全 文 ：第 27 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 27, N o. 6
2001 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2001
低温胁迫下 IPT 诱导水稻幼苗根中的 RNA 差别显示分析Ξ
丁秀英1　张　军2　崔　霞1　苏宝林1
(1中国农业大学作物学院, 北京 100094; 2中国农业大学生物学院, 北京 100094)
提　要　本研究选用抗性相对较弱的水稻 (O ry z a sa tiva L. ) 品种越富为实验材料, 利用DDR T 2PCR
(D ifferen tia l D isp lay R everse T ranscrip t ion2PCR ) 技术研究了在 4～ 6℃的低温胁迫下 Isop ro th io lane
( IPT )诱导水稻幼苗抗性增强的部分分子机理。结果表明: 在正常生长条件下, IPT 处理对水稻秧苗根
的影响与对照基本相同; 但在低温胁迫下, 两种处理的水稻幼苗根中mRNA 存在明显差异。这些差异
基因有的是在低温胁迫下由 IPT 诱异表达的; 还有一些基因是在低温胁迫下对照中没有而 IPT 处理下
仍然有表达的。经二次扩增及反向N o rthern 确定了 5 个差异表达的基因。
关键词　水稻; IPT; 基因表达; 差异显示
Stud ies on Resistance Gene Express ion by IPT Induc ing under L ow-
tem pera ture Stress in Root of R ice Seedl ing
D IN G X iu Y ing1　ZHAN G Jun2　CU I X ia1　SU Bao2L in1
(1 Colleg e of P lan t, Ch ina A g ricu ltu ra l U niversity , B eij ing 100094; 2 Colleg e of B iolog ica l S ciences, Ch ina A g ricu ltu ra l
U niversity , B eij ing 100094, Ch ina)
Abstract　　A part of the m o lecu lar m echan ism on rice seed ling low 2tem pera tu re st ress (4～
6℃) resistance induced by Isop ro th io lane ( IPT ) w as stud ied in w eak2resistance cu lt ivar Yuefu
by D ifferen t ia l D isp lay PCR (DDR T 2PCR ). T he resu lts ind ica ted there is a grea t d ifference
in cDNA of exp ressed genes betw een the trea ted and con tro lled rice seed ling. N o difference
w as found betw een the trea ted and con tro lled rice a t no rm al condit ion; bu t exp ression
difference of genes w as found under low 2tem pera tu re st ress in the tw o differen t t rea tm en ts.
It is suggested tha t the specia l d ifferen t ia l fragm en ts are rela ted to IPT induct ion o r low 2
tem pera tu re st ress. F ive bands w ere p roved to be differen t ia l fragm en ts by RNA reverse
no rthern b lo t t ing u sing labeled first st rand cDNA as p robes.
Key words　　R ice; IPT; Exp ression of gene; D ifferen t ia l d isp lay
Isop ro th io lane ( IPT ) 是一类含硫烷基的叉丙烯酸结构化合物, 它能使植物对病菌、害虫
和低温、盐碱等逆境产生非常强的抵抗力和适应力。这种药剂的植物生长调节剂活性的研究Ξ 国家自然科学基金资助项目 (批准号为 39670429)
作者简介: 丁秀英, 女, 中国农业大学作物学院作物栽培学与耕作学在读博士, 主要从事植物抗逆诱导剂的机理研
