次分裂既有均等分裂, 亦有不均
等分裂, 两者均能导致胚胎发生。将已分化的胚状体转移至固体培养基上, 可经二次胚胎发生或直接再生小植株。
关键词　油菜; 裂外壁小孢子; 胚胎发生
中图分类号: S565　　　文献标识码: A
Em bryo id Forma tion and Plan tlet Regenera tion from Ex ine-deh isced M i-
crospores in B rass ica nap us L. cv. Topa s
T IAN H u i　SUN M eng2X iang3
(K ey L abora tory of M O E f or P lan t D evelopm en ta l B iology , W uhan U niversity , W uhan 430072, Ch ina)
Abstract　By p recu ltu re in the tem pera tu re of 32℃, the ex ine of m icro spo res in B rassica nap us L. cv.
Topas cou ld be induced to deh isce, fo rm ing so2ca lled ex ine2deh isced m icro spo res. W ith the a id of a m icro2
cu ltu re and feeder2cell system and tracing the developm en t of ind ividua l m ocro spo res, it is p roved tha t ex2
ine2deh isced m icro spo res have the capacity of em b ryogenesis. 33. 3% of the ex ine2deh isced m icro spo res d i2
vided, and am ong them 13. 3% developed in to em b ryo ids. Q u ite d ifferen t from the developm en t of w all2in2
tact m icro spo res, the first d ivision of ex ine2deh isced m icro spo res cou ld be symm etric o r asymm etric. Bo th
k inds of m icro spo res cou ld lead to em b ryogenesis. A fter been tran sferred to so lid m edium , the m atu re em 2
b ryo ids cou ld go on develop ing, fo rm ing secondary em b ryo s o r regenera t ing p lan t lets d irect ly.
Key words　B rassica nap us L. cv. Topas; Ex ine2deh isced m icro spo res; Em b ryogenesis
　　游离小孢子是一种兼具单倍性和单细胞特性的
植物材料, 可以从少量花蕾中分离到大量的发育同
步的细胞群体, 一直被认为是以生物技术进行作物
改良的重要材料而广受重视。在甘蓝型油菜 (B ras2
sica nap us L. cv. Topas) 中, 利用其单花蕾的小孢
子培养曾获得了 70% 以上的胚胎发生频率[ 1 ] , 因而
常被作为研究小孢子胚胎发生的模式植物, 同时也
是利用小孢子培养进行油菜遗传育种的重要材
料[ 2 ]。花粉具外壁和内壁两层壁结构。油菜花粉壁
的特点在于其外壁较厚而内壁较薄[ 3 ] , 有报道认
为, 在其小孢子胚胎发生的早期, 壁的完整性是必
要的[ 4 ] , 在小孢子发育为一个约含 40 个细胞左右
的细胞团后, 外壁才开始破裂[ 4, 5 ]。然而, 这种厚而
坚硬的外壁的存在构成了在其小孢子胚胎发生的早
期进行遗传转化的障碍[ 6 ]。
脱外壁花粉是本实验室创建的一种新实验材
料, 其特点是用人工方法脱去外壁, 而仅由内壁包
围其内的原生质体。在芸薹属中, 已建成脱外壁花
粉分离与人工萌发的实验系统[ 3 ]。在烟草中, 电激
实验表明, 脱外壁花粉和具壁的完整花粉相比, 易Ξ 基金项目: 国家重点基础研究发展规划项目 (“973”项目: G1999053908)及国家自然科学基金资助项目 (39970368)。
作者简介: 田辉 (19772) , 女, 湖北人, 硕士研究生。本文承周嫦教授审阅并提出修改意见, 特此致谢。　3 通讯作者
Received on (收稿日期) : 2001212226, A ccep ted on (接受日期) : 2002206213

被导入外源基因[ 7 ]。但已有的研究大都限于成熟及
近成熟花粉, 目前尚未发现有关芸薹属脱外壁小孢
子及其胚胎发生的研究报道。
在本实验中, 我们以油菜 (B rassica nap us L.
cv. Topas) 小孢子为材料, 获得了一定数量的外壁
破裂但仍部分包被着细胞表面的小孢子, 我们称之
为裂外壁小孢子, 其可视为一种介于完整小孢子和
完全脱外壁小孢子之间的结构单元。我们对其进行
了培养与观察, 并就其应用潜力进行了讨论。
1　材料和方法
1. 1　植物材料
供 试 材 料 为 油 菜 (B rassica nap us L. cv.
