全 文 ：第 26 卷 第 4 期 作　物　学　报 V ol. 26, N o. 4
2000 年 7 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA July, 2000
拟南芥菜花药绒毡层启动子的克隆和序列分析X
刘大文　谢友菊　王守才　戴景瑞
(中国农业大学, 北京, 100094)
提　要　以拟南芥菜 (A rabidopsis thaliana) 基因组DNA 为模板, 通过 PCR 扩增得到绒毡层特异表达基
因A 9的启动子片段, 克隆到pU C18载体上。序列分析表明, 该启动子大小为360 bp, RNA 聚合酶识别
序列 TA TA box, 花药特异表达和增强序列 T GT GG、T GT GA 两个M otifs 皆完整, 与已报道的序列比
较仅有3个核苷酸发生改变, 同源性为99. 2%。该启动子与GU S 基因融合后用基因枪转化玉米花药,
荧光分析显示花药中有GU S 酶活性存在。
关键词　拟南芥菜; 启动子; 花药特异表达; 遗传转化
Isola tion and Sequenc ing Ana lysis of the Promoter for an An ther-
spec if ic Gene from A rabidopsis tha liana
L IU D a2W en　X IE You2Ju　WAN G Shou2Cai　DA I J ing2R ui
(China A g ricultural U niversity , B eij ing 100094)
Abstract　T he up stream regulato ry region of the tapetal2specific gene A 9 w as amp lified from
A rabidop sis thaliana genom e by po lym erase chain reaction and cloned in to H inc˚ and K p n É site
of pU C18. Sequence analysis show ed that the cloned fragm en t con tained 364 nucleo tides, and
shared a sequence homology of 99. 2% w ith the repo rted A 9 p romoter. T he putative TA TA box
w as p resen t at position - 76 to - 69. Two motifs, T GT GG and T GT GA , w h ich w ere
considered to be responsible fo r the specificity and enhancem en t of gene exp ression in the tapetal,
w ere found w ith in - 291 to - 287 and - 243 to - 239 region respectively. Gene construct that
con tained the B2glucuron idase (GU S ) gene under the con tro l of A 9 p romoter o r CaM V 35s
p romoter w as in troduced in to an thers and calli of m aize by particle bom bardm end. T he GU S
activity w as detected on ly in an thers by fluo rom etric assay.
Key words　A rabid op sis thaliana; P romoter; A n ther2specific exp ression; Genetic transfo rm ation
植物的生长发育受基因调控, 启动子是调控基因表达的关键元件之一。启动子有组成型
启动子 (constitu tive p romoter) 和组织特异性启动子 ( tissue2specific p romoter) 两类, 前者在所
有组织中都启动基因表达, 后者仅在特定的组织中和一定的发育时期启动基因表达, 它们是
分析和调控基因表达的有力工具。由于植物有性生殖的重要性, 某些与花粉发育有关的组织
特异性启动子, 如 TA 29、L at52、O sg 6B、Zm 13、S 1等得到了详细研究, 并用于调控植物的花
粉发育[ 1 ]。M arian i等将烟草花药绒毡层特异启动子 TA 29与核酸酶基因B arnase、RN aseT 1融
X 本研究得到国家“九五”攻关项目支持 (962002202204)
收稿日期: 1998212202, 接受日期: 1999210208

合后转化植物, 核酸酶基因在花药中特异表达, 破坏绒毡层, 获得雄性不育烟草和油菜[ 2 ] ,
开创了基因工程创造雄性不育性的先河, 迄今已在烟草[ 2, 3, 4 ]、油菜[ 2, 5, 6 ]、玉米[ 7 ]、小麦[ 8 ]、
