全 文 ：第28卷 第3期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 3
2002 年5月　 374～ 378页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 374～ 378　M ay, 2002
外源钾通道基因在水稻中的表达及其钾吸收特征研究Ξ
施卫明1　王校常1　严蔚东1　汤　利1　安志装1　何锶洁2　田文忠2　曹志洪1
(1中国科学院南京土壤研究所 江苏南京 210008; 2 中国科学院遗传研究所 北京100101)
摘　要　通过基因枪导入法, 将外源钾通道基因导入水稻中花8号、中花9号、中花13以及8706中表达, 获得了转基因
植株。经 PCR 和 Southern 检测, 共获得42个表达了钾通道基因的转基因株系。通过二代的筛选并获得了部分株系的纯
合系。转基因植株对钾的吸收累积试验表明, 与对照相比, 供试转基因株系的吸钾速率和对钾的累积能力都有明显提
高。研究表明钾离子通道在植物体内的表达也能改良植物的钾素营养性状。同时也表明植物营养遗传工程与植物的抗
病、抗虫基因工程具有同样的可行性。
关键词　钾通道基因; 水稻; 基因枪导入法; 钾吸收
中图分类号: S188, Q 945. 12　　　文献标识码: A
Over-expressing of Pota ssium Channel Genes in R ice Plan ts and Its Effect on K
Uptake and Accumula tion
SH I W ei2M ing1 　WAN G X iao2Chang1 　YAN W ei2Dong1 　TAN G L i1 　AN Zh i2Zhuang1 　H E Si2J ie2 　
T IAN W en2Zhong2　CAO Zh i2Hong1　
(1 Institu te of S oil S cience, Chinese A cad em y of S ciences, N anj ing 210008, China; 2 Institu te of Genetics, Chinese A cad em y of S ciences, B eij ing
100101, China)
Abstract　Po tassium channel genes(A K T 1 or KA T 1) w ere in troduced in to the rice (Zhonghua 8, Zhonghua
9, Zhonghua 13 and 8706) by bio listic gun. To tal 42 transgen ic p lan ts been obtained based on the results of
PCR and Southern analysis. Som e pure transgen ic lines w ere also go tten. T he experim en ts of hydropon ic
culture illustrated that the transgen ic p lan ts have h igher capacity of po tassium up take and accum ulation. T hese
results show ed that over2exp ressing of K+ channel genes in p lan ts could imp rove K nutrition characteristic of
crop s.
Key words　Po tassium channel gene; R ice; B io listic gun; K up take
　　我国大部分耕地土壤供钾不足, 其中严重缺钾
土壤 (速效钾< 50 m gökg)约2000万公顷, 占耕地面
积的20% 以上[ 1 ] , 且主要分布在南方地区, 而这些
地区是我国的水稻主要产区。水稻是我国主要的粮
食作物, 占我国粮食总产量的50% 左右[ 2 ] , 而钾则
