全 文 ：第27卷 第3期 作　物　学　报 V ol. 27, N o. 3
2001 年5月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ay, 2001
获得抗稻瘟病和纹枯病的转多基因水稻Ξ
冯道荣1　许新萍1　范　钦1　李宝健1, 3 3 　雷财林2　凌忠专2
(1中山大学生物工程研究中心, 广州 510275; 2 中国农业科学院作物育种栽培研究所, 北京 100081)
提　要　将多个抗真菌病基因连同筛选基因 hp t 一起导入一水稻品种中, 共获得49个独立的整合有1
～ 4个抗真菌病基因的转基因植株系。转基因植株中几丁质酶的酶活均高于非转化对照植株, 且转多
个几丁质酶基因或与 Β21, 32葡聚糖酶基因一起的转基因植株较转单个几丁质酶基因的植株有更高的
酶活性。抗病试验表明, 这些不同组合的R 2代转基因植株对纹枯病和稻瘟病的抗性较非转化原种对照
都有了提高。且抗性提高的程度与几丁质酶酶活的高低呈正比。
关键词　水稻; 几丁质酶基因; Β21, 32葡聚糖酶基因; 稻瘟病; 纹枯病
R ice Plan ts of M ultiple Tran sgenes for Resistance to R ice Bla st and
Shea th Bl ight D isea ses
FEN G D ao2Rong1　XU X in2P ing1　FAN Q in1　L IBao2J ian1, 3 3 　L E I Cai2L in2
L IN G Zhong2Zhuan2
(1 B iotechnology R esearch Center, Z hongshan U niversity , Guangzhou 510275; 2 Institu te of C rop B reed ing and Culture, Chinese
A cad em y of A g riculture S cience, B eij ing 100081, China)
Abstract　　M ultip le an ti2fungal genes as w ell as the m arker gene hp t w ere in troduced in to rice
variety Zhonghua 8, and 49 independen t transgen ic rice lines con tain ing one to four an ti2fungal
transgenes w ere obtained. H igher ch itinase activity ex isted in transgen ic rice p lan ts than the non2
transfo rm ed p lan ts. A nd the p lan ts con tain ing m ultip le ch itinase transgenes o r Β21, 32glucanase
transgene had more h igh ch itinase activity than that con tain ing single ch itinase transgene. B ioas2
say fo r the R 2 transgen ic rice p lan ts show ed increased resistance to rice blast and rice sheath bligh t
diseases.
Key words　　R ice; Ch itinase gene; Β21, 32glucanase gene; R ice blast disease; R ice sheath
bligh t disease
稻瘟病 (rice blast disease)和纹枯病 (rice sheath bligh t disease)是影响水稻生产最严重的两
大真菌病害。稻瘟病高发区一般是颗粒无收, 生产中虽然有一些抗稻瘟病品种, 但推广四五
年后就因出现新的致病小种而感病。纹枯病的危害虽不如稻瘟病严重, 但高发病年亦可造成
高达50% 的减产[ 1 ] , 而到目前为止, 生产中尚未发现好的纹枯病抗性资源[ 2 ]。
