全 文 ：第 26 卷 第 3 期 作　物　学　报 V ol. 26, N o. 3
2000 年 5 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ay, 2000
玉米雄性不育基因 (m s30)的 RFLP 作图X
梁业红　周洪生　蒋琬茹
(中国农业科学院作物育种栽培研究所, 北京, 100081)
提　要　以姊妹交第 5 代群体 (S IB 5) 和回交一代群体 (BC1) 为作图群体, 对经细胞学初步定位于玉米
第 4 染色体上的雄性不育基因 (m s30) 进行了 R FL P 作图。选用玉米第 4染色体上的探针 18个, 用集团
分离分析 (bulked segregatan t analysis, BSA )进行标记筛选, 用 Jo inM ap 作图软件进行统计分析。S IB 5
群体的 R FL P 分析表明, m s30基因与玉米第 4染色体长臂上的两个探针位点 um c15a 和 um c66a 连锁,
交换率分别为 5. 9% 和 14. 8%。BC1 群体的 R FL P 分析表明 um c19、um c15a、bn17. 65 和 csu178a 与
m s30 连锁, 遗传图距为: um c19214cM 2M s30 ö m s3024. 2cM 2um c15a21. 4cM 2bn17. 6523. 4cM 2csu178a。对
m s30基因的定位研究, 不仅为辅助育种打下基础, 而且可以有效地保护我国特有的种质资源。
关键词　玉米; 核雄性不育; m s30; BSA ; R FL P
RFL P M apping of a M a le Ster ile Gene (m s30) in M a ize
L IAN G Ye2Hong　ZHOU Hong2Sheng　J IAN G W an2R u
( Institu te of C rop B reed ing and Cultivation, Chinese A cad em y of A g ricultural S ciences, B eij ing , 100081)
Abstract　A sibling population S IB 5 and backcross population BC1 w ere app lied to m ap a m ale
sterile gene m s30 w h ich w as early located on ch romosom e 4 of m aize by B2A system. 18 p robes
from m aize ch romosom e 4 w ere used, and BSA w as p ractised to screen on R FL P s. By using
Jo inM ap softw are, linkage as w ell as genetic distance betw een m s30 and m arker loci w ere ob2
tained. T he m ain result as fo llow s: analysis on S IB 5 population show ed that m s30 w as linked w ith
um c15a and um c66a on m aize 4L , the recom bination value w as 5. 9% and 14. 8% , respectively.
In the BC1 population, um c19, um c15a, bn17. 65 and csu178a w ere found linked to m s30, the ge2
netic distance w as um c19214cM 2m s3024. 2cM 2um c15a21. 4cM 2bn 17. 6523. 4cM 2csu178a.
Key words　M aize; N uclear m ale sterility; m s30; BSA ; R FL P
利用雄性不育是商品化生产玉米杂交种子的最有效途径, 自从玉米 T 型细胞质不育系的
应用受到限制后, 胞质基因的利用受到挑战, 人们更加重视核不育基因的研究。迄今玉米上
已发现了 60 多份核雄性不育突变材料, 通过等位性测验等研究, 正式命名了 33 个玉米核不
育基因, 并用经典的细胞学方法将其中的 21 个定位到了染色体上[ 1 ]。但有关雄性不育基因的
分子标记研究, 尚未有正式报道。
X 本研究为国家自然科学基金课题 (批准号: 39480013)
收稿日期: 1998211207, 接收日期: 1999204229

李竞雄等在研究甜玉米材料时发现了一个雄性不育基因, 他用 B 2A 易位系把该基因定
位在玉米第 4 染色体上, 距离玉米甜质基因 su 为 11～ 19 个交换单位 (未发表) , 李竞雄等[ 2 ]