Topas) , 九月下旬播种于田间, 次年 2～ 4 月开
花。　　　　　　　
1. 2　油菜小孢子的培养
选取小孢子处于单核晚期、长约 3 mm 的花蕾
材料, 直接或经 4℃预处理 1～ 2d 后, 置于 4% 的次
氯酸钠溶液消毒 10 m in, 无菌水洗 3～ 4 次, 加入
B 5 培养基[ 8 ] 4～ 5 mL , 用平头玻璃棒轻轻挤压花
蕾, 使小孢子游离至培养基中, 通过 50 Λm 孔径尼
龙筛网除去花蕾组织残渣, 加入 5 mL 新鲜B 5 培
养基冲洗筛网, 收集小孢子悬液, 离心 (100×g, 3
m in)洗涤 3 次, 最后用NLN 213 培养基 (NLN 培养
基[ 8 ] , 附加 13% 蔗糖, 不加外源激素, pH 6. 0) 将小
孢子密度调至 1～ 2×105ömL。将小孢子悬液分装
于 3. 5 cm 小培养皿中, 每皿 1. 5 mL , 32℃恒温暗
培养。一部分小孢子培养 1 周左右, 稀释 1～ 2 倍,
作为饲养细胞。另一部分则继续培养作为裂外壁小
孢子的参照系统。
1. 3　裂外壁小孢子的制备与培养
单核晚期小孢子经B 5 培养基洗涤 3 次后, 用
高渗培养基 (NLN 基本成分, 0. 7 m o löL 蔗糖, 0. 4
m o löL 甘露醇 (山梨醇) , 不加外源激素, pH 6. 0) 将
小孢子密度调至 1～ 2×105ömL , 32℃恒温培养 24
h 后, 离心 (100×g, 3 m in) 收集沉淀再转入NLN 2
13 中培养。3～ 5d 后, 部分小孢子外壁先后破裂甚
至脱落, 形成裂外壁小孢子 (内壁部分裸露, 仍为
外壁覆盖的小孢子)以及脱外壁小孢子 (外壁完全脱
落)。用微吸管挑出 10～ 20 个裂外壁小孢子置于已
加入 100 ΛL 新鲜NLN 213 培养基的微室中 (M IL 2
L ICELL 2CM , M ILL IPOR E) 中, 将该微室放在有
1. 5 mL 饲养细胞的 3. 5 cm 培养皿中, 32℃恒温暗
培养。同时, 作为对照, 挑取 5～ 10 个脱外壁小孢
子置于微室中, 在相同的条件下培养。
培养 1 周后, 在微室中加入 15～ 20 ΛL 的
NLN 20 (不含渗透压调节剂的NLN 培养基) , 当其
发育为较大的球形胚时, 移至含NLN 210 的 3. 5 cm
培养皿中, 在 25℃继续培养 2～ 3 周后, 移至M S [ 9 ]
固体培养基 (附加 3% 的蔗糖, 0. 8% 的琼脂, 不加
外源激素, pH 5. 7) 上, 下胚轴部分插入培养基中,
在 25℃, 弱光培养 (16ö8h 循环光照)。
1. 4　观察及数据处理
用荧光染料DA P I 染色观察细胞核。收集新鲜
的小孢子以及培养中的裂外壁小孢子, 于含 13% 蔗
糖的 FPA 固定液中固定 2～ 4h, 洗涤后在 20 Λgö
mL DA P I 溶液中染色 15 m in, 洗去染液后于荧光
显微镜 (L eica DM IRB )下观察。明视野及荧光图象
由 Coo led2CCD (M icroM A X P rinceton In stru2
m en ts, Inc. )采集。
实验数据的计算均采用 3 次实验的平均值, 每
次随机取 5 个视野观察统计。
2　实验结果
2. 1　裂外壁小孢子的制备及影响因素
在芸薹属的成熟花粉中, 徐秉芳等曾根据其内
外壁的结构特点, 利用低温水合、热激、渗激程序
获得了较高的脱外壁频率[ 3 ] , 但据我们试验, 该法
用于油菜单核晚期的小孢子时, 并不能获得较好的
脱外壁效果和培养效果。本实验将小孢子恒温培养
于 32℃高温下, 并在培养初期辅以渗透压冲击, 试
图在阻断其配子体发育途径的同时, 通过细胞自身
的膨胀以及外界因素的冲击使其外壁开裂。图 1 示
预培养过程中小孢子的裂外壁及脱外壁频率。培养
2 天后, 即有少部分小孢子从一个或两个萌发沟处
裂开外壁 (图版É , 1) , 同时有极少数外壁完全开
裂, 形成脱外壁小孢子。随培养天数的增加, 外壁
破裂及脱落的频率逐渐增加, 形成程度不同的裂外
壁小孢子 (图版É , 224)。培养 5～ 6 天后, 外壁破
