全 文 ：第26卷 第4期 作　物　学　报 V ol. 26, N o. 4
2000 年7月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA July, 2000
水稻孕穗期茎注射野生稻DNA 变异株系的 RAPD 分析X
赵炳然1　贾建航2　阳和华1　李传友2　詹庆才3　王　斌2,XX
周坤炉1　袁隆平1, 3 3
(1国家杂交水稻工程技术研究中心, 湖南长沙, 410125; 2 中国科学院遗传研究所, 北京100101; 3 湖南省农业科学院生物
技术室, 湖南长沙, 410125)
提　要　利用野生稻有利基因是培育超高产栽培稻 (O ry za sativa L , 2n= 24AA 染色体组型) 的主要技
术路线之一。本研究通过穗茎注射法将小粒野生稻O. m inu ta (2n = 4x = 48, BBCC 染色体组型) 总
DNA 导入杂交稻当家亲本V 20B , 获得了变异株的3个高世代株系; 用RA PD 方法对上述3个株系、供、
受体及对照品种明恢63共6个材料进行了多态性研究分析。所用83个Operon 引物均在小粒野生稻与
V 20B 间扩增出多态性产物, 二者相似系数仅为26. 7% , 而明恢63与V 20B 二者的相似系数达90. 5%。
83个引物中有15个引物在变异株第7代株系97C277与受体V 20B 间扩增出的产物存在差异, 差异带共
有26条, 占83个引物在V 20B 中扩增出的带数397的6. 6%。其中O PB218、O PD 203、O PE209、O PE218、
O PG210及O PG211等6个引物在97C277中各扩增出1条只在供体中存在而在受体中不存在的特异带。26
条差异带中的24条在共第3代祖先的第9代2个株系98C2107、98C2165与97C277间无差异。因此, 绝大多
数DNA 水平上的变异可能从第3代起稳定遗传; 研究结果从DNA 水平证明, 变异株系中导入了野生
稻DNA , 导入野生稻DNA 可能是创造栽培稻新种质的一种有效手段。
关键词　栽培稻; 小粒野生稻; DNA 转移; 随机扩增多态性DNA
RAPD Ana lysis of New R ice Stra in s D eveloped through the M ethod of
Sp ike-Sta lk- In jecting D NA from W ild Rela tive
ZHAO B ing2R an1　 J IA J ian2H ang2　 YAN G H e2H ua1　 L I Chuan2You2　 ZHAN Q ing2Cai3
　WAN G B in2　 ZHOU Kun2L u1　YUAN L ong2P ing1
(1 China N ational H y brid R ice R esearch and D evelopm ent Center, H unan Changsha 410125; 2 Institu te of Genetics, Chinese
A cad em y of S ciences, B eij ing , 100101; 3B iotechnology L aboratory , H unan A cad em y of A g ricultural S cience, H unan Changsha
410125)
Abstract　U tilization of favo rable genes from w ild rice is a p rom ising w ay fo r rice super h igh
yield breeding. T ransferring those genes in to cultivars is the first and key step. To talDNA of O.
m inu ta (2n= 48) w as iso lated and in jected in to the sp ike2stalk s of V 20B (an elite m ain tainer line
of hybrid rice) during suitable period. V arian ts w ere found in the first generation. F rom these
varian ts new m ain tainer line have been developed. RA PD analysis w ith 83 Op ron p rim ers w as
X
XX 联系人
收稿日期: 1999201206, 接受日期: 1999210229
本研究受到“863”水稻生物技术项目和总理基金项目及湖南省科委的支持

perfo rm ed amongM inghui 63 (con tro l)、O. m inu ta (donor)、V 20B (recip ien t)、97C277 (a strain
of the 7th generation from a varian t)、98C2107 and 98C2165 (two strain s of the 9 th generation
from sister strain s of 97C277). P roducts of each p rim er w ere detected to have po lymorph ism
betw een V 20B and O. m inu ta. P roducts of 15 p rim ers are differen t betw een 97C277 and O.
m inu ta. but no t in V 20B and M inghui 63. O n ly 2 of them have po lymorph ism among 98C2107、
98C2165 and 97C277, the o thers are iden tical. T hese results indicated that the m ethod of
in jecting w ild2rice DNA in to cultivars sp ikestalk w as an effective m ethod to transfer favo rable
genes from distan t relatives besides gene engineering m ethod and in terspecific crossm ethod aided
by em bryo rescue.