将其定名为m s30。周洪生等对m s30的花药发育过程进行了超显微观察, 发现基足层还未形成,
小孢子就退化了, 小孢子和绒毡层细胞内含物全部降解变空。
R FL P 标记是 80 年代兴起的以DNA 多态性为基础的一类新型遗传标记, 近年来各主要
农作物上均有许多重要农艺性状基因被标记或定位[ 3～ 10 ]。玉米上已有 195 个基因被定位到
R FL P 连锁图上[ 11 ]。
本文用R FL P 方法对雄性不育基因m s30进行分子标记作图, 进而为分子标记辅助育种打
下基础。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
姊妹交第 5 代群体: ( (2603SuSu m s30 m s30 ö 2611susuM s30M s30) F 2) S IB 5。
BC1 群体　以m s30基因的纯系 6960 作母本与自交系中黄 17 配制的回交一代群体 (m s30
m s30 ö ö m s30 m s30 ö M s30M s30)。
S IB 5 群体、BC1 群体及其父母本分别于 1996 年和 1997 年春, 播种于中国农业科学院作
物所试验地, 雄花开花后即对其育性进行调查。
1. 2　RFL P 探针克隆
根据m s30基因细胞学染色体定位的结果, 参考美国密苏里大学 1996 年玉米 R FL P 连锁
图 (UM C M aize R FL P M ap) , 选择玉米第 4 连锁群上的探针 18 个。这些探针均由美国密苏里
大学玉米探针库惠赠。
1. 3　D NA 的提取
取玉米嫩雌穗或叶片 5～ 10g 用液氮磨碎, 加入提取液 (含 100 mmolö L T ris 8. 0, 20
mmolö L ED TA 8. 0, 500 mmolö LN aC l, 1. 25% SD S) 于 65 ℃保温 40 m in, 然后加入 5 molö L
KC l 冰浴 20 m in 后, 加入 5 m l 氯仿 ö 异戊醇混合液 (体积比为 24∶1) 混匀离心, 用预冷的异
丙醇沉淀DNA。分别用 RNA 酶、酚ö 氯仿 (酚、氯仿等体积混匀) 及氯仿ö 异戊醇 (体积比为
24∶1)对DNA 进行纯化。
1. 4　RFL P 分析
本试验DNA 的酶解、电泳、DNA 的 Southern 转移、探针的标记、分子杂交及放射自显影
等R FL P 分析均参照密苏里大学玉米 R FL P 程序手册 (UM C M A IZE R FL P PROCEDU R ES
M ANUAL , 1993)。
1. 5　连锁分析
采用 Jo inM ap 软件 (V ersion1. 4, P. Stam 1993) [ 12 ]进行连锁分析和遗传作图。
2　结果与分析
2. 1　田间雄花育性调查及m s30基因的遗传
对田间姊妹交群体 S IB 5 的 135 个单株进行雄花育性调查。结果为: 不育株∶可育株=
71∶64, 经位点分离比测验, V2= 0. 36< V20. 01。
7623 期　　　　　　　　　　梁业红等: 玉米雄性不育基因 (m s30)的R FL P 作图　　　　　　　　　　　　

　　对田间回交一代 (BC1) 群体随机抽取 120 个植株进行雄穗育性调查, 不育株为 64, 可育
株为 57, 位点分离比 V2= 0. 36, 也远小于 V20. 01, 1 (6. 63)。
两个群体中植株的雄性不育与雄性可育的分离比例均符合孟德尔 1∶1 的分离比, 表明
雄性不育性状是由m s30单隐性基因控制的。
2. 2　RFL P 遗传作图结果
2. 2. 1　S IB 5 群体作图　　随机挑取可育株 (F) 与不育株 (S)DNA 样品各 17 个, 分别构成可
育株集团 (bulked fertility, BF)和不育株集团 (bulked sterility, BS)。以玉米第 4 染色体长臂上
的 3 个探针 (um c66a、um c15a 和 um c111a) 及第 4 染色体短臂上的 3 个探针 (um c14a、csu100
及 um c31a) , 与H ind¸ 、B am H É 和D ra É 三种限制性内切酶组成 18 个 (6×3)探针 ö 酶组合,
对BF、BS 进行R FL P 标记筛选, 结果 um c15a 与上述 3 种酶的组合在BF、BS 间检测到多态
性 (图 1) , um c66a ö ö D ra É 检测到在BF 中出现而BS 缺少的一条高分子量特异带。
图 1　　S IB 5 群体中, um c15a 与经D ra É 、B am H É 和H ind¸ 酶切的BF、
BS DNA 进行 Southern 杂交结果
BF: 可育集团, BS: 不育集团。箭头示特异带
F ig. 1　　Southern hybridization patterns of BF and BS from S IB 5 digested
w ith D ra É 、B am H É and H ind¸ p robed w ith um c15a.
