全 文 ：第 27 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 27, N o. 6
2001 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2001
利用细胞学和 RAPD 技术鉴定抗病小偃麦易位系Ξ
王洪刚1　朱　军2　刘树兵1
(1山东农业大学农学系, 山东泰安 271018; 2 浙江大学农业与生物技术学院, 浙江杭州 310029)
提　要　本研究对从中间偃麦草与小麦杂种后代中选育的小偃麦种质系 GP143, 在进行白粉病和条锈
病抗性鉴定的基础上, 对其进行了细胞学和RA PD 鉴定。结果证明 GP143 兼抗白粉病和条锈病, 其根
尖细胞染色体数为 42, 花粉母细胞减数分裂中期 I(PM C M I) 染色体构型为 2n= 21Ê , 在它与小麦的
杂种 F 1PM C M I染色体构型中, 常观察到四价体; 对 GP143 及其双亲进行RA PD 分析, 从 40 个随机
引物中筛选出 4 个引物能够扩增出中间偃麦草亲本的特异DNA 片段。初步确定 GP143 是一个小偃麦
易位系。
关键词　小偃麦易位系; 抗病性; 细胞学; RA PD
Iden tif ica tion of T r itely tr ig ia Tran sloca tion L ine w ith D isea se
Resistance by Cytology and RAPD Ana lys is
W AN G Hong2Gang1　ZHU Jun2　L IU Shu2B ing1
(1 A g ronomy D ep artm en t of S hand ong A g ricu ltu ra l U niversity , T aian 271018; 2A g ricu ltu re and B iotechnology Colleg e of
Z he j iang U niversity , H ang z hou, 310029, Ch ina)
Abstract　　T ritely trig ia germ p lasm line GP143 w ith good resistance to pow dery m ildew
and stripe ru st, w h ich cam e from the p rogeny of E ly trig ia in term ed ium and Yannong15, w as
iden t if ied by cyto logy and RA PD analysis. T he resu lts show ed tha t ch rom o som e num ber of
GP143 in roo t t ip cell w as 42, ch rom o som e configu ra t ion of GP143 in PM C M I w as 2n= 21Ê , and quadriva len t w as ob served in PM C of (F 1 ) hyb rid betw een GP143 and differen t
w heat variet ies. GP143 and its paren ts w ere fu rther ana lyzed by RA PD m ethod. 40 random
p rim ers w ere u sed fo r RA PD am p lif i ca t ion, the specif ic DNA of E. in term ed ium can be
am p lif ied by 4 of them in GP143. T herefo re, GP143 w as p roved as a tran sloca t ion line.
Key words　　T ritely trig ia t ran sloca t ion line; D isease resistance; Cyto logy; RA PD
在小麦的遗传改良中, 将小麦亲缘野生物种中携带优良基因的染色体片段转移到小麦染
色体上, 育成异源易位系, 是拓宽小麦遗传基础, 创造新种质或培育新品种的重要途径。关
于异源易位系的鉴定方法随着遗传学的发展, 已由传统的形态学方法和细胞学方法发展到生
化和分子生物学方法。