Key words　O ry za sativa; O ry za m inu ta; DNA transfer; RA PD
水稻矮化育种与杂种优势利用这两次大的突破均是以新资源的发掘与利用为前提的。袁
隆平最近提出把形态改良与利用强大杂种优势结合起来培育超高产杂交水稻的技术路线, 其
主要方法是利用亚种间的杂种优势及野生稻的有利基因等[ 1 ]。野生稻中含有病虫抗性基因、
优质基因, 以及与产量性状有关的Q TL 基因[ 2～ 5 ]。通过远缘杂交结合胚胎挽救技术利用野生
稻资源的病虫抗性基因在国内外已开展了卓有成效的工作[ 3, 6～ 8 ]。但野栽交亲和性差, 成苗
率低, F 1一般高度不育, 自交不结实; 而且后代含有大量不利性状, 通过回交选育出综合性
状优良株系的周期长。因此探索更简便有效的途径是很必要的。作者运用“孕穗期穗茎注射
法”[ 9 ] , 将进行无融合生殖的大黍 (P anicum m ax im um )DNA 导入水稻获得一异常分离的高雌
不育变异, 含有与大黍有性胚囊败育方式同样的类型[ 10 ]。同样方法, 将小粒野生稻 (O.
m inu ta)DNA 导入对稻瘟病敏感的明恢63中, 选育出与小粒野生稻抗瘟性特征相似的恢复系
品系“330”[ 11 ]; 导入V 20B, 也选育出品质、株叶型及对不良环境耐性多方面比V 20B 更优的
新保持系 (结果待发表)。本研究利用RA PD 方法对后者3个高世代株系与供受体在DNA 水
平上的差异进行了检测, 同时对小粒野生稻与水稻常规种间的多态性进行了分析。
1　材料和方法
1. 1　供试材料
(1) 明恢63 (O. sativa L. 2n= 24, AA 组型)是带粳血缘的籼稻, 用作本实验的对照材料;
( 2) 外源DNA 供体为小粒野生稻 (O. m inu ta, 2n= 4x= 48, BBCC 组型) 抗白叶枯病、褐飞
虱、黑尾叶蝉、白背飞虱, 持久抗稻瘟病[ 12 ] , 栽培发现其品质好, 分蘖能力强, 但株型过散,
出穗很不整齐; (3) 受体V 20B, 籼稻, 为长江流域当家杂交稻系列组合母本V 20A 的相应保
持系, 但品质欠佳, 叶型较披垂; (4) 变异株系97C277, 98C2107及98C2165, 为1个原始变异
株的高世代株系, 3者来源与关系如下:
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D 1, 260株, 发现1株变异, 米质变优, 株高、
熟期、株叶型等发生变化。
D 2, 分离十分丰富, 选早熟、优质、偏矮株。
D 3, 开始与V 20A 测交。
D 4, 发现保持能力强, 以下各代逐代成对测
交。
D 5, 一般株型偏散, 出穗不整, 选株型适中的
极端株。
D 6, 继续选优良株叶型株系。
D 7, 株叶型理想, 但一般出穗不整齐, 选较整
齐极端类型。
D 8, 一般柱头外露率较低, 选柱头外露较好
的株系。
D 9, 基本稳定, 株叶型好, 品质优良, 相应
BC5株花粉典败。基本育成新保持系及相
应不育系。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　DNA 提取　　取各材料黄化苗5 g, 液氮深冻, 研磨成细粉, 加15 mL 提取液 (T ris.