BF: bulked fertility, BS: bulked sterility. The arrow s indicate po lymorphism bands.
　　分别用 um c15a ö H ind
¸ 和 um c66a ö D ra É 探针ö
酶组合对群体的 68 个单
株 (可育株与不育株分别
为 34 株) 进行多态性检
测, um c15a ö H ind ¸ 在 33
个可育单株检测到与 BF
相同的特异带, 31 株不育
株无此特异带, 交换型个
体为 4 个; 而 um c66a ö D ra
É 则在 68 个单株中检测
到 10 个交换型, 其他单株
为可育株有BF 的特异带,
不育株无此特异带。经连
锁 测 验, V2(um c66a2m s30) =
49. 5, V2(um c15a2m s30) = 60. 2,
均远大于 V2(1, 0. 01) (6. 63) ,
表明m s30基因与第 4 染色
体长臂上的 um c66a 及 um c15a 连锁, 交换率分别为 14. 8% 和 5. 9%。
2. 2. 2　BC1 群体的 R FL P 作图　　随机挑选可育株和不育株DNA 样品各 15 个等量混合,
分别构成可育集团 (BF)和不育集团 (BS)。
选用上述 S IB 5 群体中检测到R FL P s 的探针 um c15a、um c66a 以及 um c15a 与 um c66a 区
域内或附近的探针共 14 个 (um c15a、um c66a、um c19、bn17. 65、csu91a、agrp168、csu178a、
bn l15. 07、um c158、asg9a、asg33a、um c127c、asg85、asg27) , 与H ind¸ 、E coR É 、B am H É 、
E coR ˝ 4 种限制性内切酶组成 56 个 (4×14)探针 ö 酶组合, 对回交群体的BF、BS 及父本 (P2)
和母本 (P1) 进行 R FL P 分析, 结果 um c66a 与 E coR ˝ , um c19 与 H ind¸ , bn17. 65 与 H ind
¸ 、E coR É 及 E coR ˝ , um c15a 与H ind¸ 、E coR É 和B am H É , csu91a 与B am H É , csu178a
与 E coR ˝ 等探针ö 酶组合检测到在父本及 BF 中出现而母本及BS 中缺少的特异带。
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图 2　　BC1 群体 Southern 杂交结果
2a: um c15a ö H ind¸ 分子杂交结果; 2b: bn17. 65 ö E coR ˝ 分子杂交结果
P1: 母本 (m s30 m s30) , P2: 父本 (M S 30M S 30) , F: 可育单株, S: 不育单株, R: 交换型, 箭头示特异带
F ig. 2　　Southern analysis of BC1
2a: DNA digested w ith H ind¸ p robed w ith um c15a; 2b: DNA digested w ith E coR ˝ p robed w ith bn17. 65
P1: Fem ale parent (m s30 m s30) , P2: M ale parent (M s30M s30) , F: Fertility, S: Sterility,
R: Recom bination, arrow s show polymorphism bands
表 1　　RFLP 标记遗传作图数据
Table 1　　M ap data from RFLP analysis
标记 1
M arker1
标记 2
M arker2
图距 cM
D ist. cM
交换值
Rec %
LOD 值
LOD
csu178a bn17. 65 3. 4 7. 8 16. 4
csu178a um c15a 4. 9 4. 4 20. 0
csu178a M s30 ö m s30 9. 1 7. 8 16. 4
csu178a um c19 23. 0 21. 1 6. 9
bn17. 65 um c15a 1. 4 3. 3 21. 4
bn17. 65 M s30 ö m s30 5. 6 6. 7 17. 5
bn17. 65 um c19 19. 6 15. 6 10. 2
um c15a M s30 ö m s30 4. 2 5. 6 18. 7
um c15a um c19 18. 2 16. 7 9. 5
M s30 ö m s30 um c19 14. 0 17. 8 8. 8
