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第 29 卷 第 1 期 作 物 学 报 V o l. 29, N o. 1
2003 年 1 月 159～ 160 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 159～ 160 Jan. , 2003
研究
简报 整体植株转化法在荞麦上的应用
Ξ
陆小平1 小岛峰雄2
(1 苏州大学生命科学学院, 江苏苏州 215006; 2 日本信州大学纤维学部, 日本)
Plan t Tran sforma tion System for F agopyrum escu len tum M oench
LU X iao2P ing1 M ineo KOJ IM A 2
(1 Colleg e of L if e S cience, S uz hou U niversity , S uz hou 215006, Ch ina; 2 F acu lty of T ex tile S cience, S h inshu U niversity , J ap an)
1985 年, Ho rsh 等利用植物细胞的全能性, 借助组织
培养技术, 创建了农杆菌介导的植物基因转化系统2叶盘
法。此后, 植物遗传转化的研究得到迅速发展, 目前, 在大
量转基因植株中, 80% 是由农杆菌介导获得的[1 ]。笔者在植
物遗传转化的研究中, 以荞麦幼苗的茎尖分生组织为受体
材料, 利用转座子 T n5 将野生型农杆菌 T 2DNA 中致瘤基
因 tm s1 敲除, 在其毒性盒V ir 的辅助下, 将 Β2葡萄糖苷酸
酶 (GU S ) 基因导入荞麦幼苗中, 试图探究、建立操作简单、
适用性广的植物基因转化系统。
1 材料与方法
1. 1 菌株
所用菌株B2256 是在野生型农杆菌 (A 208) 的亚株 (B 2
244) 中导入质粒 p IG1212Hm , 农杆菌的染色体背景与亲本
A 208 相同, 而辅助质粒的癌基因 tm s1 中插有一个转座子
T n5。其载体质粒中的 GU S 内插有一个内含子。该菌株由
日本信州大学纤维学部小岛研究室构建并保存。
1. 2 受体材料
将信农 1 号荞麦种子播于装有蛭石的钵内, 每钵播 10
粒, 发芽后进行接种试验。
1. 3 接种方法
待荞麦幼苗子叶开放时, 选择生长健壮、发育整齐的幼
苗, 在子叶的腋间下方用灭菌细针刺伤后, 用棉棒醮取现配
菌液涂于伤口。并置 22℃、弱光线的室内培养 2 天后再移
入温室中任其生长。
1. 4 基因组D NA 提取
接种后 70 天左右, 分别取荞麦瘤组织和畸形幼苗
0. 5g, 用N ucleon 试剂盒按使用说明提取基因组DNA。
1. 5 印膜
取经纯化的DNA 10 Λg, 用B am H É 在 30℃中酶解 2
小时, 酶解产物经精制后全部装样于 1% 琼脂糖凝胶板中,
电泳后将其中的DNA 转移至尼龙膜 (H ybo rdN + m em bane)
上。
1. 6 D ig -GUS 探针合成及精制
模板 p IG121DNA ;
引物 1 5′2GGA A GT GA T GGA GCA TCA GG23′;
引物 2 5′2CA C A CT GA T A CT CT T CA C TC23′。
经 PCR 反应, 合成跨度为 1236 bp DNA 片段作为
GU S 基因的探针, 并用 GFXTM PCR and Gej Band PU 2
R IF ICA T 2
ION 试剂盒纯化后, 置 - 20℃中保存备用。探针标记用
D IG L abeling m ix 法[2 ]。
1. 7 Southern hybr id iza to in 检测
将印有DNA 的尼龙膜经紫外仪 [ FUNA 2UV L IKER
(FS21500) ]固定 30 秒后, 加 10 mL 预交液置 65℃孵育箱
(EYELA H YBR ID ZA T ION OV EN M H S2301) 中预交 1 小