RA PD 技术 (R andom Am p lif ied Po lym o rph ic DNA ) 是由W illiam s[ 1 ]等发展起来的一项
分子生物学技术。由于在其应用过程中, 与其他分子生物学技术相比, 它具有程序较为简单、Ξ 本研究由国家自然科学基金资助。(批准号: 39970458)
收稿日期: 2000208204, 接受日期: 2001202204
Received on: 2000208204, A ccep ted on: 2001202204

操作方便、所需样品量少等优点, 不仅在基因定位、遗传作图和分子标记研究方面, 而且在
异源遗传物质的检测中已被广泛应用。刘树兵[ 2 ]等通过RA PD 分析建立了长穗偃麦草 1E 和
3E 染色体的特异RA PD 标记。徐琼芳[ 3 ]等, 王洪刚[ 4 ]等利用 RA PD 技术分别标记了抗黄矮
病和抗白粉病小麦—中间偃麦草染色体异附加系。Q i[ 5 ]等成功地利用RA PD 标记, 跟踪和鉴
定了小麦—簇毛麦 6AL ö6V S 易位系抗白粉病基因 Pm 21。鲍晓明[ 6 ]等利用 RA PD 技术鉴定
了两个小冰麦易位系。
本研究对从中间偃麦草与小麦杂种后代中选育的小偃麦种质系 GP143, 在抗病性鉴定的
基础上, 利用细胞学和RA PD 技术进一步进行了鉴定。
1　材料和方法
1. 1　材料
本研究利用的材料中间偃麦草 (E ly trig ia in term ed ium , 2n= 42)和普通小麦品种烟农 15、
铭贤 169、辉县红, 均为本实验室保存, 小偃麦种质系 GP143 是由本实验室从烟农 15 与中间
偃麦草杂交后代中选育而成。
1. 2　方法
1. 2. 1　抗病性鉴定　　白粉病的鉴定是将待鉴定材料冬播于温室内, 行长 40 cm , 行距 18
cm , 每行播种 30 粒, 重复两次。同时以感病品种铭贤 169 和辉县红作为对照并种成感染行。
在感染行内接种白粉病 15 号菌种, 当其大量繁殖后采集菌种抖洒在待鉴定材料叶片上, 同时
借助感染行进行诱发感染。苗期抗性按 0、0. 5、1、2、3、4 六级标准调查。成株抗性鉴定是在
试验网室内进行, 方法同前, 抗病性按 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 十级标准调查。条锈病抗
性鉴定是在试验网室进行, 种植方法同前。在拔节期, 采用注射法对待鉴定材料和感染行材
料接种条中 27、29、30、31 和水源 46 混合菌种, 待感染行材料充分发病后按 0、1、2、3、4、
5 六级标准调查抗病性。两种病害调查均只记载反应型和发病率, 发病率以感病植株占调查
植株总数的百分数表示。
1. 2. 2　细胞学鉴定方法　　根尖细胞学鉴定是取适宜根尖低温预处理 24 小时, 法氏固定液
固定, 铁矾—苏木精方法压片镜检。花粉母细胞染色体构型鉴定是取适期花药, 卡诺液固定,
席夫试剂染色压片镜检。
1. 2. 3　RA PD 鉴定　　DNA 的提取采用 Sharp s[ 7 ] 等提出并经 D evo s[ 8 ] 等改进的方法。
RA PD 扩增引物为中国科学院遗传研究所分装美国Operon 公司生产的十聚体核苷酸, 本实
验所用 40 个引物为 E 组和 F 组。扩增反应体积为 20ΛL , 其中包括 10m m o löL T ris·C l,
pH 8. 5, 50 mm o löL KC l, 2. 5 mm o löL M gC l2, 600 Λm o löL dN T P, 15 ng 引物, 20 ng 模板
DNA , 0. 8U T aq 酶。反应在DNA T herm al Cycler 480PCR 仪上进行, 每个循环 94℃变性 15
秒, 36℃复性 30 秒, 72℃延伸 45 秒, 46 个循环后, 在 72℃保温 4 分钟。扩增产物用 1. 4% 琼
脂糖凝胶电泳分离, 紫外灯下观察结果并拍照。
2　结果与分析
2. 1　抗病性鉴定
小偃麦种质系 GP143 是从烟农 15 与中间偃麦草杂种后代中选育出的高代稳定材料, 株
高 80 cm , 繁茂性好, 多花多实, 综合性状较为优良, 植株形态明显具有双亲的特征。对其抗
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白粉病和条锈病的鉴定结果 (表 1) 表明, 小偃麦种质系 GP143 苗期和成株期对白粉病 15 号
菌种和对条锈病混合菌种的反应型级值和发病率均较低, 对以上两种病害均具有良好的抗