花椰菜[ 9 ]、莴苣[ 9 ]等作物上获得成功。我们从拟南芥菜 (A rabid op sis thaliana) 中克隆到花药绒
毡层启动子, 为植物雄性不育基因工程提供新的启动子元件。
1　材料与方法
1. 1　材料
拟南芥菜 (A rabid op sis thaliana)由中国农业大学植物生理室提供, 克隆载体 pU C18、宿主
菌 E. coli DH 5A菌株由中国农业大学分子遗传室提供。带 CaM V 35s2GU S 基因的质粒 pU G1
和 Zm 132GU S 基因的质粒 pU G2由本实验室构建。dN T P s、T aq DNA 聚合酶、 IPT G、X2gal
系M B I 公司产品, GU S 检测底物M U、M U G 系 Sigm a 公司产品。限制性内切酶 H inc˚ 、
K p n É 、E ocR É 系 P rom ega 公司产品。Q IA quick 凝胶纯化试剂盒系德国Q IA GEN 公司产品。
PCR 引物由上海生物工程公司合成。
1. 2　方法
1. 2. 1　DNA 的提取[ 10 ]　　取0. 1g 拟南芥菜幼苗经液氮研磨后加入预热至65℃的CTAB 分
离缓冲液中保温30 m in, 冷却至室温后加入等量的氯仿÷ 异戊醇 (24 ÷ 1)混匀, 静置10 m in 后以
4000 r ö m in 离心15 m in。吸出上清液, 加入等体积的异丙醇沉淀DNA , 70% 乙醇漂洗, 空气
干燥, 溶于500 LL T E 中。上述DNA 溶液用酚 ÷ 氯仿 (1 ÷ 1)、氯仿 ÷ 异戊醇 (24 ÷ 1) 各抽提1次,
2倍体积的无水乙醇沉淀, 70% 乙醇漂洗, 空气干燥, 溶于适量 T E 中。
1. 2. 2　PCR 扩增　　根据 Paul等报道的序列[ 11 ]设计5′端引物 (5′TA T GT TAA CCA CTAA 2
TCAA GC23′)和3′端引物 (5′2A GA GGTA CCA T TCTAA T TA GA 23′)各21个核苷酸。为了便于
定向克隆和载体构建, 在5′端引物和3′端引物的5′端分别引入 H inc˚ 和 K p n É 酶切位点。扩
增反应体系为25 LL , 其中含有模板20 ng, 5′端引物和3′端引物各20 ng, 4dN T P 各0. 2 mmolö
L , M gC l21. 5 mmolö L , 1×T aq DNA 聚合酶Buffer, 1U T aq DNA 聚合酶。循环程序为94℃
预变性5 m in, 然后进入循环, 94℃变性45s, 56℃退火1 m in, 72℃延伸40s, 30个循环, 最后
72℃延伸5 m in。扩增反应在 PTC2200型 PCR 仪上进行。
1. 2. 3　PCR 产物的回收　　PCR 反应完成后, 在琼脂糖凝胶上电泳检查扩增片段的特异性
和片段大小。然后将含有目的片段的胶块切下, 按照Q IA quick 凝胶纯化试剂盒操作指南纯
化目的片段, 溶于30 LL T risı C l(pH 8. 0)洗脱液中。
1. 2. 4　重组子克隆的筛选鉴定　　在含100 Lg ö mL 氨苄青霉素的LB 固体培养基上加入40
LL X2gal(20 m g ö mL ) 和4 LL IPT G (200 m g ö mL ) , 涂抹均匀, 待平板干燥后涂抹转化反应产
物, 37℃培养14～ 16h, 置于4℃冰箱中放置3～ 4h, 使蓝斑充分显现。挑取白色菌落培养, 碱
法小量提取质粒DNA , 电泳鉴定出大于载体的质粒, 进一步经酶切, 电泳分析插入片段的大
小。
1. 2. 5　克隆片段的序列分析　　用 Sanger 等的链端终止法测定DNA 序列。碱法大量提取
重组质粒DNA , PEG 纯化, 调节浓度至1 Lg ö LL , 然后用终浓度0. 2 molö L 的N aOH 65℃变性
15 m in, 0. 4倍体积5 molö L N H 4A c 中和, 乙醇沉淀变性质粒DNA , 70% 乙醇洗盐, 真空干
燥。以变性质粒DNA 为模板, 加入5′端和3′端引物, 测序缓冲液, 48℃退火90s, 在AB I公司
377型自动测序仪上测序。测序工作由北京赛百盛生物工程公司完成。
7044 期　　　　　　　　刘大文等: 拟南芥菜花药绒毡层启动子的克隆和序列分析　　　　　　　　　　　　

1. 2. 6　启动子活性测定　　取2～ 2. 5 mm 长 (约为四分体至单核小孢子阶段) 的花药, 经表
面消毒后切成2～ 3段, 置于N 6培养基上铺成直径为2 cm 的圆形区域, 1h 内进行基因枪转化。
按照 K lein 等[ 12 ]的方法制备金粉微载体, 包裹质粒后用基因枪轰击花药, 每个样品轰击2枪,
然后于26℃培养48h。样品室真空度26 inches H g, 可裂膜压力1350 p si, 微弹飞行10 cm. GU S
基因活性分析采用 Jefferson 等的荧光分析法[ 13 ]。取50 LL GU S 提取液加入到预热至37℃的
0. 5 mL GUS 检测液中, 37℃反应10 m in, 然后将0. 5 mL 反应液加入到4. 5 mL 终止缓冲液中
