全 文 ：第 27 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 27, N o. 6
2001 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2001
水稻温敏叶绿素突变体叶片蛋白的双向电泳分析Ξ
何瑞锋　丁　毅ΞΞ 余金洪
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 湖北武汉 430072)
提　要　采用经改进的蛋白质双向电泳技术, 分析了水稻温敏叶绿素突变体武金 4B 和 1103S“斑马
叶”性状表达过程中叶片蛋白质的变化。结果表明: 在该性状表达期, 叶片蛋白质含量下降, 特别是
R ub isCO 大、小亚基含量明显减少; 在叶片的失绿部分蛋白 P1 (MW 56 kD , p I 6. 7)发生特异缺失; 在
叶片的绿色部分该蛋白明显表达。复绿后, P 1 蛋白正常表达。在对照及未经变温刺激的武金 4B 叶片中
该蛋白表达明显。由此推测: P1 蛋白可能是一种与叶绿素代谢过程密切相关的重要功能蛋白。此外, 本
文还就这种“斑马叶”性状应用于水稻育种实践的可能性进行了讨论。
关键词　水稻; 叶绿素突变体; “斑马叶”; 双向电泳
Ana lys is of L eaf Prote in of the Tem pera ture- sen sit ive Chlorophyll
D ef ic ien t R ice M utan ts by Two-d im en siona l Electrophores is
H E R u i2Feng　D IN G Y i　YU J in2Hong
(K ey L abora tory of M O E f or P lan t D evelopm en ta l B iology , W uhan U niversity , W uhan 430072, Ch ina)
Abstract　　T he altera t ion of leaf p ro tein of tw o tem pera tu re2sen sit ive ch lo rophyll deficien t
rice m u tan ts W u jin4B and 1103S w as stud ied w ith tw o2dim en siona l electropho resis du ring
the period w hen z ebra2leaf t ra it appeared. T he resu lts du ring the p rocess of appearing z ebra2
leaf show ed tha t the p ro tein con ten t of leaves, especia lly the la rge subun it and sm all subun it
of R ub isCO , decreased. A specia l po lypep t ide2P 1 (MW 56kD , p I 6. 7) d isappeared in the
yellow area of leaves and ex isted st ill in the green area. P 1 po lypep t ide can no rm ally exp ress
in re2green ing areas of m u tan ts leaves and in the leaves of the con tro l p lan ts as w ell as in tha t
of W u jin4B trea ted by unvaried tem pera tu re. It w as suggested tha t P 1 p ro tein cou ld be an
im po rtan t funct iona l p ro tein rela ted w ith ch lo rophyll2syn thesis.
Key words 　 　 R ice, Ch lo rophyll deficien t m u tan t; Z ebra2leaf ; Tw o2dim en siona l
electropho resis
叶绿素突变体在高等植物的光合作用、叶绿素的生物合成、叶绿体的遗传、分化和发育
等研究中具有重要意义[ 1 ]。目前, 国内外在水稻[ 2～ 3 ]、小麦[ 4～ 5 ]、大麦[ 6 ]、玉米[ 7 ]等多种作物
上已有报道。温敏转绿型叶绿素突变体是众多叶绿素突变体中较为特殊的一类, 其失绿的部
分可以随着环境温度的变化而逐渐复绿。水稻温敏转绿型叶绿素突变新类型 1103S 最初是从ΞΞΞ 通讯联系人。
