全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 21(4)：339— 343 2001年 l1月
野生稻和栽培稻的随机多态 DNA(RAPD)分析
武 波 ，韦 东 ，秦学毅。，陈成斌 ，黄 娟 ，唐纪 良
(1广西大学农业部农业分子遗传重点开放实验宣．广西南宁 530005}2．广西农科院品种资源研究所．广西南宁 530007)
摘 要 应用 RAPD方法对药用野生稻、普通野生稻、粳稻和籼稻进行基因组多态性分析。12个随机引物共
扩增出 [32条 RAPD带 ，片段大小在 300～3 500 bp之闻，其 中有 106条表现出多态性·占总扩增 片段的
86．4 。根据遗传距离分析．用UPGMA法构建了聚类树状图，结果表明，普通野生稻的遗传特性比药用野生
稻更接近于艘培稻。
关键词 ；野生稻f栽培稻f RAPD~聚类分析
中用分类号：$511 文献标识码 ：A 文章编号：l000—3142(2001)04-0339—05
Random ampl ified pol ymorphic DNA(RAPD)
anal ysis 0f wil d rice and cul tivated rice
WU ]30 ，WEI Dong ，QIN Xue—yi ，CHEN Cheng—bin ，
HUANG Juan ，TANG Ji-liang’
【1．The Key Laborat~y of Agricultural Molecular Genetics of the Chinese Ministry o／Agr4culturat．Guangxi University—Nan—
ning 530005．China~2 mr ofCrop Reso~ces．Guangxi Academy ofAgricultural Sct~wes，Nanning 530007·China)
Abstract：The genomic DNA variations of wild rice(Oryza officinalis and Oryza rufipogon)and cultivated rice
were analyzed using randora amplified polymorphic DNA (RAPD)． Twelve arbitrary primers generated 132
RAPD bands with the size ranging from 300 bp to 3 500 bp，106 of these bands were polymorphic(86．4 )
The UPGMA cluster was conducted on the base of matrix of genetic distance．It was shown that 0．r,fip．go~
was closer to the cultivated rice than the 0．officmalis．
Key words：wild rice}cultivated rice；RAPD；cluster analysis
水稻是重要的粮食作物，全球有近一半的人 口
以水稻为主要食物。随着全球人口的快速增长，对
粮食 ，特别是水稻的需求也在快速增长。近几十年
来，由于水稻杂交技术的广泛利用，通过水稻品种
间的杂交，世界各国的水稻育种学家培育了大量高
产、优质、抗病虫害的杂交水稻，并在世界各地太面
积推广应用，使得水稻的产量太幅度提高。但是杂
交水稻的推广应用中也带来了一些问题。例如，随
着杂交水稻取代原有的地方品种，使得生物多样性
减少．生产用种的遗传基础独窄．遗传侵蚀扩大。因
此如何在保证杂交水稻高产、优质的前提下，保持
水稻的生物多样性，特别是如何利用野生稻的优质
基因(如抗虫、抗病和对非生物胁迫的耐性)来改 良
杂交水稻，已引起水稻育种学家的普遍关注。
稻属(Oryza)现有 22个种，有 2个种为栽培稻 ，
即 亚洲栽 培稻 (Oryza．sativa I )和非洲栽培 稻(0一
收藕日期 ：ZO0I一05—25