是水稻重要的丰产和品质因子, 缺钾不仅会影响正
常细胞的渗透压平衡引起器官机能的破坏, 影响植
物的正常生长。同时, 我国钾矿资源十分匮乏, 钾
肥年生产量仅为20万吨左右, 95% 以上的钾肥供应
依赖进口[ 1 ]。随着我国土壤缺钾面积和钾肥需求的
不断扩大, 供需矛盾日益尖锐。如何改良作物的营
养性状提高其对养分的利用效率已成为当前我国农
业生产急需解决的重要问题之一。
过去几十年, 通过农化措施已经使钾肥的利用
率有了很大的提高[ 1 ]。然而受自然规律及植物本身
等的限制, 近年来在这方面的研究进展缓慢。因
此, 筛选高效利用钾的作物品种或利用现有的钾吸
收转运基因改良作物品种, 从而提高作物本身的钾
吸收利用能力成了研究的热点[ 3～ 5 ]。
1992年, A nderson 和 Sen tenac 分别从拟南芥Ξ 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39770437; 39700083) ; 国家重点基础研究规划项目 (G1999011808) ; 中科院重点项目 (KZ9522
S12221) ; 江苏省自然科学基金 (BK99196)和中科院土壤圈物质循环开放实验室资助。
作者简介: 施卫明 (19632 ) , 男, 浙江定海人, 研究员, 博士, 博士生导师, 从事植物根际营养及植物营养遗传研究。
Received on (收稿日期) : 2001206218, A ccep ted on (接受日期) : 2001211209

植株中克隆出了植物钾通道基因A K T 1和 KA T 1,
随后通过DNA 杂交、EST 技术和酵母突变体功能
互补、PCR 及基因库标签法等方法又分别从拟南
芥、小麦等作物中分离克隆出一些与钾吸收转运有
关的基因[ 6～ 9 ]。过去的研究主要集中在其结构、表
达方式和功能方面, 对其在植物营养中的作用研究
则相对较少[ 10 ]。自1983年首次获得转基因烟草、马
铃薯以来, 目前已经获得了一系列具有抗除草剂、
抗病毒、抗细菌、抗昆虫以及抗衰老、延迟果实成
熟等的转基因株系[ 11 ]。但到目前为止用于改良植物
营养性状的研究还鲜有报道[ 4 ]。
本项研究运用分子育种技术, 通过外源钾通道
基因在水稻中的导入和高效表达, 旨在探索提高钾
肥利用率并改良水稻钾素营养品质的新途径。
1　材料和方法
1. 1　材料
1. 1. 1　外源基因　　是从拟南芥 (A rabid op sis
thaliana) 中克隆出来的钾离子通道基因 (A K T 1和
KA T 1) , 其DNA 序列参见施卫明等 (1998) 文[ 12 ]。
所用菌株D H 5Α等由本实验室保存。
1. 1. 2　试剂　　实验所用化学试剂和生化试剂购
自 Sangon 公司, 纯度全部为 H igh pure 和B io tech
级。实验所需纯水都由实验室自己用蒸馏水重蒸所
得。钾通道基因的特异性 PCR 检测引物也由
Sangon 公司代为合成, 其序列为:
　A KT 1: 5′2TCT T GA T GCA GGA CGGTA GT23′
5′2CGGA CAA GTCCAA GA T GA GA 23′
　KA T 1: 5′2T GTCGA TCTCT T GGA CTCGA 23′
5′2CAA TCTCA GCGT T GTCCGCA 23′
1. 1. 3　受体材料　　供试水稻为粳稻 (O ry za
sativa. L. subsp jap onica) 品种: 中花8、中花9、中
花13和8706。
1. 2　方法
1. 2. 1　质粒DNA 的大量制备　　对含有目的基
因的质粒通过大肠杆菌 (DH 5Α) 感受态细胞的转化,
获得大肠杆菌菌株, 再通过含有抗生素 (50 m göL
Kanam ycin ) 的液体培养基振荡培养, 得到大量菌
体, 经过裂解、抽提、纯化等步骤得到较纯的质粒
DNA。
1. 2. 2　基因转导　　采用基因枪导入法。选用水
稻成熟胚经过改良NB 培养基诱导脱分化至愈伤组
织 (培养基成分见郑宏红等1996) [ 13 ] , 用5 ΛL 较纯