收稿日期: 2000204219, 接受日期: 2000210208
Received on: 2000204219, A ccep ted on: 2000210208国家“九五”科技攻关 (960200202) 和湖北省自然科学基金资助项目。Suppo rted by the State Key P ro ject during theN in th2F ive2year P lan (N o. 960200202) and H uBei N atural Science Foundation

温敏不育系 8902S 中发现的。这种突变体的特点是: 植株生长前期由于自然变温和昼夜温差
的影响, 叶片上出现垂直于叶脉的镶嵌失绿, 形同“斑马纹”, 故又称“斑马叶”。叶片上失绿
的部分经一段时期又可自然复绿, 使叶片呈现一致的绿色。遗传分析表明, 该性状受隐性核
基因控制[ 8 ]。经多年、多地 (湖北武汉、襄樊, 四川泸州、乐山, 海南三亚等) 及不同季节分期
播种实验观察, 在自然条件下, 该性状表现稳定[ 9 ]。为了揭示这种特异性状的表达机制, 本
研究以 1103S 及以其转育的具“斑马叶”性状的武金 4B 为材料, 利用双向电泳技术检测了该
性状表达过程前后叶片蛋白质的变化, 并分析了在不同温度处理和不同遗传背景下叶片蛋白
变化的特点。
1　材料与方法
1. 1　材料
以 1103S (从温敏型核不育系 8902S 中选育的自然突变体) 和武金 4B (由 1103S×武金
3B , 再经多代选育而成) 为材料, 以武金 3B (无“斑马叶”性状) 和 F 1 (F 1 为武金 4A ×R 958 的
杂种一代, 无“斑马叶”性状; 武金 4A 为武金 4B 转育的不育系, 具“斑马叶”性状; R 958 为恢
复系, 无“斑马叶”性状)为对照。以上材料均为武汉大学遗传研究所提供, 于 4 月下旬同时播
种于武汉大学遗传育种实验基地, 5 月下旬移栽, 室外自然条件诱导武金 4B 和 1103S 的失绿
与复绿。另外, 还在人工控制的培养室中对武金 4B 进行 30℃高温 (昼夜均温 30℃)和 20℃的
低温 (昼夜均温 20℃) 两种不同的恒温处理, 即当秧苗长到三叶一心时, 分别移入 30℃和
20℃的恒温条件下生长 7d, 相对湿度 85% , 光照 10000 L x, 12ö12h (光照ö黑暗)。
1. 2　方法
1. 2. 1　取样　　对武金 4B 和 1103S, 在“斑马叶”性状表达前、表达中、复绿后分期、分批取
样 (在表达中期, 对同一叶片上失绿部分和绿色部分分别剪下收集)。另取生长于同样条件下
的武金 3B 及 F 1 叶片作为对照。高温 (30℃) 和持续低温 (20℃) 处理的武金 4B 的叶片亦作为
对照分别取样。
1. 2. 2　样品制备　　按D am erval 等 (1986)的方法[ 10 ]加以改进。取不同时期和不同处理的相
关材料的新鲜叶片 200 m g 加 20m gPV P 及少许石英砂于液氮中碾成粉末, 加入 3 mL 10% 三
氯乙酸 (丙酮配制, 内含 0. 07%B 2巯基乙醇) , - 20℃沉淀 1h, 于 4℃, 15000 röm in 条件下离
心 15 m in, 沉淀悬浮于 3 mL 冷丙酮 (其中含 0. 07%B 2巯基乙醇)中, - 20℃放置 2h (或过夜,
期间每隔一定时间振荡一次, 并换液 1～ 2 次, 使色素充分脱去) , 同上离心, 再将沉淀悬浮
于 80% 冷丙酮中- 20℃放置 1h, 离心去丙酮后将沉淀干燥成粉。按每m g 干粉加 10 ΛL U SB
[ 9. 5M öL 尿素, 4%N P240, 2. 5% 两性电解质载体 (其中 0. 5%pH 3. 5～ 10, 0. 5%pH 4～ 6,
1. 5%pH 6～ 8) , 5%B 2巯基乙醇 ], 35℃保温 30 m in 以上, 上样前于 15000 röm in 离心 10
m in, 上清液上样 (上样量为 20 ΛL )或- 70℃保存。
1. 2. 3　双向电泳　　参照 Ju lio 等 (1998)的方法[ 11 ]并修改。
第一向为等电聚焦 ( IEF ) : 取尿素 2. 06g, 加入 0. 75 mL 双蒸水, 0. 75 mL 10% 的N P2
40, 0. 5 mL 凝胶储液 (30. 38%A crö1. 62%B is)和两性电解质 0. 05 mL pH 3. 5～ 10、0. 05 mL
pH 4～ 6、0. 15 mL pH 6～ 8, 再加入 10 ΛL 10%A P 和 3 ΛL T EM ED , 混匀后灌胶。胶管内径