究; 张军, 男, 中国农业大学生物学院副教授, 博士, 主要从事植物生长调节剂及植物组织培养的研究; 苏宝林,
男, 中国农业大学作物学院作物栽培与耕作学专业教授, 博士生导师, 主要从事水稻高产栽培理论与实践及稻田生
物固氮方面的研究。
致谢 中国农业大学生物学院刘淑兰教授对本论文的成稿提出许多宝贵意见和建议, 深表感谢。
收搞日期: 2000208229, 接受日期: 2001203222
Received on: 2000208229, A ccep ted on: 2001203222

起始于 80 年代中期的日本[ 1, 2 ]。中国农业大学张军博士在此基础上研制出更为高效的、具有
诱导抗性功能的新型农药制剂移栽灵 (主要成分是 IPT ) , 首先用于防治水稻旱育秧立枯病,
效果十分显著, 进而推广应用到蔬菜、水果、棉花、油菜、大豆、甜菜、西瓜和花卉等多种作
物上[ 3 ]。为了迫切了解移栽灵具体的作用机制, 本实验室已经从形态和部分生理指标方面对
移栽灵的主要成分 IPT 的作用机理进行了研究。研究发现: 在正常生长条件下, IPT 的作用
不是十分明显。但在逆境 (4～ 6℃低温或土壤pH 值高达 9. 6)条件下, IPT 处理与对照相比差
异十分明显, IPT 在逆境条件下能显著地促进水稻根系的发育, 抑制地上部的生长, 提高幼
苗根系的氧化还原力和叶片的叶绿素含量, 提高和保持根系及叶片中 SOD 的活性, 降低
M DA 含量, 增强幼苗对逆境的抵抗和适应的能力[ 4, 5 ]。本实验主要是在前期试验的基础上,
想从分子水平研究低温胁迫下 IPT 是否诱导了水稻幼苗根系中基因的表达发生差异, 这些差
异各是什么。
我们利用DDR T 2PCR 技术[ 6～ 9 ] , 以抗性相对较弱的水稻品种越富为材料, 研究了在低温
胁迫下 IPT 处理及对照幼苗根系中m RNA 的差异表达情况, 希望从分子水平为 IPT 的诱抗
机制提供一些证据, 为以后克隆这些抗性基因并将其转入其他作物奠定基础。
1　材料和方法
1. 1　材料
1. 1. 1　植物材料　　供试水稻品种越富原种用 21% 的盐水选种后, 用清水冲洗干净, 25℃
浸泡 3 天后将水倒掉, 用湿纱布覆盖种子, 35℃催芽 1 天, 选择饱满、无破损、出芽一致的种
子播入分别用 40 m göL 10% IPT 处理和对照的培养基 (国际水稻研究所推荐配方)中, 培养盘
表面用薄膜覆盖, 于 25℃生长, 出苗后撤掉薄膜, 每天浇适量的水以防止培养基失水。在幼
苗一叶一心期时用 4～ 6℃的低温处理 3 天, 然后恢复正常生长。分别取常温下和 4～ 6℃低温
3 天的 IPT 处理和对照的水稻幼苗根各 0. 1g, 液氮中冻存备用。
1. 1. 2　m RNA 锚定引物的合成及随机引物　　根据文献[ 9 ]在所有锚定m RNA 群体的 3 种
O ligodT 12 A öGöC 中随机选取O ligodT 12A 作为 cDNA 第一链合成和 PCR 反应的特异引物,
引物由生工公司合成。随机引物是Operon 的十聚体随机引物M 组 20 个。
1. 2　方法
1. 2. 1　总RNA 的提取及RNA 中DNA 的去除　　总RNA 的提取采用一步法 (T rizo l 试剂
为 Sangon 公司产品) , 具体步骤按试剂的说明进行。实验中所用一切器皿都经过 210℃焙烤、
D EPC 水处理等以灭除RN ase。取约 10 ΛL 的总RNA 于 0. 5 mL 的离心管中, 加入 30U 的
RN ase 抑制剂 (鼎国公司)、RQ 1 RN ase2free DN aseÉ (P rom ega 公司) 按 1 U öΛg RNA 的用
量加入 30 ΛL 反应体系中, RQ 1 RN ase2free DN aseÉ 10 倍反应缓冲液 3 ΛL , 最后用D EPC
处理的灭菌水补至总体积为 30 ΛL。37℃温育 30 分钟, 酚ö氯仿抽提后, 乙醇沉淀 总RNA ,
适量D EPC 灭菌水溶解RNA 沉淀, 总RNA 的产量和纯度通过其在 260 nm、280 nm 的紫外
吸收值计算得到。总RNA 样品存于- 20℃备用。
1. 2. 2　cDNA 第一链的合成　　分别以上述 4 种样品的总RNA 为模板反转录合成 cDNA
第一链。反应体系 (20 ΛL )包括: 2 Λg 总RNA , 2. 5 Λm o löL T 12A , 20 Λm o löL dN T P RN asin
30U , 逆转录酶M 2M LV 300 单位 (P rom ega) , 4 ΛL M 2M LV 缓冲液 (5x) , 用D EPC 处理的灭
菌重蒸水补至总体积为 20ΛL , 65℃变性 5 分钟, 37℃反应 1 小时, 95℃ 5 分钟灭活M 2M LV。