L in 等 (1995)报道利用单个几丁质酶基因可以部分提高水稻植株对纹枯病的抗性[ 3 ]。最Ξ 国家八六三计划资助项目 (101201202202) ; 　　3 3 联系作者
收稿日期: 2000201230, 接受日期: 2000206228
Received on: 2000201230, A ccep ted on: 2000206228

近 Y. N ish izaw a 等也报道转单个几丁质酶基因的水稻植株较原种对照对稻瘟病有更高的抗
性[ 4 ]。而本室利用几丁质酶和 Β21, 32葡聚糖酶双基因不但提高了转基因水稻植株对稻瘟病的
抗性而且提高了对纹枯病的抗性[ 5 ]。本文在以上研究的基础上将多个水稻几丁质酶基因与苜
蓿 Β21, 32葡聚糖酶基因按照3种不同的组合导入到水稻植株中, 并检测了它们对稻瘟病和纹
枯病的抗性。结果证明不同基因组合的转基因植株对稻瘟病和纹枯病的抗性相比原种对照都
有了较大提高。
1　材料与方法
1. 1　植物材料
中花8号 (O ry za sativa L. J ap onica Kato)成熟种子由广东省农业科学院水稻研究所提供。
1. 2　质粒
由图1, 质粒pAA G89 (6. 1 kb)含有苜蓿 Β21, 32葡聚糖酶基因 Β21, 32Glu (以下简称G lu) ;
质粒 pGB 12H (11. 05 kb)含有水稻碱性几丁质酶基因R C 24, 苜蓿 Β21, 32葡聚糖酶基因G lu 和
潮霉素磷酸转移酶基因 hp t; 质粒 pBAB 3H (14. 35 kb) 含有两个水稻碱性几丁质酶基因
R C 24, R CH 10, 一水稻酸性几丁质酶基因RA C 22和潮霉素磷酸转移酶基因 hp t。另外本研究
中用到的质粒还有 pA RN 6 (含R C 24基因) , pA RBC6 (含 R CH 10基因) 和 pA RA C2 (含 RA C 22
基因) , 因篇幅限制省略其结构示意图。
图1　　质粒的结构示意图
F ig. 1　　Structure of the p lasm ids
1. 3　水稻转化及转基因植株的再生
参照文献[ 6 ]。
1. 4　Southern blo t
植物DNA 的提取及分子杂交具体方法参照文献[ 5 ]。以质粒 pAA G89经 H indË + B g lÊ
酶切出的部分 G lu 基因编码序列片段 (约0. 9 kb) 作为检测该基因的探针, 质粒 pA RN 6经
H indË + P stÉ 酶切出的部分R C 24基因编码序列片段 (约0. 9 kb) 作为检测该基因的探针, 质
粒 pA RBC6经H indË + Sm a 酶切出的部分 R CH 10基因编码序列片段 (约0. 7 kb) 作为检测该
基因的探针, 质粒 pA RA C2经H indË + S acÉ 酶切出的部分RA C 22基因编码序列片段 (约0. 8
kb)作为检测该基因的探针。
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1. 5　酶活分析
1. 5. 1　粗酶的提取　　剪取水稻嫩叶200 m g, 加入800 ΛL 粗酶提取液 (0. 5 molöL N aA c
pH 5. 2, 0. 1% Β2巯基乙醇) , 4℃充分研磨。12000 röm in, 4℃离心15 m in, 吸取上清同等条件
下再抽提一次, 所得上清用于酶活分析和W estern blo t 分析。根据B radfo rd (1967)的方法, 用
蛋白分析试剂盒 (B io2R ad)测定蛋白浓度。
1. 5. 2　几丁质酶酶活测定　　取0. 5 mL 粗酶, 加入 ch itin 底物悬浮液0. 5 mL , 1 mL 0. 05
molöL 乙酸缓冲液 (pH 5. 2) , 37℃振荡反应30 m in, 沸水浴5 m in 终止反应。离心 (2000 rö
m in, 5 m in) , 吸取0. 5 mL 上清, 加入0. 05 mL 3% (w öv) 蜗牛酶 (Cytoheliase, Sigm a) , 0. 05
mL 1 molöL 磷酸钾 (pH 9. 1) , 37℃继续反应30 m in。加入0. 2 mL 0. 8 molöL 四硼酸钾 (pH 9.