裂的速度逐渐减缓, 同时, 一部分裂外壁小孢子先
后开始启动分裂, 因而, 在本实验中, 我们选取预
培养 3～ 5 天, 尚未分裂的裂外壁小孢子进行培养。
外壁破裂的频率随外界条件而变化, 开花初期
取材的小孢子, 外壁破裂较难, 外壁破裂 (包括脱
落)的频率仅为 1. 1%。随花期的延伸, 外壁破裂的
频率逐渐增加, 后花期取材的小孢子有 11. 7% 的外
壁破裂。末花期取材的小孢子, 外壁破裂的频率又
转低, 仅为 4. 03%。花粉的发育时期也影响外壁破
05　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　29 卷

裂频率, 在相同的培养条件下 (NLN 213, 32℃培养
5 天) , 二核中期的花粉, 仅有 2% 左右外壁裂开后
仍附着于细胞表面, 有 30% 左右的则完全脱掉外
壁; 相比之下, 单核晚期小孢子则有约 8% 的裂外
壁频率, 完全脱外壁的仅为 2%～ 4%。此外, 在培
养前对花蕾进行 2～ 3 天的 4℃低温预处理, 以及适
当提高小孢子的培养密度, 均有助提高小孢子外壁
破裂的频率。
图 1　　预培养天数对油菜小孢子裂外壁及脱外壁频率的影响3
F ig. 1　　Effects of p recu ltu re duration on the frequency of
de2ex ined and exine2deh isced m icro spo res
of B rassica nap us L. cv. Topas3 单核晚期小孢子培养于NLN 213, 32℃, pH 6. 0 条件下
2. 2　裂外壁小孢子的发育过程
裂外壁小孢子最初为圆形, 随着外壁破裂程度
的增加, 细胞沿外壁破裂的方向伸长, 呈不规则的
椭圆形。大多数裂外壁小孢子在微室培养 2～ 3 天
启动分裂。分裂前, 核一般移至破裂外壁开口处附
近 (图版É , 5、6)。裂外壁小孢子 33. 3% 启动分
裂, 其中 13. 3% 的能继续分裂形成胚。外壁对小孢
子的包被形式对一次分裂后子细胞的连接方式有一
定影响。对 178 个已分裂的裂外壁小孢子的统计表
明, 外壁松散附着在小孢子上的占 8. 7% , 由其分
裂的两个子细胞一般联系较为松散, 有彼此脱离的
趋势; 而外壁紧密附着的小孢子占 91. 3% , 分裂所
形成的两个子细胞联系紧密。其第一次分裂既有不
等分裂 (图版É , 7) , 同时也有均等分裂 (图版É ,
8)。根据分裂面与外壁开口断面的相对关系, 将其
第一次分裂分为 3 种方式: 1. 分裂面平行或重合于
外壁断面, 占 80. 8% , 其中不等分裂占 59. 5% ; 均
等或近似均等分裂占 21. 3%。2. 分裂面与外壁断
面呈斜角, 占 7. 0%。3. 分裂面与外壁断面垂直,
占 3. 5%。DA P I染色表明, 裂外壁小孢子的第一次
核分裂形成两个大小及染色程度一致的子核 (图版É , 9、10)。
具完整外壁的小孢子分裂后, 首先形成一由外
壁包围的无极性细胞团, 再在此基础上发生分化,
由其发育而来的胚一般缺乏胚柄结构[ 4 ]。而裂外壁
小孢子的早期发育过程与小孢子的发育明显不同。
按上述 1、2 两种方式分裂的裂外壁小孢子, 其两个
子细胞之一个几乎完全为外壁所包被, 而另一个子
细胞则只有少部分或几乎不为外壁包被。根据外壁
破裂程度不同, 两个子细胞的相对大小也发生变
化。在不均等分裂的情况下, 较典型的发育方式是
其较大的子细胞可有多种分裂方式 (图版É , 11、
12) , 随后继续发育形成胚体, 其或者为外壁包被
(图版É , 13) , 或者裸露 (图版É , 14) , 在此过程
中, 较小的细胞则平行分裂数次, 形成一列胚柄结
构。在均等或近似均等分裂的情况下, 其后的发育
或类似不均等分裂后的发育, 或两子细胞沿平行于
原分裂面的方向分裂数次, 形成一列胚柄状结构,
再由其中的一个或几个细胞形成胚体。按上述方式
3 分裂的裂外壁小孢子, 两个子细胞均有部分为外
壁包被, 均继续分裂形成各自的胚和胚柄结构。裂
外壁小孢子在培养两周后即能形成较大的胚状体