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1. 2. 3　cDNA 片段的 PCR 扩增　　PCR 反应体系 (20 ΛL ) 中包括: cDNA 第一链反应产物
2 ΛL , 引物 1: 2. 5 Λm o löL O ligodT 12A , 引物 2: 0. 5 Λm o löL 十聚体随机引物, 2 ΛL 10 倍
PCR 反应缓冲液, 2 Λm o löL dN T P, T aq DNA 聚合酶 1 个单位 (Sangon) , 用灭菌重蒸水补
至总体积 20 ΛL , 反应混合物用 20 ΛL 矿物油覆盖液面后, 在 PCR 仪 (中国科学院遗传学研
究所)上扩增, 扩增条件为: 94℃, 30s, 42℃, 1 m in, 72℃, 30s, 40 个循环反应后, 72℃继续
延伸 5 m in。
1. 2. 4　PCR 产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析　　PCR 扩增产物 3. 5 ΛL , 加上样缓冲液
2 ΛL , 混匀, 95℃变性 5 分钟, 在 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳, 电泳缓冲液为 1×TBE,
35W 恒功率电泳将近 5 小时。电泳结束后对凝胶进行银染。
按照N lum 等[ 10 ]的方法进行银染。略作修改后的银染步骤如下:
(1) 10% 冰乙酸固定 30 m in 以上, 充分振荡至染料完全褪色 (也可以过夜) , 用去离子水
洗 3 次 (2 m inö次)。
(2) 染色 30 m in (染色液: 2g A gNO 3, 3 mL 37% 甲醛, 2L ddH 2O )。为了染色均匀, 将胶
板放入染色液之初要剧烈晃动胶板 3～ 5 分钟, 然后每隔 5～ 8 分钟晃动胶板一次。30 分钟后
将胶板转移到去离子水中, 去离子水洗 2～ 3 秒立即取出。
(3) 显色 (显色液: 161. 752g N a2CO 3. 10H 2O + 2L 水, 4℃保存, 临用前加入 10 m gömL
N a2S2O 3. 5H 2O 400 ΛL , 3 m l 37% 甲醛) : 先用 2L 显色液显色, 待第一批条带出现, 换至另
2L 显色液中, 至理想效果。显色溶液在 10℃左右效果最好。
( 4) 在固定液中终止显色 2～ 5 分钟, 再用去离子水洗 2 次 (2 m inö次)。室温下自然晾
干。观察 PCR 产物的差异情况。
1. 2. 5　差异片段的回收及再扩增　　观察带型分布, 照相后, 用干净的手术刀片从凝胶上切
下差异带, 放入干净的管中, 用枪头捣碎胶, 加无菌双蒸水 40 ΛL , 100℃煮沸 5 分钟, 离心,
取上清液 4 ΛL 进行二次 PCR 扩增, 扩增条件不变, 0. 8% 琼脂糖电泳检测。用DNA 快速纯
化ö回收试剂盒 (鼎国生物)回收 PCR 产物。
1. 2. 6　差异片断的反向N o rthern 杂交鉴定
1. 2. 6. 1　点膜: 各取 50 ng 回收的 PCR 产物, 100℃变性 10 m in, 冰上冷却, 用点样器将样
品点到四套尼龙膜上, 120℃烤膜 30 分。
1. 2. 6. 2　探针制备、杂交以及免疫检测: 参照 Roche 公司D IG H igh P rim e DNA L abeling
and D etect ion Starter K it I的说明进行。
2　结果与分析
2. 1　水稻品种越富在不同处理下的生长差异
本实验选用的水稻品种越富是一个在北京地区推广、品质特优但抗寒性和抗病性都比较
差的品种, IPT 处理和对照下该品种幼苗的地上部和地下部的生长表现出一定的差异 (图 1) :
用 IPT 处理对幼苗表现为促下控上, 地上部较对照矮一些, 但地下部根系却比较发达, 与对
照相比, IPT 处理后幼苗根粗、壮而且比较白, 这种差异在低温胁迫后表现尤甚。
2. 2　水稻幼苗根中总 RNA 的抽提及其中D NA 的去除
用 1% 甲醛变性凝胶 (加溴化乙锭至终浓度为 0. 5 ΛgöΛL ) 电泳鉴定 RNA 的完整性 (图
2) , 其浓度根据OD 260估算: 平均为 0. 48 ΛgöΛL 左右的RNA ; 其纯度根据OD 260öOD 280估算:
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图 1　　10% IPT 处理和对照水稻幼苗的生长差异
F ig. 1　　Grow th difference of rice seedling
in 10% IPT 2t reated and contro l
A. 未经低温胁迫的处理和对照幼苗;
B. 低温胁迫后 15 天的处理和对照幼苗
A. T reatm ent and contro l w ithout low 2temperature stress;