1) , 100 ℃水浴3 m in, 自来水冷却后加入3. 0 mL DM AB 试剂 (100 mL DM AB: 1g DM AB +
99 mL 冰乙酸+ 1 mL 浓盐酸) , 36℃水浴20 m in, 于544 nm 读光密度A 544。令含有热变性的
抽提蛋白的反应系统的A 544值为零。几丁质酶活性单位 (un it)定义为37℃每m in 产生10- 6 mol
GlcNA c 的酶量为一个活性单位。
1. 5. 3　Β21, 32葡聚糖酶酶活测定　　吸取0. 5 mL 粗酶提取液, 加入0. 5 mL 0. 5% L am inar2
in (Sigm a) , 在50℃条件下反应1h 后, 加入3 mL 二硝基水杨酸试剂 (加300 mL 45% N aOH 到
880 mL 含有8. 8g 二硝基水杨酸和25. 5g 的六水酒石酸钾钠的溶液中) 100 ℃沸水浴5 m in 终
止反应。待冷却至室温后, 将反应液用水稀释 (1÷10) , 在500 nm 下测分光光度值。Β21, 32葡
聚糖酶活性单位 (un it) 定义为50℃ 每m in 产生相当于10- 6 mol 葡萄糖的酶量为一个活性单
位。
1. 6　W estern blot
50 Λg 可溶性总蛋白加入上样Buffer 经煮沸变性后在12. 5% 的 SD S2PA GE 凝胶上电泳2
～ 3h [ 7 ] , 用半干转移仪 (B io2R ad) 转到硝酸纤维素膜上。用大麦几丁质酶28 kD a 的抗血清[ 8 ] ,
按照试剂盒 (Pho to tope2HR P W estern D etection K it, B io2R ad) 提供的方法对转基因植株中几
丁质酶基因的产物进行检测。
1. 7　转基因后代植株的潮霉素抗性筛选
将转基因水稻种子用纸包好浸入含有50 m göL 潮霉素B 的水中, 28℃催芽36h 后, 将种
子转入铺有滤纸的培养瓶中, 加入适量含有50 m göL 潮霉素B 的水进行培养。1～ 2周后统计
抗性苗数, 并与非转化的植株比较。
1. 8　抗病鉴定
1. 8. 1　纹枯病的抗性鉴定　　将 PAD 培养基上生长的菌丝体接种在6周秧龄的稻株无伤叶
鞘上 (叶鞘高出水面6 cm 左右) , 接种后将接种体与稻株一起用 Palifilm 包扎起来, 30℃高湿
下培养2～ 3天后观察接种部位的病斑, 比较发病情况。根据O u (1983) 方法计算纹枯病感病
级别[ 9 ]。
1. 8. 2　稻瘟病的抗性鉴定　　选用能侵染中花8号的菌系 Zh221和中1028214, 对转2～ 4个抗
真菌蛋白基因的R 2代植株进行苗期稻瘟病抗性鉴定。鉴定材料穴播于育秧盘中, 每穴播约10
粒种子。苗长至4叶期用分生孢子悬浮液 (浓度为30～ 50个分生孢子ö100×视野) 进行高压喷
雾接种。接种稻苗在24～ 26℃的恒温恒湿箱 (饱和湿度) 内静置24小时, 然后移入发病玻璃房
(温度为24～ 28℃, 保持叶面有雾滴或水滴)。一个星期后进行病情调查。
5923期　　　　　　　　　　冯道荣等: 获得抗稻瘟病和纹枯病的转多基因水稻　　　　　　　　　　　　

2　结果
2. 1　转多基因水稻植株的获得
将多个抗真菌病基因用基因枪法同时导入水稻胚性愈伤组织中 (结果见表1) , 共获得107
个独立的潮霉素抗性再生植株系, 1086株抗性再生植株, 转化频率高达56. 4%。点杂交证明
hp t 基因的导入频率为100% (按转基因系计算)。
表1　　转化水稻胚性愈伤组织的实验结果
Table 1　　The transformation result of r ice embrogen ic ca ll i
转化基因组合
Group of genes
transform ed
靶愈伤组织
数目 (块)
No. of calli
bom barded
抗性植株系
数目 (个)
No. of hygr
p lant lines
抗性植株
数目 (株)
No. of hyg r
p lants
转化频率
(% ) 3
T ransform ation
rate (% ) 3
R C24, G lu, hp t 55 31 420 56. 4
R C24, R CH 10, RA C22, hp t 110 59 516 53. 6
R C24, R CH 10, RA C22, G lu, hp t 32 17 150 52. 8
　　3 转化频率= (抗性植株系数目ö靶愈伤组织数目)×100%
　　3 T ransform ation rate (% ) = (No. of hygr p lant linesö