的 DNA (100 ngöΛL ) 和50 ΛL CaC l2 (2. 5 molöL )、
60 m g 金粉及20 ΛL 亚精胺 (0. 1 molöL )等混匀加到
轰击膜上 (10 ΛL ö膜) 阴干后用基因枪轰击愈伤组
织, 经过两天的暗培养恢复后进行光照预培养。
1. 2. 3　转基因株系的获得及分子鉴定　　将经过
预培养的愈伤组织在含有潮霉素 (H ygrom ycin, 40
m göL ) 的筛选培养基筛选两周后进行分化培养, 等
幼芽长成后单株切开转入生根培养基。幼苗长成后
再经过含有潮霉素 (40 m göL ) 的培养基筛选然后单
株培养再进行 PCR 检测和 Southern 杂交鉴定, 具
体方法参见分子克隆实验手册[ 14 ]。
1. 2. 4　纯合系的建立　　对经过分子鉴定后的阳
性株系单株收获种子。用含潮霉素 (40 m göL ) 的
NB 培养基多代筛选建立纯合系。以上各培养基成
分参见郑宏红等 (1996)文[ 13 ]。
1. 2. 5　水培生长试验　　试验选用2个野生型品种
中花8 (Z28)和中花13 (Z213) 及其表达钾离子通道基
因A K T 1的4个 T 2代转基因株系T 222, T 230 (中花8
品系)和 T 221, T 223 (中花13品系)。种子经1. 1% 的
次氯酸钠消毒后, 用饱和CaSO 4溶液浸泡2小时, 均
匀播于湿润的石英砂中, 25℃黑暗培养至发芽。然
后光照生长一星期。选取生长一致的水稻苗移栽至
溶液培养10天。试验前, 各株系先在缺钾营养液中
培养12 h, 冲洗干净并在蒸馏水中光照培养2 h。培
养期间每3天更换营养液一次, 每天早晚各搅动营
养液一次以充氧。
水培试验采用木村B (大量元素) 与A rnon (微
量元素) 的改良营养配方, 其水培液的营养成分为:
(N H 4) 2SO 40. 365 mmolöL , Ca (NO 3) 2 0. 456 mmolö
L , N aH 2PO 4 0. 25 mmolöL , M gSO 4 0. 547 mmolöL ,
H 3BO 323. 3 ΛmolöL , M nC l24. 5 ΛmolöL , ZnSO 40. 9ΛmolöL , H 2M oO 4 0. 1 ΛmolöL , CuSO 4 0. 2 ΛmolöL ,
ED TA 2Fe 0. 1 mmolöL , K2SO 41. 0 mmolöL。
吸收试验采用离子耗竭法, 吸收液由0. 2mmolö
L CaSO 4溶液和0. 2mmolöL KC l 溶液组成。吸收液
体积为500mL。在不同时间取样分析吸收液中的 K+
浓度, 从而推算水稻植株对 K+ 的吸收速率, 试验共
进行12h, 每株系3次重复, 每重复4株。
1. 2. 6　转基因水稻对钾的吸收　　供试土壤为潜
育型水稻土, 采自中国科学院常熟生态试验站 (土
壤钾本底值: 速效钾138. 5 m gökg, 全钾1. 901% )。
试验设2个钾水平, 不施钾 (L K)与施钾0. 15 g K2O ö
kg 土 (H K)。氮与磷分别按0. 15 g N ökg 土和0. 10 g
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P2O 5ökg 土施入。所用肥料为硫酸钾、尿素和磷酸
二铵。供试土壤过1 mm 筛, 每盆装土1 kg。3次重
复, 随机排列, 常规管理, 分蘖期收获分析。
2　结果
2. 1　转基因株系的获得和分子鉴定
2. 1. 1　质粒构建　　包含目的基因的质粒构建工
作在日本东京大学植物营养室完成。用限制性内切
酶 X ba É 和 X ho É 从质粒 pKA T 1 中切割得到
KA T 1基因的 cDNA 片段, 用末端连接法整合到已
切除 GUS 基因的质粒 pB I1012Hm 中。质粒中包含
有潮湿霉素和卡那霉素抗性基因。A K T 1基因结构
见图1。KA T 1基因的质粒结构与A K T 1相似, 质粒
大小为14. 9 kb。
2. 1. 2　转基因植株的获得　　通过基因枪转化技