作者茼升；武 踺(1962一)．胃，广西武宜^ ．博士 ，副研究员，分子生物学专业 ．主要从事微生物和植物的分子生物学研究。
基金项目；国家转基因植物研究与产业化专项资助(编号}j0O-A一003)
维普资讯 http://www.cqvip.com
340 广 西 植 物 21卷
yza glaberrima Steud)，其余种均为野生稻。野生稻
主要分布在亚洲、非洲和中、南美洲。野生稻具有较
强的抗虫、抗病和抗逆性，是一种非常珍贵的遗传
资源。在我国，现存 3种野生稻，即普通野生稻(0一
rjr~~2 pogon．)、药 用 野 生 稻 (Oryza officinatis
Wat．ex Watt)和 疣 粒 野 生 稻 (Oryza meyeriana
Bail1．)，主要分布在我 国的南方 ，如广西、广东、云南
和海南等省区。广西位于我国的南方，气候温和，雨
水充沛。广西水稻栽培的历史悠久，稻种资源丰富。
在 七五”期问，广西农科院等单位对广西的野生稻
资源进行了普查发现，广西的野生稻资源分布很广
泛，主要为普通野生稻(Oryza r“所 。gm．)和药用野
生稻(Oryza officinalis)。这些野生稻具有抗虫 、抗病
和抗逆等优 良的农艺性状，特别是药用野生稻中，
普遍具有抗褐飞虱、稻瘿蚊、抗白叶枯病和稻瘟病，
以及抗 旱、抗寒和蛋 白含量高等优异的农艺性
状“ j。水稻育种学家对于如何将野生稻资源中的优
异性状导人栽培稻中加以利用非常感兴趣。但是由
于野生稻的遗传背景与栽培稻有一定的差距，给这
一 研究工作带来了一定 的难度。特别 是药用野生
稻，在形态上与栽培稻存在一定的差异，染色体组
型也不同(栽培稻为 AA型，药用野生稻为CC型)，
两者的杂交后代是不育的。因此进一步开展稻种的
起源、演变和分化的理论研究，特别是利用分子生
物学的方法，对不同稻种的亲源关系进行研究，为
今后更好的利用野生稻的优质基因提供理论依据。
表 1 材料来源
Table 1 The origin of materials
RAPD(random Amplified Polymorphic DNA)是
90年代建立、发展起来的一种快速、简便、有效的多
态性检测技术，主要用于遗传和分类方面的研究工
作。近年来，国内有不少学者利用RAPD技术，对多
种作物品种进行了遗传和分类分析。 。在本文中，
我们利用 RAPD技术，对来源于广西的药用野生
稻、普通野生稻和籼稻、梗稻的亲源关系进行了探
讨。
1 材料与方法
1．1实验材料
本实验所用的稻种品种、来源见表 l。
k 2水稻基因组 DNA的提取
对于每一份水稻样品，均分别剪取 3～4片新
鲜、幼嫩的叶片，用 CTAB法提取总 DNA“ ，分别溶
于 l xTE中，然后用 0．8 的琼脂糖凝胶电泳检测
DNA的分子量，并根据 EB染色强度计算DNA的
浓度。
1．3 PCR反应条件
PCR反应所需的 Taq酶、dNTP和随机引物购
于上海生工公司。PCR仪为PE公司480型。
PCR扩增的条件为：反应体积 2O I 。其中10
x PCR buffer 2 I～2 5mM dNTP1．5 gI ．2O 9mol／
I 引物 0．5 gI一 邑DNA l gI ，Tag酶 l gI (1 u／
I )，加水补足 2O I 。反应条件为：96。c变性 3O s，
36。C退火 30 s，72。C延伸 1 min，5个循环后 ，再按
下列条件：94℃ 变性 30 s，36。C退火 30 s，72℃ 延
伸 1 min，进行 40个循环，然后 72。C延伸 5 min。
维普资讯 http://www.cqvip.com
4期 武 波等：野生稻和栽培稻的随机多态 DNA(RAPD)分析 341
1．4数据处理与统计分析
PCR反应后 ，用 1．4 PCR反应后 ，用 1．4
琼脂糖凝胶 电泳、染色 、照相 ，并记录每一条清晰的
扩增带的位置。
比较同一 I物对 16个样品的扩增结果 ，在同一
琼脂糖凝胶上具有不同迁移率的扩增带称为不同
的RAPD标记(RAPD marker)，相对迁移率相同的