No. of calli bom barded)×100%
　　待这些转基因植
株长到成苗期剪取叶
片提取DNA 分别以
G lu 基因, 三个几丁
质酶基因为探针进行
Southern blo t 分析。
图2是 R 0代转基因植
株G lu 基因的 South2
ern blo t 分析结果。
由图可见5个转化植
株 的 未 酶 切 样 品
( 第4、6、8、10、12道) 在高分子量区均有杂交信号 , 低分子量区没有杂交带 , 它们相应的
图2　R 0代转基因植株G lu 基因的 Southern blo t 分析
F ig. 2　　Southern blo t analysis of R 0
transgenic rice p lants for G lu gene
L ane1: pGB12H öA paÉ + X baÉ ; lane2: N T; lane3:
N TöA paÉ + X baÉ ; lane4: ZÊ 121; lane5: ZÊ
121öA paÉ + X baÉ ; lane6: ZÊ 222; lane7: ZÊ
222öA paÉ + X baÉ ; lane8: ZÊ 321; lane9:
ZÊ 321 öA paÉ + X baÉ ; lane10: ZÊ 5 - 1;
lane 11: ZÊ 5 21öA paÉ + X baÉ ; lane12:
ZÊ 621; lane13: ZÊ 621öA paÉ + X baÉ
A p aÉ + X baÉ 酶切样品 (5, 7, 9, 11, 13) 在
3. 2 kb 处均有与质粒正对照 pGB 12öX baÉ +
A p aÉ (1道) 位置一致的杂交信号。表明在所
测7株水稻植株基因组中都整合有G lu 基因的
完整表达结构 (A ctÉ + G lu+ nos) , 整合的拷
贝数目在2～ 10之间。
　　对导入质粒 pGB 12H、pBAB3H 的 R 0代
植株是否整合有几丁质酶基因 R C 24的分析,
是选用从质粒 pGB 12H、pBAB 3H 上能切下
R C 24基因完整表达结构 A ctÉ + R C 24+ nos
的A p aÉ 酶对再生植株进行消化, 结果表明
R C 24基因的完整表达结构已整合到了大部分
转基因植株中 (图片未显示)。为了进一步确
证导入质粒pBAB3H 的R 0代植株中三个几丁
质酶基因是否同时整合到水稻基因组中, 特
选用从质粒 pBAB 3H 上能切下2. 5 kb 的A ctÉ + R C 24, 3. 1 kb A ctÉ + RA C 22和2. 8 kb
nos+ A ctÉ + R CH 10结构的A p aÉ + H indË
酶, 和能切下2. 5 kb 的A ctÉ + R C 24, 3. 1 kb
的A ctÉ + RA C 22, 2. 5 kb 的A ctÉ + R CH 10
结构的H indË + X hoÉ 酶分别对转化植株和非转化植株进行消化, 0. 2 ng pBAB 3H öA p aÉ +
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图3　　R 0代转基因植株3个几丁质酶基因的
Southern blo t 分析
F ig. 3　　Southern blo t analysis of R 0 transgenic
rice p lants for th ree ch itinase genes
lane1: pBAB3H öA paÉ + H indË ; lane2: N TöA paÉ + H indË ;
lane3: ZI5221öA paÉ + H indË ; lane4: ZË 1021öA paÉ + H indË ;
lane5: ZI4221öA paÉ + H indË ; lane6: ZI1721öA paÉ + H indË ;
lane7: ZË 221öA paÉ + H indË ; lane8: ZI825öA paÉ + H indË ;
lane9: pBAB3H öX hoÉ + H indË ; lane10: N T öX hoÉ + H indË ;
lane11: ZI5221öX hoÉ + H indË ; lane12: ZË 1021öX hoÉ +
H indË ; lane13: ZI4221öX hoÉ + H indË ; lane14: ZI1721öX hoÉ + H indË ; lane15: ZË 221öX hoÉ + H indË ;