术, 共获得四个品种 (中花8号、中花9号、中花13号
和8706)、两种基因 (A K T 1和 KA T 1) 并经过 PCR
和 Southern 杂交鉴定的并具有潮霉素抗性的转基
因水稻植株42个株系 (表1)。
图1　表达型质粒 pA KT1结构示意图
F ig. 1　M ap of A K T 1 gene p lasm id
(质粒 pKA T1则是将 pA KT 1中的A K T 1基因片段换成 KA T 1片段)
表1　已获得的鉴定后转基因水稻株系
Table 1　Transgen ic r ice plants
基因
Gene
水稻品种
R ice variety
转化植株数
N um ber of transgenic p lant
A K T 1
中花9号
中花8号
中花13号
8706
24
5
5ö
KA T 1
中花9号
中花8号
中花13号
8706
4
1
1
2
图2　部分转基因水稻 PCR 结果
F ig. 2　PCR results of transgenic p lants
1、5: CK, 2、4: 阳性对照, 3: ΚöH indË DNA , 其余为各株系
No. 1、5: negative CK, No. 2、4: positive CK, No. 3:ΚöH indË DNA , O ther: every strains
2. 1. 3　转基因植株的鉴定　　在转基因水稻苗期
取其叶片并提取基因组DNA , 进行 PCR 扩增 (图
2)。电泳结果显示各转基因株系在2. 6 kb 处有明显
的带出现 (所用外源基因A K T 1和 KA T 1的大小分
别为2. 6 kb 和2. 0 kb) , 证明外源基因已经整合到
转基因植株的基因组中。
2. 2　转基因水稻的吸钾特性
2. 2. 1　转基因水稻的吸钾速率与吸钾量　　利用
离子耗竭试验进行的水稻吸钾速率研究结果表明
(表2) , 表达A KT 1转基因水稻幼苗具较强的吸钾
能力。12个小时内, 转基因水稻幼苗的平均吸钾速
率均显著高于对照, T 222和 T 230的吸钾量比 Z28分
别提高52. 4% 和25. 4% ; T 221和 T 223分别比 Z213
高48. 9% 和79. 1%。
2. 2. 2　转基因水稻的吸钾动力学　　从吸收溶液
表2　水稻幼苗的吸钾速率与吸钾动力学参数
Table 2　The average absorbing rate of potassium in seedl ing
株系
L ine
平均吸钾速率Λmolöp lant. h KmΛmolöL
Z28 3. 338±0. 073 502. 5
T222 5. 085±0. 043 2
T230 4. 183±0. 088 92. 6
Z213 2. 653±0. 350 217. 8
T221 3. 950±0. 305 34. 9
T223 4. 750±0. 263 149. 9
673　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　28卷

中的钾浓度随时间的变化曲线 (图3) 可以看出转基
因水稻株系的吸收速率明显大于对照。从钾吸收的
最低浓度来看, 中花8大约在65 ΛmolöL , 而 T 230在
溶液浓度约30 ΛmolöL 时仍有吸收; 中花13大约在 57 ΛmolöL , 而 T 223则在24 ΛmolöL 以下, T 221甚至可以吸收10 ΛmolöL 以下的钾。转基因水稻株系的 Km 值远小于非转基因对照 (表2) , 表明表达A K T 的转基因水稻对钾有较强的亲和力。
(ΛmolöL )　 (ΛmolöL )　 (ΛmolöL )　 (ΛmolöL )　 (Λmo löL )　 (Λmo löL )　 (Λmo löL )　 (Λmo löL )　
图3　转基因株系对钾的吸收动力学曲线
F ig. 3　K up take kinetics curve of transgenic p lants
2. 2. 3　转基因水稻植株对钾的累积量　　由图4和
图5可以看出与野生型对照相比, 转基因株系在两