终止反应。用M U 标准液校正荧光分光光度计, 在365 nm 激发波、455 nm 发射波长下测定
M U 标准液的荧光强度, 做标准曲线。在同样条件下测定样品的荧光强度, 从标准曲线上查
出各样品的M U 值, 计算GU S 活性。
2　结果与分析
2. 1　启动子片段的扩增和克隆
以拟南芥菜DNA 为模板, 5′端引物和3′端引物进行扩增得到一条DNA 片段, 经1. 7% 琼
脂糖凝胶电泳, 100 bp ladder 作标准分子量进行分析, 表明为一条长约350 bp 的特异扩增条
带 (图12B)。由于两个引物 GC 含量偏低 (33. 3% ) , 为了检验其特异性, 又重复进行5次扩增,
结果完全一致, 说明这一扩增反应具有极高的特异性。这一特异扩增带可能是启动子片段。
图1　　PCR 产物电泳结果
F ig. 1　　A garose gel electrophoresis
of PCR p roduct
L ane A : 100 bp ladder;
L ane B: PCR 产物 PCR p roduct
　　将 PCR 产物回收后, 经Q IA quick 试剂盒纯化, 用
H inc˚ 和 K p n É 双酶切, 再次用Q IA quick 试剂盒纯
化, 与同样酶切的 pU C18连接, 转化 E. coli DH 5A感受
态细胞。在2个平板上长出80多个白色菌落, 随机挑取
12个菌落培养, 提取质粒后进行电泳分析, 有8个菌落
的质粒其两条DNA 带明显慢于 pU C18, 说明这些质粒
的分子量大于克隆载体, 可能插入有启动子片段。
在 PCR 的两引物中设计有H inc˚ 和 K p n É 酶切位
点, 用这两种酶酶切可以鉴定重组质粒中的插入片段。
上述8个克隆的质粒经H inc˚ 和K p n É 酶切后产生两条
带, 一条带大小为2. 7 kb, 系克隆载体; 另一条带约为
350 bp , 与 PCR 产物大小一致, 系启动子片段。根据
A 9启动子的序列, 在- 59 bp 处有一 E coR É 酶切位点,
在载体 pU C18上还存在一 E coR É 位点, 因此用H inc˚
和 E coR É 酶切重组质粒, 应产生约300 bp 和70 bp 的片
段。上述8个克隆的质粒经 H inc˚ 和 E coR É 酶切皆产
生300 bp 和70 bp 两片段 (图略) , 这说明克隆的片段中
E coR É 位点存在, 酶切鉴定克隆是正确的, 把其中1号
克隆的重组质粒命名为 pA 9。
2. 2　PCR 扩增片段的序列分析
对 pA 9中的插入片段进行序列分析, 结果表明该片段大为364 bp , 与 Paul 等报道的序
列[ 11 ]比较, 有3个碱基发生了变化: - 237位的A 被 T 替代, - 233位的A 被 G 替代, - 151
位的C 被T 替代, 同源性为99. 2%。RNA 聚合酶结合区域TA TA box 序列为TA TAAA TA ,
804　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26 卷

位于- 76～ - 69; 花粉特异表达及增强序列 (M otifs) T GT GG 位于- 291～ - 287, T GT GA 位
于- 243～ - 239 (图2)。这三个关键序列与Paul等的结果完全一致, 说明pA 9中的H inc˚ 2
图2　　PCR 片段的序列 (a)及其与A 9启动子的序列 (b)的比较
3 示有差异的核苷酸　+ 示为设计 K pn É 位点而改变的核苷酸
F ig. 2　　Sequence of PCR fragm ent from A rabid opsis thaliana (a) and its comparison w ith that of A 9 p romoter (b)
3 sym bol for different nucleo tides　+ sym bol for changed nucleo tide necessary for K pn É site
图3　　GU S 基因在玉米花药和愈伤组织
中表达的荧光检测
F ig. 3　　The fluorom etric assay of the transient
exp ression of GU S gene in anthers and calli of m aize
K p n É 片段为A 9启动子。
2. 3　启动子片段的活性分析
为了测定启动子的活性, 用 H ind¸ 和 K p n
É 酶切 pA 9, 回收约0. 35 kb 的启动子片段, 替
换 pU G2中的 Zm 13启动子, 构建成A 9启动子启
动的GU S 基因表达载体 pA 9GU S。
　　将pU G1和pA 9GU S 分别包裹在金粉上, 用
基因枪转化花药。荧光分析表明, 未转化花药无
内源活性。pU G1转化的花药能检测到 GU S 活
性, 但较低; pA 9GU S 转化的花药 GU S 酶活性
较高, 可达1. 72 nm. ö m in. m g p ro tein, 为前者的