lane16: ZI825öX hoÉ + H indË
H indË 和0. 2 ng pBAB3H öX hoÉ + H indË 为 正 对 照。 结 果 见 图 3。 0. 2 ng
pBAB 3H öA p aÉ + H indË (1道) 在约2. 5
～ 3. 1 kb 处有一条很强的杂交带, 酶切
的转化植株在此位置也有相应的杂交带,
且有数目不等的其他大小的杂交带 (3,
4, 5, 6, 7, 8道) , 而未转化植株的酶切
样品没有在此位置的杂交带 (2道)。0. 2
ng pBAB 3H öX hoÉ + H indË 在约2. 5 kb
和3. 1 kb 处有两条杂交带 (9道) , 而酶切
的转基因植株在此位置也有相应的两条
杂交带 (11, 12, 13, 14, 15, 16道) , 而
未转化植株的酶切样品没有相应位置的
杂 交 带 ( 10 道 )。由 此 推 断 R CH 10,
RA C 22, R C 24三基因的完整表达结构均
已整合到了水稻基因组中。
　　综合多株 Southern blo t 的分析结果,
本研究共得到20个系的整合有3个几丁质
酶基因 R C 24、RA C 22、R CH 10和 hp t 基
因的 R 0代转基因植株, 15个系的同时整
合有 R C 24基因、Β21, 32G lu 基因和 hp t
基因的 R 0代转基因植株, 10个系的同时
整合有3个几丁质酶基因 R C 24、RA C 22、R CH 10和 hp t 基因以及 G lu 基因的 R 0代转基因植
株。从中还检测到4株仅含有 R C 24基因完整表达结构的转基因植株, 这可能是因为基因枪的
物理冲力造成转化载体 pGB 12H 刚好从 R C 24基因的完整表达结构与G lu 基因完整表达结构
中间断开的结果。
表2　R0代转基因植株几丁质酶酶活分析
Table 2　　Chitinase assay of R0 transgen ic r ice plants
材料
Samp le
几丁质酶酶活
Chitinase activity
(unitöm g p rotein) 转基因植株酶活ö非转化对照酶活The ratio of ch itinase activityof transgenic rice p lantsto those of non2
transform ed p lants
非转化对照 0. 8
R C24+ R CH 10+ RA C22 3. 4～ 19. 0 4. 2～ 23. 8
R C24+ G lu 4. 2～ 16. 2 5. 3～ 20. 3
R C24+ R CH 10+ RA C22+ G lu 3. 0～ 15. 0 3. 7～ 18. 7
R C24 1. 62～ 4. 8 2. 03～ 6
　　对整合有不同基因
组合共49个系98棵转基
因植株进行几丁质酶的
酶活分析。结果见表2。
非转化对照植株每毫克
可溶性总蛋白的几丁质
酶活性为0. 8 un it, 而
转 R C 24 + R CH 10 +
RA C 22的转基因植株测
得几丁质酶酶活为3. 4
～ 19. 0 un its, 是未转
化对照的4. 2～ 23. 8倍; 转 R C 24+ G lu 的转基因植株几丁质酶酶活是未转化对照的5. 3～ 20.
3倍; 转 R C 24+ R CH 10+ RA C 22+ G lu 的转基因植株的酶活是未转化对照的3. 7～ 18. 7倍;
7923期　　　　　　　　　　冯道荣等: 获得抗稻瘟病和纹枯病的转多基因水稻　　　　　　　　　　　　

含有单个 R C 24基因的转基因植株的酶活是未转化对照的2. 03～ 6倍。由此可说明转多个几丁
质酶基因或几丁质酶与 Β21, 32葡聚糖酶双基因的水稻植株较转单个几丁质酶基因的水稻植
株有更高的几丁质酶活性, 降解的几丁质量更大, 因而有可能更有效地降解真菌的细胞壁,
对真菌有更强的抑制作用。
2. 2　R 1代植株的遗传学分析和生物学分析
经统计, 90% 以上的R 0代转基因植株能够正常结实。经卡平方分析, 大部分转基因植株
种子中 hyg r 与 hygs 的分离比符合孟德尔3÷1的分离规律。说明多个拷贝的 hp t 基因可能是整
合在水稻基因组中同一个位点或相近位点, 另有一种可能性的解释是在转基因植株中只有一
个拷贝的 hp t 基因表达。待抗性苗播到田间长出4片叶时, 剪取部分叶提DNA 做 hp t 基因的
点杂交分析, 结果表明有98% 的苗含有 hp t 基因。由此说明了这种分析方法的可靠。因为外