级钾水平下对钾的累积量都有不同程度的提高。在
未施钾条件下 (L K) , T 222和 T 230植株吸钾量分别 比对照 Z28高22. 3% 和24. 3% , T 221和 T 223比 Z213高16. 4% 和11. 5%。而在施用钾肥条件下 (H K) ,T 222和 T 230则分别比对照 Z28高4% 和18% , T 221和 T 223也比 Z213高7% 和6. 5%。
图4　低钾条件下植株钾的累积量
F ig. 4　K content in p lants in low K condition
图5　高钾条件下植株钾的累积量 (分蘖期)
F ig. 5　K content in p lants in h igh K condition
3　讨论
表达钾离子通道基因的各转基因水稻株系其吸
钾速率和对钾的累积能力都有不同程度的提高, 证
明外源钾通道基因的导入可以提高水稻的吸钾能
力, 从而提高钾肥利用率并改良水稻钾素营养品
质。与我们在野生型烟草上的研究结果相一致[ 15 ]。
植物对介质中 K+ 的主动吸收, 存在着高亲和与低
亲和两个体系, 长期以来, 一直认为高亲和性钾吸
收系统在介质 K+ 为微摩尔级浓度时被激活, 一般
为 K+ 2H + 或 K+ 2N a+ 载体协同转运; 低亲和的 K+
吸收主要通过 K+ 通道来完成, 其作用的浓度为
mmolöL 级[ 16 ]。现有研究结果表明, 由A K T 1基因
所编码的通道为低亲和内流型钾离子通道, 既参与
低亲和钾的吸收, 也是钾离子高亲和吸收的主要途
径之一。其参与作用的 K+ 浓度范围甚至可以低于
10 ΛmolöL [ 17 ]。Spalding 等 (1999) 利用缺乏A K T 1
通道活性的拟南芥突变体 ak t1通过反义遗传手段,
将根细胞的 K+ 吸收器官分成A K T 1和非A K T 1两
部分, 结果显示当外源 K+ 在10～ 1000 ΛmolöL 范
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围, A K T 1组分占野生型拟南芥 K+ 通透性的55%
～ 63% [ 18 ]。另外, 缺乏A K T 1通道活性的拟南芥突
变体 ak t1, 其 K+ 通透性、86R b+ 向根的流量、种子
萌发、植株生长速率均受N H +4 的抑制, 而对照对
N H +4 则有较强的抗性。因此, 特别是在有N H +4 存
在时, A K T 1介导为植株吸收 K+ 所必需。这些结果
表明在高亲和范围内, A K T 1通道也是植物钾吸收
的重要途径[ 7, 15 ]。因此, 虽然大多数土壤溶液中有
效态钾的浓度低于1 mmolöL , 但 K+ 通道在作物钾
素营养方面的贡献也是不可忽略的[ 12 ]。这也是表达
钾离子通道基因植物能增强植物对钾的吸收累积能
力的依据之一。
与施肥处理相比, 在未施钾肥条件下转基因水
稻的植株对钾的累积量提高幅度更大 (与对照相
比) , 这是由于表达了钾通道基因的植株在低钾胁
迫下提高了其对钾的吸收和转运能力以及一部分土
壤缓效钾的利用率提高[ 15 ] , 而在施用钾肥的条件
下, 介质钾浓度较高, 即使是野生型对照在这样的
环境下所吸收的钾也基本可以满足水稻生长的需
求, 由于根系对养分的吸收受植物对养分需求量的
主动控制[ 3 ] , 因此在高钾水平下, 外源钾通道基因
对水稻钾素累积的贡献有所下降。
由于外源基因插入的位点不一导致了不同转基
因株系间的效果有明显差异, 本次研究发现转基因
株系 T 223在苗期有较高的吸收速率, 而 T 230株系
于分蘖期在低钾和高钾两种条件对钾的累积量都有
较大幅度的提高, 因此其具体的表达和作用机理尚
需进一步研究。
总之, 本研究初步证明通过外源钾通道基因的
导入来改良水稻钾素营养是可行的, 但在田间试验
条件下以及不同土壤类型、不同生态环境下是否能
取得较好的结果, 转基因水稻在提高养分资源利用
率上的贡献率和作用方式等尚需进一步的研究。
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