扩增带为同一 RAPD标记。判读每个样品的全部
PCR扩增结果，若有 RAPD标记，则将其记为 1，若
无标记则记为 0；所有 l6个样品都具有的扩增带为
公共带，反之则称为特异带 将所有引物扩增的结
果编辑成文件 ，在计算机上 ，用 RAPINstanee软件，
计算遗传相似度(Similarity，s)和遗传距离(Genetic
distance)：遗传相似度的计算应用Nei的公式” ：
S=2 ／( ，+ )
， 为一个样品的总扩增带数 ； 为另一个样
品的总扩增带数； 为 2个样品共有的扩增带数；S
为2个样品之间的相似度。
遗传距离按以下公式计算：
P一 1-S
P为遗传距离，S为遗传相似度。
然后根据遗传距离，按 UPGMA方法对 RAPD
扩增结果进行聚类分析，构建分子聚类图谱 。
表 2 十二条引物的序列和产生的 RAPD标记
Table 2 RAPD markers produced by 12 sclected primers
扩增带 AmpIitied bands
引物 序列(5’～3’) _酉蕊 — 磊 帮 『_蚕 至百 瓦
Primer Sequnce(5’～ 3” No ofob No po— Percent of po
tained lymophi~ lymorphlc( )
表 3 十六个水稻样品的遗传距离矩阵
Table 3 Matrix of genetic distance of 16 samples of rice
sa
⋯
mp [es Al AZ A3 A4 Bl BZ B3 B4 C1 CZ C3 C4 Di D2 D3 o4
Al C 0
A2 C 2{6 2 0 0
A 3 0 289 8 0 193 9 0 0
A4 0 229 4 0 1 491 0 172 8 0 0
H1 0． 1 9 0 716 9 0 724 2 0 728 7 0．0
132 0．727 5 0．722 3 0．730 0 0 734 6 0 201 3 0．0
B3 0 742l 0 755 g O 744 3 0．74g 5 O 258 2 0 3ll 8 O．0
B4 0 75O 0 0 764 6 0 752 3 0．756 7 0 3381 0 323 2 0 297 0 0 0
Cl 0 780 2 0 783 8 0．782 0 0．785 5 0．541 6 0．577 4 0．523 4 0．606 3 0 0
C2 0 772 7 0 776 5 0 774 6 0 778 4 0．549 0 0 585 5 0 556 7 0．615 5 0．237 4 0 0
C3 O 7 57 3 O 761 4 O．759 4 O 763 4 O．545 3 O 543 9 0 54O l 0 57 3 0 0 28e 7 O 292 8 0 O
C4 0 770 7 0 774 6 0．77Z 7 0 776 5 0 5l8 6 0 556 2 0 512 3 0 586 1 0 25 6 0 256 3 0 281 3 0 0
D1 0．76 5 3 0．769 1 0 767 2 0 771 0 0．47 3 0 0．510 2 0．493 2 c 5 5]7 0．307 6 0 263 5 0 35l l 0 301 5 0．0
D2 0 765 3 0．759 9 0 757 9 0．761 9 0 500 0 0 523{0 519 9 0 564 7 0 348 7 0 333 3 0．370l 0 364 5 0 258 2 0 0
I33 0 774 6 0 76B 9 O 767 0 0．770 B 0 515 1 0 525§0 522 2 0．568 6 0．3 6．t 5 0 328 5 0 347 2 0
． 36i 2 0 299 d 0 249 1 0 0
D4 0 76l 4 0 765 3 0 763 4 0．767 2 0．529 2 0 555 2 0．536 4 0 60 6 3 0 309 7 0 2 9O 7 0 372 7 0 326 2 0 284 7 0 328 8 0 323 9 0