1 mm , 胶长 13 cm。在室温下, 按 200V , 15 m in; 300V , 20 m in; 400V , 30 m in; 500V , 30
m in; 600V , 16h 的程序聚焦。仿王台的方法[ 12 ]测定等电点。
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第二向为 SD S2PA GE: 分离胶浓度 13% , 浓缩胶浓度 5%。蛋白质分子量购自 P rom ega
公司。4℃冰箱中电泳, 恒压 200V。用考马斯亮蓝R 2250 染色, 7% 乙酸脱色, 脱色后的胶立
即拍照或制成干胶保存。
2　结果
2. 1　“斑马叶”性状表现特点
在自然条件下, 由于季节性变温和昼夜温差变化的影响, 武金 4B 和 1103S 在生长前期
会表现出“斑马叶”性状, 再经一定时期 (20d 左右) 这种性状自然消失, 叶片又呈现一致的绿
色 (复绿)。“斑马叶”性状主要在 3～ 6 叶期出现, 移栽后的一个月内长出的新叶叶片及叶鞘上
最易表现, 在这期间一般白天生长的一段为绿色, 夜晚生长的一段为黄色。多次观察显示,
这种性状表现稳定。而同期播种的武金 3B 和 F 1 在同样条件下没有出现叶色变化 (前期一直
保持绿色)。另对生长在人工控温的培养室中的武金 4B 在高温 (30℃)和持续低温 (20℃) 下生
长的植株叶片均未表现“斑马叶”性状。以上观察结果说明, 一定的变温 (28℃左右—20～
23℃—26℃左右) 刺激是导致温敏叶绿素突变体武金 4B 和 1103S 叶片间断失绿呈现“斑马
纹”性状的必要条件之一。
2. 2　叶片蛋白质双向电泳结果
采用以上经改进的方法, 对几种材料的叶片蛋白质进行双向电泳分析, 取得了较好效
果。第一向经考马斯亮蓝染色可分辨出 30～ 40 条染色带, 再经 SD S2PA GE 可分辨出 300 多
个叶片蛋白质 (肽点)。等电点范围一般分布在 p I 4. 1～ 8. 2, 分子量范围 10～ 100 kD。谱带
纵横干扰少, 点的形态规则, 稳定性高, 重复性好。
从全部图版A 至 I 来看, 一些特征蛋白质点是相似的, 如L s (MW 56kD , p I 7. 2) , Ss
(MW 15kD , p I 7. 5) , 蛋白质点 P 2 (MW 56kD , p I 6. 5)等。比较武金 4B“斑马叶”性状表达前、
后整个过程的叶片蛋白, 发现“斑马叶”表达期叶片失绿部分蛋白质点 P 1 (MW 56kD , p I 6. 7)
发生特异缺失 (图B ) , 而表达前 (图A )、表达期的绿色部分 (图 C) 和复绿后 (图D ) 此蛋白均
明显表达, 是含量较高的组分之一。对照武金 3B (图 H ) 和 F 1 (图 I) 此蛋白点也非常明显。
1103S 该性状表达期叶片的失绿部分检测结果 (图E)与武金 4B 相似, 即此期叶片失绿变黄的
部分检测不到蛋白质 P 1。1103S“斑马叶”性状表达前和复绿后的叶片, P 1 蛋白亦与同期的武
金 4B 相似, 即这两个时期 P 1 蛋白明显表达 (资料未显示)。而在高温 (30℃) 条件下生长未经
变温处理的武金 4B 此蛋白大量表达 (图 F )。持续低温 (20℃) 处理的武金 4B 此蛋白组分 P 1
同样未受影响, 明显表达 (图 G)。
此外, 我们还可明显发现, 武金 4B 和 1103S“斑马叶”性状表达期叶片失绿组织中L s 和
Ss 组分虽能稳定表达 (图B、图 E) , 但含量较表达前 (图A )、复绿后 (图D ) 及对照 (图H、图
I)有明显减少, 且其它蛋白组分含量也存在不同程度的降低。
3　讨论
低温会导致水稻叶片蛋白质呈下降趋势, R ub isCO 表达量明显减少[ 13 ]。武金 4B 和
1103S 经一定的相对低温 (特别是春季寒潮引起的温度骤降, 如由 28℃左右降至 18～ 20℃)诱
导后表现出“斑马叶”性状[ 8, 9 ] , 此时其叶片失绿组织蛋白各组分含量明显下降, 尤以
R ub isCO 大、小亚基下降最为明显 (图B、E)。复绿后, 各组分的含量明显增加 (图D )。这与
7786 期　　　　　　　何瑞锋等: 水稻温敏叶绿素突变体叶片蛋白的双向电泳分析　　　　　　　　　　　

郭蔼光等[ 4 ]对小麦返白系的研究结果相似。高等植物的R ub isCO 是一个由细胞核和叶绿体基
因组共同编码的基因产物, 其大亚基的合成由叶绿体基因组中单一的基因编码, 而小亚基的
合成则由核基因组中的多基因编码[ 14 ] , 大亚基缺失是致死的, 而小亚基的异常可表现出非致
死性[ 15 ]。本文研究的这种“斑马叶”性状, 在其性状表达时期虽然叶片失绿部分的 R ub isCO
大、小亚基含量下降, 但并不缺失。而在叶片的失绿部分有一蛋白质点 P 1 (MW 56kD , p I 6.