5. 4倍, pU G1转化愈伤组织几乎检测不到 GU S
酶活性 (图3)。可见, A 9启动子在玉米花药中具
有功能。
9044 期　　　　　　　　刘大文等: 拟南芥菜花药绒毡层启动子的克隆和序列分析　　　　　　　　　　　　

3　讨论
花药特异启动子是构建雄性不育基因和恢复基因的关键元件。目前已发现数十种花药或
花粉特异表达基因, 并从中分离出启动子, 但应用于构建雄性不育基因和恢复基因的不多,
主要是 TA 29、O sg 6B、S 1、SL 9、Zm l3等[ 1, 14～ 17 ]。TA 29系花药绒毡层特异启动子, 其与
Barnase 基因的融合基因转化植物, 已在烟草[ 2, 3, 7 ]、油菜[ 2, 5, 6 ]、玉米[ 7 ]等作物上获得雄性不
育, 是植物基因工程创造雄性不育的有效途径。但 TA 292B arnase 基因导致的雄性不育对温度
敏感, 当温度升高后出现育性回复可育的现象[ 8 ]。对转基因烟草和油菜的研究表明, 当温度
低于20℃时不育性稳定, 温度升高到25℃时开始转育, 30℃时大部分可育[ 6, 19 ]。目前尚不清
楚这种敏感性的原因, 据推测可能与 TA 29启动子受温度调控有关。因此, 利用新的启动子是
创造雄性不育性的关键。
A 9启动子是 Paul 等用油菜A 9基因做探针, 从拟南芥菜花药 cDNA 文库中筛选到的绒毡
层特异启动子, 启动基因在花粉母细胞减数分裂至小孢子有丝分裂间期表达[ 11 ] , 比 TA 29早。
其启动B arnase 基因在烟草绒毡层中表达, 产生完全的雄性不育, 不育性十分彻底[ 11 ]。我们
克隆的启动子与 Paul 等的一致, 证明是A 9启动子, 其与 GU S 的融合基因转化玉米花药, 在
花药中特异表达GU S 酶活性。可见, A 9启动子与 TA 29启动子一样, 在单子叶植物玉米中具
有功能可用其构建雄性不育基因, 创造雄性不育性。
参　考　文　献
1　李胜国, 刘玉乐, 田波等. 生物工程进展, 1997, 17 (2) : 17～ 22
2　M ariani C M , De Beucreleer, J T ruettner. N ature, 1990. 737～ 741
3　李胜国, 刘玉乐, 朱峰等. 植物学报, 1995, 37 (8) : 659～ 660
4　Zan X Y, H M W u, A Y Cheung. S ex P lant R ep rod. , 1996, 9: 35～ 45
5　周雪荣, 彭仁旺, 方荣祥等. 遗传学报, 1997, 24 (6) : 531～ 536
6　钟蓉, 刘玉乐, 朱峰等. 植物学报, 1996. 38 (7) : 582～ 585
7　M ariani C, C Halluin, C D ickburt. In: A bstract 35th A nnu M aize Genetics Conf , U niversity P ress, North Dakota State
U niversity, 1993. 45
8　De block M , D Debrouw er, T M oens. T heor A pp l Genet, 1997, 95: 125～ 131
9　Regnaerts, A. S ci H orti, 1993, 55: 125～ 139
10　Doyle J J , J L Doyle, L H Bailey. Focus, 1990, 12: 13～ 15
11　PaulW , R. Hodge, S Sm artt et al. P lant M ol B iol, 1991, 19: 611～ 622
12　Klein T M , L Kornstein, J C Sanford et al. P lant P hy sio, 1989, 91: 440～ 444
13　Jefferen R A , T A Kavanagh, M W Bevan et al. EM B O J , 1987, 6 (13) : 3901～ 3907
14　彭仁旺, 周雪荣, 周亦华等. 生物工程学报, 1996, 12 (3) : 247～ 250
15　Yokoi S, T T suchiyg, K Torigam a et al. P lant Cell, 1997, 16: 363～ 367
16　Zou J T , X Y Zhan, H M W u et al. A m er J B ot, 1994, 81 (5) : 552～ 561
17　Hanson D D , D A Ham ilton, J L T ravis. P lant Cell, 1989, 1: 173～ 179
18　DenisM , R Delorm e, J P Gourret. P lant P hy sio, 1993, 101: 1295～ 1304
19　李胜国, 刘玉乐, 朱峰等. 植物学报, 1997, 39 (3) : 221～ 225
014　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26 卷