C l pH 8. 0 100 mmolö L ; N aC l 500 mmolö L ; ED TA pH 8. 0, 50 mmolö L ; SD S 1. 5% ) 及25 LL
巯基乙醇。混匀后65℃水浴30 m in, 加5 molö L KA c 5 mL , 冰浴10 m in。用等体积氯仿 ö 异戊
醇 (v ö v= 24 ö 1)抽取, 8000 r ö m in 离心15 m in, 取上清液加等体积的异丙醇 (- 20℃预冷) , 挑
起DNA 线团, 70% 酒精洗涤晾干, 溶于 T E。0. 8% 琼脂糖凝胶电泳, 测算浓度, 保存备用。
1. 2. 2　RA PD 分析　　反应总体积25 LL , 成分为 T ris. C l pH 8. 3 10 mmolö L , M gC l22. 0
mmolö L , KC l 50 mmolö L , 四种核苷酸各为0. 15 mmolö L , 引物15 ng, 模板20 ng, T aq DNA
聚合酶1. 0U , 覆盖一滴石蜡油。反应程序如下: 反应混合物在94℃变性2. 5 m in, 然后进入循
环: 94℃变性45 s, 37℃复性1 m in, 72℃延伸1. 5 m in, 共40个循环, 最后72℃保温5 m in。扩
增产物在1. 2% 琼脂糖凝胶中电泳, EB 染色后用B io2R ad DOC21000扫描仪扫描或照相。
1. 2. 3　技术路线　　先用V 20B、97C277及小粒野生稻3个材料筛选出经多次重复确定为可
扩增出多态性产物的引物, 再用这些引物对明恢63、小粒野生稻、V 20B、97C277、98C2107及
98C2165进行扩增, 并重复。统计各引物对不同材料DNA 扩增带数并分析6个材料扩增出的
产物的多态性。
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2　结果与分析
2. 1　小粒野生稻与水稻品系间 RAPD 扩增产物的多态性
在检测过的83个引物中, 每个引物在V 20B 与小粒野生稻中均扩出差异带。83个引物在
V 20B、小粒野生稻扩增出的总带数分别为397、420。其中二者共有的带为109条。二者扩增带
相似系数按“相似系数= 2×两者均有带数ö 两者扩增带总数”公式计算, 结果为26. 7%。83个
引物中能在97C277与V 20B 间扩增出差异带的只有15个引物, 这15个引物在V 20B 中扩增出
86带, 在小粒野生稻扩增出91条带, 二者均有的带数为17, 二者相似系数为19. 2% ; 在明恢
63中扩增出82条带, 与小粒野生稻共有相同带数为17, 二者相似系数为19. 7% ; 而V 20B 与
明恢63二者共有76条相同带, 二者相似系数为90. 5%。另外, 这15个引物在明恢63与小粒野
生稻间扩增出的产物均不一样, 而有5个引物在V 20B 与明恢63中扩增产物一致。
2. 2　变异株系与供受体间 RAPD 扩增产物的多态性
83个引物中15个引物在变异株系与供、受体间扩增产物存在多态性 (表1)。多态性表现
为带的减少 (如图1中D 1、D 2位) 或和增加, 增加带分为来自供体的特异带 (如图1和图2中 S
位)及在供、受体中均不存在的新带 (如图3中N 位) 两种类型。97C277、V 20B 间差异带有26
条, 占V 20B (83个引物)总扩增带数397的6. 6%。26条带中为带减少的有12条, 占46. 2% ; 增
加带14条, 为增加新带的有8条, 占30. 8% ; 为增加供体特异带的有6条, 占23. 1%。
表1　　变异株系间及与供、受体间 RAPD 产物的多态性类型及相应引物
Table 1　　Polymorphic RAPD products among var iant- stra ins and rec ipient
引物
P rim er
97C277 98C2107 98C2165
3个变异株系间差异有 (A )无 (B)
Polymorphic RA PD p roducts being different (A )
of not different (B) among the 3 variant strains
O PB218 - 2, + 13 - 2, + 13 - 2, + 13 B
O PC213 - 1 - 1 - 1 B
O PD 203 - 1, + 13 - 1, + 13 - 1, + 13 B
O PD 213 - 1, + 1 - 1, + 1 - 1, + 1 B
O PE201 + 1 + 1 + 1 B
O PE206 - 1, + 2 - 1, + 2 - 1, + 2 B
O PE209 - 1, + 13 - 1, + 13 - 1, + 13 B
O PE218 - 1, + 1, + 13 - 1, + 1, + 13 - 1, + 1, + 13 B
O PF201 - 1 - 1 0 A
O PF214 + 1 + 1 + 1 B
O PG210 - 1, + 13 - 1, + 13 - 1, + 13 B
O PG211 + 13 0 0 A
O PH 213 - 2, + 1 - 2, + 1 - 2, + 1 B
O PH 217 + 1 + 1 + 1 B
O PX201 + 1, ? + 1, ? + 1, ? A
　　注: 带增加 (+ ) , 带减少 (- ) , 供体特异带 (3 ) , 不清楚 (?)。
　　Notes: Band num ber increase (+ ) , band num ber decrease (- ) , donor band (3 ) , no t clear (?).