． 0
2 结果 与分析
2．1水稻样品的 RAPD片段的多态性分析
在本实验中，我们分别用 50个随机引物对 l6
个水稻样品进行了 PCR扩增 从中筛选 出 12个扩
增效果较好随机引物对 16个样品再次进行 PCR扩
增。实验结果表明，不同的随机引物扩增出的RAPD
片段有差异，最少的为 7条，最多的达 18条；l2个
随机引物共获得 132条RAPD片段，平均每条随机
引物可以扩增出 u 条 RAPD片段(图 1)。扩增出的
RAPD片段的长度在300～3 500 bp之间；在获得的
132条 RAPD片段中，有 106条表现出多态性，占
86．4 ，1 6个样品均有的单态性片段为 l8条，占
1 3．6 (表 2)。
2．2水稻样品的遗传距离
根据 Nei等人的遗传相似度公式和 12条引物
的 PCR扩增带的数 目，计算出 l6个水稻样品的遗
传相似度，然后再换算成遗传距离，结果见表 3。
2 3十六个水稻样品的聚类关系
根据遗传距离，按 UPGMA法，对 16个水稻样
维普资讯 http://www.cqvip.com
342 广 西 植 物 21卷
品进行聚类分析，构建系统树 ，结果见图3。
从 UPGMA聚类分析结果看，l6个水稻样品可
以分为 2类 。第一类为 4份药用野生稻样品。这 4个
药用野生稻样品的遗传距离为 0．149 1～0．289 8；
但与其他的 3种水稻样品的差异较大 ，遗传距离在
0．71 6 9～0．783 8之间。第二类为 4份普通野生稻
样品、4个粳稻品种和 4个籼稻品种。其中4份普通
野生稻首先聚类，遗传距离为 0．201 3～0．338 1。4
个粳稻品种之间的遗传距离为 0．237 4～0．292 8，
首先聚类在一起；而 4个籼稻品种的遗传距离约为
0．249 1～0．328 8，首先聚类在一起，再与 4个粳稻
品种聚为一类(遗传距离为 0．263 5～0．370 1)，然
后再与 4份普通野生稻聚类，普通野生稻与栽培稻
(粳稻和籼稻)的遗传距离为 0．473 0～0．615 5。
M ^I A2 A4 B1 砒 ¨ C1 C2 0 c4 D1 m m D4 M
图 1 引物 S6g的RAPD电诛结果
Fig l RAPD prtxlucts of primers$62
M为 1 kb DNA Ladder Marker}A～A 为药用野生稻样品一B B 为普通野生稻样品；cl～c4为粳稻品种}D1～D4为籼稻品种
图 2 引物 s301的 RAI D电泳结粜
Fig·2 RAPD products of primers$62
M 为 1 kb DNA LadderMarker；A．～A．为药用野生稻样品；B．～B 为普通野生稻样拈：C1～c4为粳稻 品种 }D1～D4为籼稻品种
聚类分析结果表明，普通野生稻与栽培稻 (粳
稻和籼稻)的亲源关系较近，而药用野生稻与普通
野生稻、栽培稻的亲源关系较远(遗传距离在 0．71 6
9～0．783 8之间)。
3 讨 论
水稻(特别是栽培稻)的起源问题一直是科学
家们感兴趣的研究课题。通过形态、染色体组型和
同工酶分析等，现在普遍认为普通野生稻是亚洲栽
培稻的祖先。而药用野生稻与栽培稻的亲源关系较
远 。对于水稻的起 源和水稻 品种 间亲源关系的研
究，长期以来主要以常规方法为主。随着分子生物
学技术的发展，越来越多的科学家将分子生物学方
法(如 RAPD技术和 RFI P技术等)应用到物种的
起源和进化研究中。近 1O年来，国内也有将分子生
物学技术应用于水稻的起源、分类和亲源关系等方
面的报道。庄杰云 等应用 RFI P标记研究了普通
野生稻、粳稻和籼稻的亲源关系。他们认为普通野
生稻、粳稻和籼稻的遗传距离基本一致 。肖晗等。 比
较了普通野生稻与栽培稻的叶绿体 DNA的 RFI P
片段的多态性，结果表明普通野生稻与粳稻的叶绿
体基因组类型相同。孙传清等。 利用 RAPD技术分
维普资讯 http://www.cqvip.com
4期 武 波等：野生稻和栽培稻的随机多态 DNA(RAPD)分析 343
遗传距离 Genetic Distance