　　选用其中的 um c19、um c15a、bn17. 65 和
csu178a 对BC1 群体 90 个单株进行 R FL P 分析,
进一步证实了它们与m s30的共分离关系: 在 90 个
单 株 中, um c19 ö H ind ¸ 、 um c15a ö H ind ¸ 、 bn
17. 65 ö E coR ˝ 、csu178a ö E coR ˝ 分别检测到 16
个、5 个、6 个和 7 个交换型个体。um c15a ö H ind
¸ 、bn 17. 65 ö E coR ˝ 分子杂交的部分结果见图 2。
　　对检测到的R FL P s 用 Jo inM ap 作图软件进行
处理, 结果见表 1。据此构建出m s30的分子标记图
谱 (图 3)。
9623 期　　　　　　　　　　梁业红等: 玉米雄性不育基因 (m s30)的R FL P 作图　　　　　　　　　　　　

图 3　　M s30 ö m s30的RFL P 图谱
F ig. 3　　RFL P m ap of M s30 ö m s30
3　讨论
用姊妹交群体 S IB 5 和回交群体BC1 对m s30进行R FL P 遗传
作图的结果一致表明, m s30基因位于玉米第 4 染色体长臂上, 这
一结果与李竞雄先生用B2A 易位系初步定位的结果是一致的,
但本研究的定位更精细, 距离最近的标记只有 4. 2 cM。
　　本研究得到 m s30 图谱为 um c19214cM 2M s30 ö m s3024. 2 cM 2
um c15a21. 4 cM 2bn 17. 6523. 4 cM 2csu178a, 与最新发表的 um c
m aize R FL P m ap 比较, um c19、bn17. 65 和 csu178a 的排列顺序
一致, 而 um c15a 与 bn17. 65 的顺序颠倒, 但距离只有 1. 5 cM ;
各位点之间的图距也不完全符合, 可能的原因是亲本材料、作图
群体不同, 作图群体大小也不相同所致。
m s30与 um c19 的图距为 14 cM , 为达到更精确作图的目的,
曾选用不同位置探针进行多态性检测, 但均未找到新的 R FL P
标记。表明所用群体的亲本在该区间内现有探针位点上没有多
态性。拟用A FL P 或 SSR 标记筛选更紧密连锁的标记。
um c15a、bn17. 65 距离m s30分别只有 4. 2 cM 和 5. 7 cM , 利
用单个标记或双标记进行辅助选择, 每个世代直接选择m s30m s30
个体与自交系杂交, 最后自交一次, 选育出不育系 (m s30 m s30) ,
从而可大大加速育种进程。
参　考　文　献
1　A lbertsen M C. M aize Genetic N ew sletter, 1996, 70: 30～ 31
2　李竞雄, 周洪生, 孙荣锦主编. 玉米雄性不育生物学, 北京: 中国农业出版社, 1998. 74
3　贾继增, 中国科学 (B)辑. 1993, 23 (6) : 589～ 594
4　石永刚, 郑用琏, 李建生等. 作物雄性不育及杂种优势研究进展, 北京: 中国农业出版社, 1996, 163～ 169
5　David Zaitlin, Sandra Dem ars, Yu M a. Genom e, 1993, 36: 555～ 563
6　Huang N , E R A ngeles, J Dom ingo et al. T heor A pp l Genet, 1997, 95: 313～ 320
7　Kamp s T L , C D Chase. T heor A pp l Genet, 1997, 95: 525～ 531
8　Chm er J M , K J Chalm ers, S M anning. T heor A pp l Genet, 1997, 94: 1060～ 1064
9　M ohan M , S N air, J S Bentur et al. T heor A pp l Genet, 1994, 87: 782～ 788
10　Zhang G, T S Bharaj, S S V irm ani. T heor A pp l Genet, 1997, 94: 27～ 33
11　M ary Polacco. M aize Genetic N ew sletter, 1997, 71: 120
12　Stam P. T he P lant J ournal, 1993, 3 (5) : 739～ 744
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