7)发生特异缺失。两种表现“斑马叶”性状的材料武金 4B 和 1103S 虽然遗传背景不尽相同,
但这一蛋白质点 P 1 的缺失是一致的 (图B、E)。而表达前、复绿后的叶片和其它正常绿叶该
蛋白是明显稳定表达的 (图A、D、I)。由此可以推测, 蛋白质点 P 1 是维持水稻正常绿色的功
能性蛋白之一。它的表达可能与叶绿素的正常代谢密切相关。通过对“斑马叶”性状表达期同
一叶片上失绿部分与绿色部分的蛋白组分比较分析发现, 失绿部分特异缺失 P 1 蛋白, 而绿色
部分此蛋白明显表达, 说明两者存在表达的组织差异性。这从另一个侧面说明, P 1 蛋白可能
参与叶绿素的有关代谢过程。
此外, 我们还观察到, 未经一定的变温刺激的武金 4B , 叶片未出现“斑马纹”, 蛋白质点
P 1 稳定存在 (图 F、G)。看来, 温度在武金 4B 和 1103S P 1 蛋白的表达中起调控作用。可能在
编码该蛋白的基因的转录启动区序列存在对一定温度变化敏感位点, 在植株发育的特定阶
段, 一定的季节性变温或昼夜温差的变化, 导致启动区这一温度敏感位点开启或关闭, 如白
天温度较高, 能正常启动 P 1 基因的表达, 夜晚温度较低, 导致启动区关闭 P 1 基因不能转录
和翻译, 影响叶绿素的合成, 致使叶片失绿。经一定时期, 这种调控又是可逆的, 使失绿部分
复绿。因为基因的启动子内有多种功能不同的调节区, 基因表达与否或表达的强弱取决于调节
蛋白与其同源性的调节区的相互作用[ 16 ]。环境温度间接调控 P 1 蛋白的表达, 使“斑马纹”在植
株特定发育阶段呈现或消失, 这种感温机制可能是突变体武金 4B 和 1103S 所特有的。
P 1 也可能是一种重要的类囊体膜蛋白。叶绿素的合成与类囊体膜的结构及组分变化密切
相关。当 P 1 蛋白表达受阻, 类囊体膜结构或组分发生改变, 影响叶绿素合成, 发生失绿现象。
据邵继荣等 (1999) 对 1103S“斑马叶”性状表达全过程叶绿体的超微结构观察显示: 该性状表
达期叶片失绿部分叶绿体内部结构发生退化, 在叶片失绿部分的复绿过程中, 叶绿体的这些
变化又可逆转, 内部结构重建[ 9 ]。由此看来, “斑马叶”性状表达期叶片失绿部分与绿色部分
P 1 蛋白表达的组织差异性及复绿后 P 1 蛋白的正常恢复与上述邵继荣等所观察到的整个过程
中叶绿体结构的变化相关, 即在失绿部分 P 1 蛋白缺失时其叶绿体内部结构严重退化; 复绿
后, 随着 P 1 蛋白恢复正常表达, 叶绿体结构也发生重建。由此推测, P 1 蛋白可能对维持叶绿
体正常结构和功能有着重要意义。所以, 对“斑马叶”性状的进一步探索及这种特异蛋白 P 1 的
深入研究, 可能对揭示叶绿体的结构与功能及叶绿素的代谢机理提供新的思路。
在水稻特别是杂交水稻育种实践中, 选育具有指示性状的杂交组合越来越受到人们的关
注。特别在目前光温敏不育系不稳定的情况下, 若选择既在苗期表现明显不同于正常绿叶而
又植株健壮, 对产量影响小的隐性叶色标记性状, 将其导入对温度敏感的光温敏核不育系,
利用叶色在苗期帮助检出假杂种, 将是提高两系法杂交种种子纯度的一种简易有效方法。许
多育种工作者在这方面已作了一些有益的探索[ 17, 18 ]。水稻“斑马叶”性状是一种特殊的温敏
转绿型叶绿素突变性状, 这种性状有其独特优点: 受隐性基因控制; 阶段性表达, 易于鉴别;
对作物本身的光合性能及产量性状无不利影响等。所以, 它具有作为标记性状的潜在可能
性。而且, 我们已初步选育出具有“斑马叶”性状的三系新组合 (即不育系和保持系具“斑马
878　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　27 卷

叶”性状) , 有关这一特殊性状的遗传稳定性及新组合的生产应用前景在进一步研究中。
参　考　文　献
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图版说明