O 2 O．4 O．6 0 B
图 3 十六个水稻样品的 UPGMA幕类图
Fig 3 The dend rogram of 16 samples of rice
constructed by UPGMA
析了梗稻、籼稻和普通野生稻的亲源关系。他们认
为多数普通野生稻偏粳稻，但也存在偏籼稻的普通
野生稻。王振山等。”通过RAPD分析则认为并没有
完全分化为粳稻和籼稻的普通野生稻。
在本文的研究中，我们利用 RAPD技术分析了
4份药用野生稻样品、4份普通野生稻样品，与 4个
粳稻品种和 4个籼稻品种的亲源关系。通过聚类分
析t我们发现，4个品种内的样品首先分别聚类，然
后梗稻与籼稻聚类，再与普通野生稻聚类；而药用
野生稻与其余 3个品种的亲源关系较远，遗传距离
在 0．71 6 9～0．783 8之间。这一研究结果，与通过
常规方法对药用野生稻、普通野生稻与栽培稻的亲
源关系进行研究所得的结果基本一致。
药用野生稻具有许多优良性状，如果将这些优
良性状导八栽培稻中，培育出高产、优质、抗逆性强
的杂交水稻，将 能取得 巨大的社 会效益 和经济效
益。但是由于药用野生稻与栽培稻的杂交后代的不
育性，给利用药用野生稻的优良性状带来了一定的
难度 。虽然可以通过胚胎拯救(embryo rescue)方法
获得药用野生稻与栽培稻的杂交后代，但获得的杂
交后代多为异源单体附加系，这给今后进一步应用
增加了困难。若药用野生稻与栽培稻的染色体间存
在部分同源关系，则可通过染色体组问的稀有重组
(rare recombination)来实现目的基因的转移。Jena
等“。：对药用野生稻和栽培稻的 RFI P图谱进行了
比较，发现药用野生稻 12条染色体中有 9条与栽培
稻有高度同源序列。我们的研究表明，虽然药用野
生稻与栽培稻的亲源关系较远．但是仍然存在一定
的同源性 这些研究结果，为今后将药用野生稻优
良性状转移到栽培稻中提供了一定的理论依据。
参考文献：
(1]吴橐妙 野生稻赍源研究论文选编2c]．北京：中国
科学技术出版社，1990．
2]应存 山，盛锦山，罗 利军，等．中国优异稻种资源
[M] 北京 ：中国农业出版社 ，t997．
(3]梁红健 ．刘 敏 ，钟志宇，等 中国部分兰花品种的
RAPD分析[J] 园艺学报，l996 r 23(4)：365—370
[4]盂祥栋，马 红，张卫华．RAPD技术对葱属品种遗
传关系的分析_J]．生物多样性，1998，6(t)：37—4t
(5]邱丽娟 ．Randatt I』Nelson，【‘iLa O Vodkin 等、利甩
RAPD技术标记鉴定大豆资源口]．作物学报，1997，
23(4)：408— 417
c6]顾红雅，瞿礼嘉．明小天，等．植物基因与分子操作
[M]．北京：北京大学出版杜．1 995．
(72 Nei M．Molecular evolutionary genetics．Columbia U—
niversity Presst New York，1987
[8]庄云杰 ，钱惠荣 ，林鸿宣，等 应用 RFI P标记研究
亚洲稻的起源与分化口]．中国水稻科学，t995，9
(3)：l 35— 140．
(93肖 啥，应存 山．黄大年．中国栽培稻及其近缘野生
种叶绿体DNA的限制性片段长度多态性分析[j]．
中国水稻科学，[996，10(1)：!-21．-124．
C1．0]孙传清，毛 龙 王振山，等．栽培稻和普通野生稻
基因组的随机扩增多态性[13 中国水稻科学，t995，
9(1)：l 6．
(1t]王振山，陈 洪．朱立煌 ．等．中国昔通野生稻遗传
分化的RAPD研究[J]植物学报，t996，38(9)：749
7 2．
2)】ekXR K K，Kh,as~a G S，Koch口t G．Comparing：re
RFI P mapping of a witd rice．Oryza officinali．~ and
cultivated rice[J]，O． 口 ztm．Genome．[994．37(3)：
382— 389．
M 雎 町 ∞ 口￡： 叭眦 町阱
维普资讯 http://www.cqvip.com