源目的基因与 hp t 基因是连在同一个载体上, 故可认为 hyg r 的植株即为含有目的基因的转基
因植株。
提取转基因植株的可溶性总蛋白, 一半用于分析几丁质酶活性, 一半用于分析 Β21, 32葡
聚糖酶活性。结果转基因植株中几丁质酶和 Β21, 32葡聚糖酶的酶活量均高于非转化对照植
株, 且不同转基因中几丁质酶的活性高低与 Β21, 32葡聚糖酶活性高低是一致的 (因篇幅限制
数据未显示)。
图4　　R 1转基因植株几丁质酶的W estern blo t 分析
F ig. 4　　W estern blo t assay of R 1 transgenic rice
p lants for ch itinase
lane1: p ro tein m arker; lane2: N T; lane3: ZÉ 32123; lane4:
ZÉ 422121; lane5: ZÉ 112121; lane6: ZÉ 302121; lane7:
ZÊ 252128; lane8: ZÊ 62123 ; lane9: ZÉ 142121; lane10:
ZÉ 132121; lane11: ZÊ 172122; lane12: ZË 12124 　　图4是几株 R 1代转基因植株的W estern blo t 分析结果。与预期结果相同, 几个转基因植株在约35 kD a处有很强的免疫杂交带, 而非转化对照在此位置存在微弱的内源杂交带。说明在这几株植株中外源几丁质酶基因在蛋白质水平上获得了表达。其中几丁质酶表达量最高的是 Z I142121(10道) , 其次是 Z I32123 (3道) , 与几丁质酶酶活测定结果一致。另外未转化植株和转基因植株在28 kD a 和45kD a 处均有杂交带, 说明是组成型表达的内源几丁质酶基因。2. 3　R2代转基因纯系植株的获得R 1代转基因植株种子在播种之
前经过潮霉素抗性筛选共选出30个潮霉素抗性 (hyg r)不分离的转基因纯系。对这些 hyg r 纯合
的植株做 hp t 基因点杂交分析, 结果表明所测植株均含有 hp t 基因, 因 hp t 基因与目的基因
连在一起, 故推测外源目的基因可能也已纯合。对点杂交阳性的植株进一步做G lu 基因和几
丁质酶三基因的 Southern blo t 分析, 结果如图5, 6。由图可见, 来自于同一R 0代母株的几株
R 2代植株杂交模式完全相同且与母株一致 (图2, 3) , 说明外源基因已稳定地从R 1代遗传到了
R 2代, 并且已经纯合。
892　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　27卷

图5　R 2代转基因植株 G lu 基因的 Southern blo t
分析
F ig. 5　　Southern blo t analysis of R 2 transgenic
rice p lants for Glu gene
lane: 1 pGB12H öA paÉ + X baÉ ; lane2: N TöA paÉ + X baÉ ; lane3: ZÊ 1212121öA paÉ + X baÉ ;
lane4: ZÊ 1212122öA paÉ + X baÉ ; lane5: ZÊ
1212123öA paÉ + X baÉ ; lane6: ZÊ 6212321öA paÉ + X baÉ ; lane7: ZÊ 6212322öA paÉ + X baÉ ;
lane8: ZÊ 6212325öA paÉ + X baÉ ; lane9: ZÊ 92
32121öA paÉ + X baÉ ; lane10: ZÊ 9232126öA paÉ + X ba É ; lane 11: ZÊ 9232127öA pa É + X baÉ ; lane12: ZÊ 3212121öA paÉ + X baÉ ; lane13:
ZÊ 3212123öA pa I+ X baÉ ; lane14: ZÊ 3212126ö
A pa É + X ba É ; lane15: ZÊ 2222821öA pa É +
X baÉ ; lane16: ZÊ 2222822öA paÉ + X baÉ
　　对这些纯合转基因植株进行了几丁质酶酶活
的分析, 结果所有的转基因植株几丁质酶酶活均
高于非转化对照植株, 说明外源几丁质酶基因在
这些植株中均获得了表达, 其中转基因植株 ZÉ
14212121中几丁质酶酶活最高, ZÊ 25212821中最
低 (数据未显示)。
2. 4　R2代转基因植株对纹枯病的抗性试验
未转化对照植株接种纹枯病菌3～ 4天后在接