L s: RubisCO 大亚基, Ss: RubisCO 小亚基, P1: 56 kD (p I6. 7)蛋白质, P2: 56 kD (p I6. 5)蛋白质, 图A. B. C.
D. H. 的左边为M (m arker)。A : “斑马叶”性状表达前, 武金 4B 叶片蛋白质双向电泳图谱, 示 P1 存在。B: 性状表达
期, 武金 4B 叶片失绿部分蛋白质双向电泳图谱, 示 P1 不存在。C: 性状表达期, 武金 4B 叶片绿色部分蛋白质双向电
泳图谱, 示 P1 明显表达。D: 复绿后, 武金 4B 叶片蛋白质双向电泳图谱, 示 P1 正常表达。E: 性状表达期, 1103S 叶
片失绿部分蛋白质双向电泳图谱, 示 P1 不存在。F: 高温 (昼夜均温 30℃)生长的武金 4B, 示 P1 稳定存在。G: 持续
低温 (昼夜均温 20℃)处理的武金 4B, 示未受低温处理影响的 P1 正常表达。H: 对照武金 3B, 示 P1 稳定存在并且其
表达不受变温诱导影响。I: 对照 F1, 示遗传背景改变后变温诱导不再影响 P1 正常表达。
Explana tion of pla te
L s: large subunit of RubisCO. Ss: sm all subunit of RubisCo. P1: 56 kD (p I6. 7) p ro tein. P2: 56 kD (p I6. 5)
p ro tein. M : m arkers on the leaf of F ig. A , B, C, D , H. A : Two2dim ensional electropho resis pattern of leaf p ro tein
from W ujin4B befo re zebra2leaf appeared, show ing the p resence of P1. B: Yellow areas in leaves of induced W ujin4B
during zebra2leaf appeared, show ing the absence of P1. C: Green areas in leaves of induced W ujin4B during zebra2leaf
appeared, show ing the p resence of P1. D: W ujin4B after re2green ing, show ing P1 no rm al exp ression. E: Yellow areas
in leaves of induced 1103S during zebra2leaf appeared, show ing the absence of P1. F: W ujin4B grow n under
continuous no rm al temperature (average temperature 30℃) , show ing the p resence of P1. G: W ujin4B grow n under
continuous low temperature ( average temperature 20℃) , show ing the p resence of P1. H: T he contro l species
W ujin3B, show ing the p resence of P1. I: T he contro l species F1, show ing that varied temperature did no t affect P1
exp ression w hen genetic background is changed.
9786 期　　　　　　　何瑞锋等: 水稻温敏叶绿素突变体叶片蛋白的双向电泳分析