性, 这说明小偃麦种质系 GP143 兼抗白粉病和条锈病两种病害。由于 GP143 的亲本中间偃
麦草对以上两种病害免疫, 而亲本烟农 15 则表现感染, 因此 GP143 对白粉病和条锈病抗性
是来自中间偃麦草。
表 1　　GP143 抗白粉病和抗条锈病鉴定结果
Table 1　　The iden tif ication result on GP143 resisting powdery m ildew and str ipe rust
材料
M aterial
白粉病 Pow dery m ildew
苗期反应型
Reaction
type in
seedling stage
苗期感病率 (% )
Infection
percen tage in
seedling stage
成株期反应型
Reaction
type in
adult stage
成株期感病率 (% )
Infection
percen tage in
adult stage
条锈病
反应型
Reaction
type of
stripe rust
条锈病
感病率 (% )
Infection
percen tage of
stripe rust
中间偃麦草
E lg trig ia in term ed ium
0 0 0 0 0 0
烟农 15
Yannong 15
3 93. 4 7 98. 1 4 84. 7
铭贤 169
M ingxian 169
4 100 9 100
辉县红
H uix ianhong
4 100 8 100 5 100
GP143 1 21. 2 3 26. 3 1 17. 8
2. 2　细胞学鉴定
细胞学鉴定结果表明, 中间偃麦草和烟农 15 根尖细胞染色体数均为 2n= 42, 烟农 15 花
粉母细胞减数第一分裂中期 (PM C M I)染色体构型为 2n= 21Ê , 而中间偃麦草 PM C M I染色
体构型则较为复杂, 既有多价体, 也有单价体出现。GP143 是从烟农 15 与中间偃麦草杂种后
代中选育出的高代稳定种质系, 细胞学分析证明, 该种质系根尖细胞染色体数目为 42 条 (图
1) , PM C M I染色体构型较稳定, 一般为 21 个二价体 (图 2)。但在 GP143 与烟农 15 等材料
的杂种 F 1 花粉母细胞内, 常可观察到四价体 (图 3) , 这表明 GP143 有可能是一个易位系。
图 1　　GP143 根尖细胞
染色体 2n= 42
F ig. 1　　Ch romo som es of
GP143 in roo t t ip
cell, 2n= 42
图 2　　GP143 PM C M I染色体
构型, 2n= 21Ê
F ig. 2　　Ch romo som e configura2
t ion of GP143 in PM C
M I, 2n= 21Ê 图 3　GP143 与烟农 15 杂种 F1PM CM I染色体构型, 2n= 19Ê + 1ÌF ig. 3　　Ch romo som e configurationof hybrid F1 betw een GP143 andYannong 15 in PM C M I
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2. 3　RA PD 鉴定
以中间偃麦草、烟农 15 和 GP143 为材料, 选用Operon 公司生产的 E 组和 F 组的 40 个
引物进行扩增反应, 扩增产物在 1. 4% 琼脂糖凝胶中均能分出较为清晰的带, 不同引物扩增
的带从 1～ 6 条不等。在 40 个引物中有 4 个引物扩增出特异带型, 经过多次重复这些带型能
够稳定出现, 可将它们区分为两种类型。第一种类型: GP143 与中间偃麦草的带型一致, 烟
农 15 亲本缺少个别带。例如, O PE202 (GGT GCGGGAA )引物在 GP143 和中间偃麦草中扩增
出两条相同的带, 而在烟农 15 中仅扩增出一条带, 在 1. 3 kb 处三个材料有一条共同的带,
但在 0. 8kb 处烟农 15 则缺乏此带 (图 4) , 说明此带是中间偃麦草特异序列的扩增产物。
O PF207 (CCGA TA TCCC) 引物在 GP143 和中间偃麦草中扩增出 4 条相同的带, 但在烟农 15
中仅扩增出 2 条带, 在 1. 0 kb 和 0. 6 kb 处 3 个材料扩增有 2 条相同的带, 而在 1. 6 kb 和 1.