这15个引物中的8个引物的RA PD 图谱中, 变异株系相对受体既有带的增加, 也有带的
减少 (表1) , 且常发现增加带与减少带在位置上相邻 (如图1中 S、D 位置)。
7244期　　　　　　　赵炳然等: 水稻孕穗期茎注射野生稻DNA 变异株系的RA PD 分析　　　　　　　　

图1　　引物O PB218的扩增图谱
本图示变异株系增加1条供体特异带 (S 位置) , 减少2
条受体具有的带 (D 1、D 2位置)。各泳道中的样品为:
M : DNA 标准分子量¸ (KDNA ö E coR É + H ind¸ ) ;
1: 明恢63 (对照) ; 2: 小粒野生稻 (供体) ; 3: V 20B
(受体) ; 4: 97C277 (D 7株系) ; 5: 98C2107;
6: 98C2164 (D 9株系)。
F ig. 1　　RA PD pattern amp lified by p rim er O PD 218
In variants, two bands of recip ient (D 1、D 2)
w ere absent but w ith one band of donor (S). Samp les
in different lanes are as fo llow s: M : DNA molecular
w eigh t m arker ¸ (KDNA ö E coR É + H ind ¸ ) ;
1: M inghui 63 (CK) ; 2: O. m inuta (donor) ; 3: V 20B
(recip ient) ; 4: 97C277 (D 7 strain of a variant) ;
5: 98C2107, 6: 98C2165 (D 9 strains of the variant).
图2　引物O PG211的扩增图谱
本图示变异株系增加1条供体特异带 (S 位置)。
各泳道中的样品为:
1: V 20B (受体) ; 2: 97C277 (D 7株系) ;
3: 小粒野生稻 (供体)。
F ig. 2　　RA PD pattern amp lified by p rim er O PG211
This fig. show s one additional band from donor
(S) besides bands of recip ient in variant strain.
Samp les in different lanes are as fo llow s: 1: V 20B
(recip ient) ; 2: 97C277 (D 7 strain of a variant) ;
3: O. m inuta (donor)
　
2. 3　变异株系多态性带的遗传稳定性
从表1中可知15个引物中仅有3个引物 (O PF201, O PG211及O PX201) 的扩增产物在3个变
异株系间存在差异。97C277扩增产物与受体有差异的26条带中的24条带, 在98C2107、98C2
165及97C277三者之间没有差异, 根据三者共同祖先为D 3代, 因此, 这些带从D 3代起有可能
就稳定下来了。而26条带中的另外2条在这3个材料间仍存在差异; 用引物O PG211扩增时,
97C277中含有的供体特异带, 在98C2107及98C2165中没有; 用引物O PF201扩增, 97C277与
98C2107减少了一条受体带, 而98C2165带型却与受体V 20B 一样 (图4中D 位)。这种高世代
株系间的遗传差异很可能是DNA 重组所致。
3　讨论
孙传清等用RA PD 方法分析了普通野生稻 (2n= 24, AA 组型) 与栽培稻间在DNA 水平
上的多态性。其研究中用的30个引物中只有3个能够在野生稻中扩增出栽培稻所没有的特异
DNA 片段[ 13 ]。本研究只用到两个栽培稻 V 20B 与明恢63, 但83个引物在小粒野生稻与
V 20B、15个引物在小粒野生稻与明恢63, 没有一个引物的扩增产物完全相同, 扩增产物相似
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系数分别为26. 7% 和19. 7% ; 而V 20B 与明恢63扩增产物相似系数为90. 5%。可见稻属中含
不同染色体组型的种间在DNA 水平上的多态性远远大于相同组型种间的多态性。因此, 在
水稻远缘杂交育种中利用不同组型野生稻资源更有利于扩大栽培稻遗传背景。
图3　　引物O PD 213的扩增产物
本图示变异株系增加一条新带 (N 位置) , 减少1条
受体带 (D 位置)。各泳道中的样品为:
1: 明恢63 (对照) ; 2: 小粒野生稻 (供体) ;
3: V 20B (受体) ; 4: 97C277 (D 7株系) ;
5: 98C2107; 6: 98C2165 (D 9株系) ; M : DNA
标准分子量¸ (KDNA ö E coR É + H ind¸ )
F ig. 3　　RA PD pattern amp lified by p rim er O PD 213
This fig show es variant strains got one band w hich
is p resent in neither donor nor recip ient (N ) and
lost one band that cxisted in recip ient (D ). Samp les
in different lanes are as fo llow s: 1: M inghui 63 (CK) ;
2: O. m inuta (donor) ; 3: V 20B (recip ient) ; 4: 97C277
(D 7 strain) ; 5: 98C2107; 6: 98C2165 (D 9 strains) ;
M : DNA molecular w eigh t m arker ¸
(KDNA ö E coR É + H ind ¸ ).