(图版É , 15) , 具明显的胚和胚柄结构。胚状体转
至无激素的M S 固体培养基上后, 89. 6% (追踪观
察胚状体总数: 135) 能继续发育, 经二次胚胎发生
或直接再生小植株 (图版É , 16)。
同时, 还观察了作为对照的脱外壁小孢子的发
育。对 135 个培养的脱外壁小孢子的观察表明, 在
无激素的培养基中, 其分裂频率较低, 仅为 6. 5% ,
大多数分裂 1～ 2 次后, 胞质萎缩, 只有少数形成小
细胞团, 最终未能得到胚状体与再生植株。
3　讨论
脱外壁花粉是近年建立的, 介于完整花粉和花
粉原生质体间的研究体系, 有着独特的研究价
值[ 10 ]。然而, 迄今其大量获得只限于有限植物种类
的成熟或近成熟花粉[ 3, 11 ]。在芸薹属的成熟花粉
中, 曾获得了 40% 左右的脱外壁频率[ 3 ]。本实验发
现, 就油菜小孢子及幼嫩花粉而言, 较可行的方法
是将其持续培养于较高温度 (32℃) 下, 使其脱离配
子体途径的同时, 通过细胞自身的膨胀和快速生
151 期　　　　　　田　辉等: 从油菜 (B rassica nap us L. cv. Topas)裂外壁小孢子培育出胚状体与小植株　　　　　　　　

长, 并辅以渗透压冲击等外界因素处理, 促使外壁
缓慢开裂。尽管如此, 要获得高的外壁破裂频率仍
存在较大困难, 同时, 与成熟花粉相比, 单核晚期
的小孢子在外壁开裂形成裂外壁小孢子后, 要进一
步获得完全的脱外壁小孢子, 则非常困难。存在以
上差别的原因可能在于, 单核晚期的小孢子与成熟
花粉相比, 在外壁成分、弹性及内外壁的联系上存
在一定差别。
彻底脱去小孢子的外壁和内壁无疑将大大提高
外源基因的导入频率, 但迄今为止其培养只在萱
草[ 12 ]及油菜[ 13 ]中取得较好结果, 获得了小细胞团,
而持续分裂以及后续发育仍存在着困难。前人的工
作表明脱外壁花粉可明显提高外源基因的导入频
率[ 7, 14 ] , 并在烟草中已成功地建立了脱外壁花粉人
工萌发与离体授粉的实验体系[ 15 ]。但关于脱外壁的
小孢子是否具胚胎发生能力, 仍鲜有研究。本研究
结果表明, 油菜脱外壁小孢子在现有的培养条件
下, 分裂频率较低, 且持续分裂存在一定困难。而
裂外壁小孢子具有胚胎发生与再生植株的能力, 且
其培养条件与完整小孢子的培养相似。完整小孢子
的饲养更有利于裂外壁小孢子胚胎发生的启动。这
样, 如能大量制备这种裂外壁小孢子, 可在转基因
操作后培养成转基因单倍体植株, 为油菜的基因工
程提供一条新途径。
在油菜小孢子的培养中, 一般认为只有均等分
裂才能导致胚胎发生, 分裂后, 先形成一无极性的
细胞团, 再在此基础上产生极性, 按照胚胎发生的
途径形成胚状体[ 4 ]。本实验结果表明, 裂外壁的小
孢子最初的分裂既有均等, 也有不均等分裂, 两者
均能导致胚胎发生。且与完整小孢子的胚胎发生相
比, 其早期的发育过程更接近于体内合子的发育。
或许, 利用裂外壁小孢子的胚胎发育模拟体内合子
的发育, 是一个很好的参照实验系统。
一个成熟的、实用性强的转化体系应具备高
效, 重复性高, 简易、快速、适用性广等条件[ 16 ]。
理论上说, 利用花粉作为外源DNA 媒介的转化体
系具有上述优点。因为, 不仅其群体数量大、易于
获得, 而且由于其单倍体的遗传背景, 获得的转基
因植株通过染色体人工加倍, 可得到纯合的二倍
体。同时, 小孢子经胚胎发生再生植株, 可减少离
体培养中的遗传变异, 其单细胞发育又可避免转基
因植株的嵌合体现象。因而, 70 年代后期至今, 已
有许多研究者试图利用小孢子进行作物遗传转化。
但对各种转化技术的应用花粉的厚壁都是一个明显
的不利因素。裂外壁小孢子一定程度上弥补了这一
缺点, 可能是一种有潜力的遗传转化新方法。
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Explana tion of Pla te
F ig. 1 T he exine of a m icro spo re just deh isced at one germ furrow (arrow ). Bar= 11 Λm; 　　F igs. 2～ 4 D ifferen t types of ex ine2deh isced