2 kb 处烟农 15 则缺乏这 2 条带 (图 5) , 说明该两条带是中间偃麦草特异序列的扩增产物。第
二种类型: GP143 与中间偃麦的带型一致, 但缺少烟农 15 亲本中的带。例如, O PE214
(T GCGGCT GA G)引物在 GP143 和中间偃麦草中扩增出 2 条相同的带, 但在烟农 15 中扩增
出 3 条带, 在 1. 0 kb 和 0. 6 kb 处 3 个材料均有 2 条相同的带, 而在 0. 5 kb 处烟农 15 则增加
一条带 (图 6)。引物O PF210 (GGAA GCT T GG) 在 GP143 和中间偃麦草中扩增出一条相同的
带, 而在烟农 15 中扩增出 2 条带, 在 0. 6 kb 处 3 个材料均有一条相同的带, 但烟农 15 在 0.
5 kb 处增加一条带 (图 7)。
图 4　　引物O PE202 的扩增结果
1. 烟农 15; 2. GP143; 3. 中间偃麦草
M. 分子量标准 (ΚDNA öH indË + E coR É )
F ig. 4　　RA PD using p rim er O PE202
1. Yannong 15; 2. GP143; 3. E. in term ed ium ; M.
M o lecu lar w eigh t m arker (ΚDNA öH indË + E coR É ) 图 5　　引物O PE207 的扩增结果1. 烟农 15; 2. GP143; 3. 中间偃麦草F ig. 5　　RA PD using p rim er O PF2071. Yannong 15; 2. GP143;3. E. in term ed ium　
以上结果表明, 在 GP143 中含有中间偃麦草的DNA 序列, 结合细胞学鉴定结果可以初
步确定 GP143 是一个烟农 15 与中间偃麦草染色体的易位系。
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图 6　　引物O PE214 的扩增结果
1. 烟农 15; 2. GP143; 3. 中间偃麦草
M. 分子量标准 (ΚDNA öH indË + E coR É )
F ig. 6　　RA PD using p rim er O PE214
1. Yannong15; 2. GP143; 3. E. in term ed ium ;
M. M o lecu lar w ergh t m arker (ΚDNA öH indË + E coR É ) 图 7　　引物O PE210 的扩增结果1. 烟农 15; 2. GP143; 3. 中间偃麦草F ig. 7　　RA PD using p rim er O PE2101. Yannong15; 2. GP143;3. E. in term ed ium
3　讨论
小偃麦种质系 GP143 是从中间偃麦草与烟农 15 杂种后代中选育的一个综合性状较好、
高抗条锈和白粉病的优良种质材料。抗病性鉴定结果证明, 中间偃麦草对条锈和白粉病免
疫, 烟农 15 对条锈和白粉病均表现感染, 而 GP143 对以上两种病害则表现高抗, 这表明其
抗性可能来自中间偃麦草。通过细胞学和 RA PD 鉴定, 可以初步确定 GP143 是一个烟农 15
与中间偃麦草染色体的易位系。
参　考　文　献
1　W illiam s J G K, A R Kubelik, J. L. Kenneth, et al. N ucleic A cid e R es. , 1990, 18: 6531～ 6535
2　刘树兵, 贾继增, 王洪刚等. 作物学报, 1998, 24 (6) : 687～ 690
3　徐琼芳, 马有志, 辛志勇等. 遗传学报, 1999, 26 (1) : 49～ 53
4　王洪刚, 张建民, 刘树兵. 西北植物学报, 2000, 20 (1) : 64～ 67
5　L ili Q i, M ingshu Cao, Peidu Chen, et al. Genom e, 1996, 39: 191～ 197
6　鲍晓明, 黄百渠, 李松涛等. 遗传学报, 1993, 20 (1) : 81～ 87
7　Sharp P J , S Chao, S D esai, et al. T heor A pp l Genet, 1989, 78: 342～ 348
8　D evo s K M , T M illan, M D Gale, et al. T heor A pp l Genet, 1993, 85: 784～ 792
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