图4　　引物O PF201的扩增图谱
本图示变异株系有或无受体中1条带 (D 位置) ,
各泳道中的样品为: 1: 明恢63 (对照) ;
2: 小粒野生稻 (供体) ; 3: V 20B (受体) ; 4: 97C277
(D 7株系) ; 5: 98C2107; 6: 98C2165 (D 9株系) ;
M : DNA 分子量¸ (KDNA ö E coR É + H ind¸ )。
F ig. 4　　RA PD pattern amp lified by p rim er O PF201
This fig. show s one hand of recip ient p resent or
absent in different variant strains (D ). Sampes in
different lanes are as fo llow s: 1: M inghui 63 (CK) ;
2: O. m inuta (donor) ; 3: V 20B (recip ient) ; 4: 97C277
(D 7 strain) ; 5: 98C2107; 6: 98C2165 (D 9 strains) ;
M : DNA molecular w eigh t m arker ¸
(KDNA ö E coR É + H ind¸ ).
　
　　
　　尽管迄今稻属内种间远缘杂交成功报道涉及到17种染色体组组合形式[ 6 ] , 但野栽交仍以
相同组型杂交居多, 因为染色体组异型种间杂交 F 1、F 1BC1减数分裂中期染色体配对困难, 形
成的二价体少[ 6, 8 ] , 通过重组转移外源基因就可能局限在一定染色体间或区段间。本研究对
通过总DNA 穗茎注射法获得的1个变异株的第7代株系97C277与受体V 20B 的RA PD 初步研
究, 发现二者差异带率可达6. 6% , 其中来自供体的特异带占1 ö 5以上。另外李道远、黄兴奇
等分别将药用野生稻 (O. of f icinalis 2n = 24 CC 组型) DNA、周建林将稗草 (E ch inoch ioa
crusg alli)DNA 导入水稻, 获得了新品系[ 14 ]。因此, 无论从应用, 还是理论角度, 都值得进一
步探索用外源DNA 导入法来引进野生稻有利基因, 特别是染色体组异型种或更远缘的禾本
科种属有利基因。
从本研究RA PD 分析初步结果来看, 变异株系与受体间DNA 的差异 (包括来自供体的
9244期　　　　　　　赵炳然等: 水稻孕穗期茎注射野生稻DNA 变异株系的RA PD 分析　　　　　　　　

特异条带) , 大多可能在早世代 (D 3)稳定遗传; 但高世代 (D 7, D 9)材料不同株系间仍在个别位
点存在差异。变异株系高世代材料间及与供、受体间的这种差异, 可能是自交系选过程重组
的结果, 来自供体的一些特异带可能随不利性状的淘汰而淘汰。本研究还表明, 变异株系中
来自供体的“特异带”只占多态性带的少部分 (23. 1% ) ; 而新增加带 (占30. 8% ) 是否同样含有
供体遗传信息呢? 有待研究。
在减数分裂后适当时期, 将外源DNA 注射到水稻穗茎中, DNA 很可能主要经维管束导
管运转到花器中[ 10 ]。但外源DNA 经过何种途径转移到生殖细胞中, 以及进入何种 (雌或雄)
生殖细胞的问题还不清楚。外源DNA 进入生殖细胞后经过怎样的机制被整合到受体基因组
中呢? 本研究发现变异株系当某一引物扩增产物既有带的增加, 又有带的减少时, 则在增加
的带的邻近位置常不存在受体对应位置上的带。这是否表明外源DNA 可能通过与受体基因
组DNA 发生双链交换而替换了受体中的某些片段呢, 有待进一步研究。
由周光宇先生倡导的总DNA 导入途径, 能够引入野生稻有利性状; 又避开了基因克隆、
组织培养或大量杂交等远缘资源有利基因利用常规途径 (基因工程、远缘杂交) 的复杂步骤,
这可能是导入野生稻种质资源有用基因的一种可行途径。
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