m icro spo res. A rrow s show the exine2deh isced part of m icro spo res; 　　F ig. 2 M o st part of a m icro spo re still covered by exine. Bar= 11 Λm. 　
　F ig. 3 A m icro spo re w ith its half part covered by exine. Bar= 12 Λm; 　　F ig. 4 A m icro spo re w ith its sm all part covered by exine. Bar= 14Λm; 　　F ig. 5 A n exine2deh isced m icro spo re p rio r to division. Bar= 9 Λm; 　　F ig. 6 DA P I fluo rescence im age of F ig. 5 show ing the po sit ion
of its nucleus (arrow ). Bar= 9 Λm; 　　F ig. 7 U nequal division of an exine2deh isced m icro spo re. A rrow show s the site w here new cell w all
fo rm ed. Bar= 9 Λm; 　　F ig. 8 Equal division of an exine2deh isced m icro spo re. A rrow show s new cell w all. Bar= 9 Λm; 　　F ig. 9 A n exine2
deh isced m icro spo re after first division. Bar= 7 Λm; 　　F ig. 10 DA P I fluo rescen t im age of F ig. 9 w ith the brigh t field background, show ing
two iden tical daugh ter nuclei (arrow s). Bar= 7 Λm; 　　F ig. 11 Second division of an exine2deh isced m icro spo re. A rrow s show the two division
p lanes perpendicu lar to each o ther. Bar= 9 Λm; 　　F ig. 12 Second division of an exine2deh isced m icro spo re. A rrow s show two paralleled divi2
sion p lanes. Bar= 8 Λm; 　　F ig. 13 A p roem bryo derived from an exine2deh isced m icro spo re w ith its em bryo still covered by exine (arrow s).
Bar= 9 Λm; 　　F ig. 14 A p roem bryo derived from an exine2deh isced m icro spo re w ith the basal suspenso r cell st ill covered by exine. Bar= 14Λm; 　　F ig. 15 A w ell differenciated em bryo derived from an exine2deh isced m icro spo re. Bar= 43 Λm; 　　F ig. 16 A p lan tlet regenerated from
the exine2deh isced m icro spo re. Bar= 0. 84 cm.
351 期　　　　　　田　辉等: 从油菜 (B rassica nap us L. cv. Topas)裂外壁小孢子培育出胚状体与小植株