时, 再向预交液中加入 10 ΛL 变性D ig 2GU S 探针, 继续置
孵育箱中杂交 10～ 12 小时, 最后置Co lo r2Substrate 显色液
中显色 3～ 5 小时[2 ]。
1. 8 GUS 基因表达检测
按 Jefferson 等[3 ]的组织化学染色法检测 GU S 基因的
表达。取畸形幼苗置称量瓶中, 加入刚配制的 X2Gluc 溶液
(以浸没为度) , 用真空泵抽出组织中的气泡 (3 次下沉) , 加
盖后置 37℃恒温箱中保育过夜, 翌日取出经 70% 酒精褪色
后观察蓝色沉淀。
2 结果与分析
2. 1 荞麦瘤组织及其分化
荞麦幼苗接种后, 生长速度明显减慢, 3～ 4 周后在感
染处开始出现突起, 随荞麦植株生长突起逐渐增大, 形成荞Ξ 基金项目: 国家教育委员会国家留学基金资助项目 (99832077)
作者简介: 陆小平 (1958～ ) , 江苏苏州人, 副教授, 主要从事植物遗传育种的研究。
Received on (收稿日期) : 2002202227, A ccep ted on (接受日期) : 2002207206
麦瘤组织。瘤组织色泽, 有坚硬的淡红色、松软的嫩绿色和
玉色三种。从嫩绿色和玉色瘤组织中长出胚状体、畸形幼苗
或花穗, 而淡红色瘤组织没有这种现象。由瘤组织中长出的
幼苗植株矮小, 叶畸形, 开花期的株高不足 15 cm。花穗能
正常开花, 但不能结实 (图 8)。这种瘤组织的形成可能是由
于农杆菌中的 T 2DNA 插入所致, 而花穗和畸形植株可能来
自于瘤组织的胚状体或母株的腋芽原基。
2. 2 转化体的分子学鉴定
外源基因是否整合到宿主细胞, 可通过 Sou thern 杂交
进行确认。由嫩绿色瘤组织分化出来的胚状体经精心护理
后, 发育成畸形植株, 用D ig 2GU S 片段作探针, 对瘤组织
和畸形植株基因组DNA 进行 Sou thern 杂交分析。结果表
明: 瘤组织和畸形植株均出现二条杂交带, 而对照 (水处理
的荞麦叶片)未测到杂交信号 (图 9～ 10)。这一结果可以初
步确认GU S 基因被整合到受体材料的基因组中。
2. 3 转化体GU S 活性的组织化学定位
由于本实验使用的质粒 p IG21212Hm 中带有编码 Β2葡
萄糖苷酸酶 (GU S ) 报告基因, 转化体可通过GU S 基因表达
进行证实。实验中得到的畸形植株, 经活体 GU S 活性定位
检测, 其茎、叶、花均发现有蓝色反应, 且茎组织更为明显
(图 11)。这种蓝色反应进一步证明GU S 基因被导入荞麦且
能在体内进行表达。
3 讨论
本研究用农杆菌介导对荞麦茎尖组织刺伤接种, 由于
植物茎尖是细胞分裂的旺盛部位, 也是农杆菌的敏感部位。
所以, 容易获得转基因植株。我们用该方法研究荞麦时, 转
化效率达 90% [4 ] , 桑树曾达 32%。我们认为: 茎顶组织聚
集有相当数量的不同发育阶段的分裂细胞, 其中必有部分
细胞处于一种最易吸收接受外源DNA 片段的状态, 它们提
供了农杆菌完成贴壁反应的微环境。因此, 用整体植株转化
法进行外源基因转化时, 应选择茎顶组织作为受体细胞。对
转化株基因组DNA 经分子杂交分析, 结果呈阳性反应。说
明对幼体植物直接接种, 也能将外源基因导入受体细胞中。
用X2Gluc 对转化植株进行显色检测, 结果仍为阳性, 这一
结果可完全排除残留农杆菌污染造成的假阳性, 因 p IG1212
Hm 质粒中的GU S 序列内插有一个内含子, 使GU S 基因只
能在真核细胞中表达, 而在农杆菌中不能表达。另外, 本研
究所用的农杆菌是野生型 (A 2208) 的亚株, 属胭脂型质粒,
且在编码控制植物生长素合成的基因位点 ( tm s1) 中插有一
个转座子 (T n5) , 该位点的突变, 引起了另外两个致瘤基因
( tm s2、tm r) 异常表达, 从而导致瘤组织出现大量的畸形
芽[5 ]。若将该技术用于观赏植物的基因转化, 有可能在短期
内获得不同于亲本园艺性状的、更富有观赏价值的转基因
植株。
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