种的叶鞘部位出现黑褐色纹枯病病斑 (图版É ,
a) , 几丁质酶表达量低的转基因植株 ZÉ 42212121
也出现黄色的纹枯病斑 (图版É , b) , 病症比对照
轻; 较高几丁质酶表达的转基因植株 ZÊ 1212121
只出现一点针状的褐色病斑 (图版É , c) , 而高表
达几丁质酶的转基因植株 ZÉ 14212121接种部位未
出现任何病斑 (图版É , d)。两星期后, 非转化植
株病斑扩散到接种部位的上部, 而转基因植株只
局限于接种部位下部, 高表达几丁质酶的转基因
植株病状轻。说明高表达几丁质酶的转基因植株
可以增加对纹枯病的抗性。几丁质酶表达量的高
低与转基因植株对纹枯病的抗性强弱成正相关。
图6　　R 2代转基因植株3个几丁质酶基因的 Southern blo t 分析
F ig. 6　　Southern blo t analysis of R 2 transgenic rice p lants for th ree ch itinase genes
lane1: pBAB3H öA paÉ + H indË ; lane2: N TöA paÉ + H indË ; lane3: ZI52212121öA paÉ + H indË ; lane4:
ZI52212127öA paÉ + H indË ; lane5: ZI522121217; lane6: ZË 10212121öA paÉ + H indË ; lane7: ZË
10212125öA paÉ + H indË ; lane8: ZË 102121210öA paÉ + H indË ; lane9: pBAB3H öX hoÉ + H indË ;
lane 10: N TöX hoÉ + H indË ; lane11: ZI 52212121öX hoÉ + H indË ; lane12: ZI52212127öX hoÉ +
H indË ; lane13: ZI522121217; lane 14: ZË 10212121öX hoÉ + H indË ; lane15: ZË
10212125öX hoÉ + H indË ; lane16: ZË 102121210öX hoÉ + H indË
2. 5　R2代转基因植株对稻瘟病的抗性试验
9923期　　　　　　　　　　冯道荣等: 获得抗稻瘟病和纹枯病的转多基因水稻　　　　　　　　　　　　

在所测定的40个系约400株转基因植株中, 对菌系 Zh221有3株无任何病斑, 表现为免疫
(R h) , 4株表现为抗 (R ) , 2株为中抗 (M R ) , 其余为中感或高感。对菌系中1028214有7株转基
因植株表现为抗 (R ) , 5株为中抗 (M R )。而中花8号原种对照及感病对照全部表现为高感。由
图版É 可见, 几丁质表达量高的植株 ZÉ 14212121 (图版É e 左) , ZÊ 17212121 (图版É , f 左)
表现出高抗, 而几丁质酶表达量低的植株 ZÉ 42212121 (图版É , e 右) , ZÊ 25212128 (图版É ,
f 右)表现出感病。由此说明几丁质酶表达量的高低与转基因植株对稻瘟病的抗性强弱也呈正
比。对这些转基因植株的田间抗病性鉴定在进行之中。
3　讨论
利用单个几丁质酶基因改良农作物对真菌病的抗性已有成功报道[ 3～ 4, 10 ] , 但一般只对某
一种病原菌有抗性, 而不能同时抗几种病原菌。在离体条件下多个几丁质酶之间或与 Β21, 32
葡聚糖酶之间被证实有协同抑菌作用[ 11 ]。本研究首次将多个几丁质酶基因或与 Β21, 32葡聚
糖酶基因一起导入水稻植株中, 获得整合有2～ 4个抗真菌病基因的转基因水稻植株。这些转
基因水稻植株不但增强了对纹枯病的抗性, 同时也增强了对稻瘟病的抗性。而且抗性增加的
程度与转基因植株中几丁质酶酶活表达量的高低呈正比。首次证明了多个几丁质酶之间或与Β21, 32葡聚糖酶之间在水稻中有协同抑菌作用。且90% 以上高表达外源几丁质酶基因的转基
因水稻植株可以正常开花结实, 使得在生产中利用这些基因组合改良水稻的抗真菌病性状有
可行性。进一步可利用这些抗病植株作为母本与生产中高产优质的品种进行杂交以培育出抗
病性强又高产优质的“超级水稻”新品种, 以满足下个世纪人们的需要。
参　考　文　献
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003　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　27卷