B. T reatm ent and contro l 15 days after low 2temp2
erature stress
图 2　　一步法提取水稻幼苗根系总RNA
的甲醛琼脂糖凝胶电泳
F ig. 2　　A garo se (1% ) fo rm aldehyde gel of
to tal RNA iso lated from roo t of rice
seedling using one2step m ethod
其OD 260öOD 280均达到 T rizo l 试剂所能达到
的比值, 表明纯度良好。由于在提取的
RNA 中不可避免含有痕量的 DNA 杂质,
它们的存在会严重影响差异显示的效果, 增
加假阳性的比率, 所以在进行差异显示前要
消化 RNA 样品中的DNA 杂质, 我们采用
传统的方法, 对DNA 进行消化后, 用酚:
氯仿: 异戊醇 ( 25∶ 24∶ 1) 抽提, 用 3M
N aA c (pH 5. 2) 与无水乙醇RNA 沉淀 后, 适量D EPC 灭菌水溶解后, 检测RNA 的完整性、
浓度和纯度, 均与消化DNA 前的情况基本类似。
2. 3　不同处理根中基因表达的差异展示
差异显示部分结果如图 3 所示, 可以发现这些差异分为以下几种类型: 1) 在低温胁迫下
仅由 IPT 诱导表达 (图 3a) ; 2) 正常条件下两种处理均有表达, 在低温胁迫下对照无表达, 而
IPT 处理仍然保持其表达 (图 3b) ; 3) 在低温胁迫下, IPT 抑制某些基因表达 (图 3c) ; 4) 在
低温胁迫下 IPT 处理使某些基因表达量强于对照 (图 3d)。
2. 4　反向 Northern 印迹分析
鉴定工作在差异展示研究中非常重要, 通常是将每个差异片段分别标记后进行RNA 印
迹以排除假阳性, 工作量大、难度大、成本高。为了快速鉴定阳性克隆, 我们用地高辛标记好
的 cDNA 作探针对差异片段进行斑点杂交, 颜色反应 16 小时后, 通过比较杂交信号的有无
和强弱, 确定了 5 个差异表达的基因 (图 4)。
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图 3　　不同处理下水稻幼苗根中基因表达的差异展示
F ig. 3　　Exp ressive difference of gene in roo t of rice seedling by differen t tream ent
1. 未经低温胁迫的对照; 2 未经低温胁迫的 IPT 处理; 3. 4～ 6℃低温胁迫的对照; 4. 4～ 6℃低温胁迫的 IPT 处理
O PM 2、O PM 3、O PM 7、O PM 9、O PM 13 分别为十聚体随机引物
1. Contro l w ithout low 2temperature stress; 2. IPT 2t reated w ithout low 2temperature stress;
3. Contro l w ith 4～ 6℃ stress; 4. IPT 2t reated w ith 4～ 6℃ stress
O PM 2、O PM 3、O PM 7、O PM 9、O PM 13 is 10m er random p rim er
箭头所示为差异表达的基因　　　 Index is differen tial gene
a. 在低温胁迫下仅由 IPT 诱导表达; b. 在正常条件下两种处理均表达, 低温后对照无表达, IPT 处理仍保持其
表达; c. 在低温胁迫下, IPT 抑制其表达; d. 低温胁迫下, IPT 处理的表达量强于对照。
a. Special gene induced by IPT under low 2temperature stress; b. Special gene rem ained by IPT under low 2
temperature stress; c. Special gene inh ib ited by IPT under low 2temperature stress;
d. Special gene enhanced by IPT under low 2temperature stress
3　讨论
植物在长期的进化过程中会形成比较完善的自身防御和适应机制, 但是, 在过度的品种
选育和保护栽培的条件下, 这些机制或者丧失、或者钝化、或者休眠, 总之, 植物的抗逆性和
适应性在逐步降低。在生产实践和科学研究中发现, 通过物理的、化学的、生物的逆境因子
可以诱导植物潜在的抗逆性发挥出来[ 5 ]。研究证实 IPT 具有诱导水稻秧苗抗逆性增强的作
用。
　　本实验室在前期的研究中发现[ 6 ]: 在正常生长条件下, 用 IPT 处理水稻幼苗后与对照相
9396 期　　　　　　丁秀英等: 低温胁迫下 IPT 诱导水稻幼苗根中的RNA 差别显示分析　　　　　　　　　

图 4　　反向N o rthern 印迹鉴定差异表达的基因
F ig. 4　　Reverse N o rthern B lo tt ing
of differen tial disp lay gene
A. 以未低温 3 天的对照 cDNA 为探针; B. 以未低温
3 天的处理 cDNA 为探针; C. 以低温 3 天的对照
cDNA 为探针; D. 以低温 3 天的处理 cDNA 为探针
1～ 5: 50 ng 二次扩增 cDNA 片段
A. H ybridized w ith cDNA p robe p repared from
contro l w ithout low 2temperature sttress;
B. H ybridized w ith cDNA p robe p repared from
treatm ent w ithout low 2temperature stress;
C. H ybridized w ith cDNA p robe p repared from
contro l w ith low 2temperature stress;
D. H ybridized w ith cDNA p robe p repared from
treatm ent w ith low 2temperature stress
1～ 5: 50 ng of PCR p roducts
比虽然也有一定的差异, 然而这种差别不是
很明显, IPT 只是在一定程度上使植株的素
质更好, 但它的作用只处于辅助位置; 在逆
境条件下 (如低温、盐碱等) , 用 IPT 处理水
稻幼苗后与对照相比, 二者的区别就十分的
突出, 而且逆境强度越大, IPT 的作用发挥
得越好 (见图 1)。张红心等[ 11 ]的研究表明,
IPT 对稻苗根系的生长有显著的促进作用,
同时也影响根中部分内源激素的含量和某些
酶的活性。
　　从遗传学的角度来讲, 任何形态和生理
上的变化都是由基因的表达与否来决定的。
本试验得到的结果与前期生理试验的结果基
本吻合。由图 3 可以说明以下两点: 第一, 在
正常生长条件下 IPT 的作用不是很显著 (见
图中泳道 1 和 2) ; 第二, IPT 对水稻幼苗的
作用在低温胁迫下比较明显, 而且是多方面
的: 尤其是在低温胁迫下, 它可以特异地诱
导某些基因的表达, 可以使某些基因在逆境
胁迫下表达增强, 我们推测这些基因可能与
抗性有关, 另外, 它也可以抑制另一些基因
的表达。
杂交试验结果进一步证明, 在常温下
IPT 就能诱导某些基因的表达; 在低温胁迫
后, IPT 处理不仅诱导基因的表达而且使基
因的表达量有很大的增强 (见图 4)。对这些有意义的片段进行克隆、测序, 进而确定它们可
能的功能, 有利于进一步从理论上阐明 IPT 诱导水稻秧苗抗逆性增强的作用机理, 这些工作
正在进行中。
参　考　文　献
1　O h tsuka T , H Saka. J ap anese J ou rna l of C rop S cience, 1989, 58: 311～ 315
2　O h tsuka T , H Saka. Chem ica l R eg u la tion of P lan ts, 1991, 26: 25～ 35
3　刘志伟. 植物抗逆诱导研究获重大突破. 科技日报, 200021222 (5206)
4　张军, 苏宝林. 水稻旱育秧立枯病及其防治、理论和实践. 北京: 中国农业大学, 1996
5　崔霞. IPT 诱导水稻幼苗抗逆性的生理机理研究. 北京: 中国农业大学, 2000
6　L iang Peng, A B Paradee. S cience, 1992, 257 (14) : 967～ 971
7　L iang P, A verboukh, A B Paradee. N ucleic A cid s R esearch , 1993, 21 (14) : 3269～ 3275
8　Bauer D avid, H eiko M uller, Jens Reich, et al. N ucleic A cid s R esearch , 1993, 21 (18) : 4272～ 4280
9　L iang Peng, W eim in Zhu, X iaoying Zhang, et al. N ucleic A cid s R esearch , 1994, 22 (25) : 5763～ 5764
10　N lum H , H Beier, H J Gro ss. E lectrop horesis, 1987, 8: 93～ 99
11　张红心, 王伟中, 夏凯等. 作物学报, 2000, 26 (5) : 599～ 604
049　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　27 卷