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第 27 卷 第 4 期 作　物　学　报 V ol. 27, N o. 4
2001 年 7 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA July, 2001
小麦合成种M 53 抗白粉病基因的 RAPD 和 SSR 标记Ξ
胡英考ΞΞ　辛志勇
(中国农业科学院作物育种栽培研究所, 农业部作物遗传育种重点开放实验室, 北京 100081)
提　要　运用RA PD 和 SSR 技术, 采用分离群体分组分析法 (BSA ) 进行了小麦合成种M 53 抗白粉病
基因连锁的分子标记研究。结果表明, M 53 的抗白粉病基因由显性单基因控制, RA PD 标记
O PL 09- 1700与抗病基因连锁, 遗传距离为 16. 8 cM。SSR 标记Xgwm 205 也与抗白粉病基因连锁, 遗传
距离为 9. 3 cM , 通过 SSR 标记将该基因定位于 5 D S, 标记与基因间的排列顺序为: O PL 09- 1700- 16. 8
cM - 抗白粉病基因- 9. 3 cM - Xgwm 205。
关键词　合成种小麦; 抗白粉病; 基因; RA PD; SSR
RAPD and SSR M arkersL inked to PowderyM ildew Resistance Gene in
Trit icum durum -Aeg ilops squa rrosa Amph idiplo id M 53
HU Ying2Kao　X IN Zh i2Yong
(K ey L ab. of C rop Genetics & B reed ing , M inistry of A g riculture; Institu te of C rop B reed ing and Cultivation, CA A S , B eij ing
100081, China)
Abstract　　R andom amp lified po lymorph ic DNA (RA PD ) and simp le sequence repeats (SSR )
w ere emp loyed to detect mo lecular m arkers linked to pow dery m ildew resistance gene in T riticum
d u rum 2A eg ilop s squarrosa amph idip lo id M 53. T he resistance w as con tro lled by single dom inan t
gene. A RA PD m arker O PL 09- 1700 w as p roved to link to the resistance gene w ith genetic dis2
tance of 16. 8 cM. A SSR m arker Xgwm 205 w as also p roved to link to the resistance gene and
the genetic distance is 9. 3 cM. T h is pow dery m ildew resistance gene has been located in 5D S and
the sequence in 5D S is O PL 09- 17002Pm 2Xgwm 205.
Key words　　Syn thetic w heat; Pow dery m ildew ; Gene; RA PD; SSR
粗山羊草 (A eg ilop s squarrosa L. , DD )是普通小麦的祖先, 是D 染色体组的供体, 也是小
麦改良的宝贵的遗传资源。硬粒小麦 (T. d u rum L. , AABB) 与粗山羊草合成的双二倍体, 由
于与小麦具有相同的染色体组 (AABBDD ) , 可很方便地将粗山羊草的优异基因导入小麦, 通
过这一方法已将粗山羊草的 3 个抗叶锈基因和 1 个抗秆锈基因导入了普通小麦[ 1～ 3 ]。
在已发现和命名的 23 个位点、32 个抗白粉病基因中, 大多数来源于普通小麦[ 4 ]。已获得
了 Pm 1、Pm 2、Pm 3、Pm 4a、Pm 6、Pm 12 和 Pm 13 的 R FL P 标记, Pm 1、Pm 2、Pm 3b、
Pm 4a、Pm 12 和 Pm 21 的 RA PD 标记[ 5～ 11 ]。本研究室对一批人工合成种进行了抗白粉病鉴ΞΞΞ 现工作单位: 首都师范大学生物系
收稿日期: 2000207228, 接受日期: 2000212204
Received on: 2000207228, A ccep ted on: 2000212204本研究由国家自然科学基金 (编号: 39893350)和 973 项目 (编号: G1998010205)资助

定, 筛选出了两个全生育期对白粉病免疫的合成种, 其中一个合成种M 53 在遗传分析与基因
推导的基础上确认携带一新基因 (另文发表) , 本文报道了这一新基因的RA PD 和 SSR 标记。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
1. 1. 1　材料　　抗白粉病硬粒小麦2粗山羊草双二倍体M 53, 感病普通小麦亲本陕 7859, 以
及M 53 和陕 7859 的 F 2 单株。
1. 1. 2　引物　　采用美国Operon 公司的RA PD 引物。所用 SSR 引物见Roder 等 (1998) [ 12 ] ,
共用已定位于D 基因组的引物 70 对。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　抗白粉病鉴定　　白粉病接种在三叶期进行, 用白粉菌 15 号生理小种, 直接将病菌
孢子抖落在待测材料的叶片上保湿, 2～ 3 周后调查抗病性, 调查级别分为免疫和感病两级。
1. 2. 2　DNA 的提取及抗病池和感病池的建立　　采用酚2氯仿法提取基因组总DNA [ 13 ]。用
F 2 的 10 株抗病单株的等量DNA 混合成抗病池, 10 株感病单株的等量DNA 混合成感病池,
进行 PCR 扩增。
1. 2. 3　RA PD 扩增　　扩增反应体系为 25 ΛL , 反应液组成为 10 mmolöL T ris2HC l pH 8. 9,
50 mmolöL KC l, 2. 0 mmolöL M gC l2, 4 种 dN T P 各为 100 ΛmolöL , 引物 200 nmolöL , 基因组
DNA 25～ 50 ng, 1U 的 T aq 酶。反应程序: 首先 94℃变性 1 分钟, 然后进入循环: 94℃30 秒,
37℃45 秒, 72℃1 分钟, 45 个循环后, 在 72℃保温 10 分钟。反应在 Perk in2E lm er T hermocy2
cler480 上扩增。扩增产物在 1. 2% 的琼脂糖凝胶中电泳 3～ 4 小时, 溴化乙锭染色, 紫外灯下
观察并照相。
1. 2. 4　SSR 扩增　　在 Perk in2E lm er thermocycler480 上扩增, 25 ΛL 的反应体积中含每个
引物 250 nmolöL , 每种 dN T P 0. 2 mmolöL , M gC l2 1. 8 mmolöL , 1U T aqDNA 聚合酶, 50～
100 ng 的模板DNA。反应程序: 首先在 94℃变性 3 分钟, 然后进入循环: 94℃1 分钟, 50,
55 或 60℃复性 1 分钟 (根据不同引物) , 72℃延伸 2 分钟, 45 个循环后, 在 72℃保温 10 分
钟。4℃保存。采用 90W 恒功率电泳, 预电泳 30 分钟, 上样后电泳约 1 小时, 电泳在 Phar2
m arcia HoeferTM SQ 3 Sequencer 上进行, 稳压电源为 Pharm arcia EPS23500。银染序列胶的检
测按 Sourdille 等[ 14 ] (1998)的方法进行。
1. 2. 5　作图和遗传距离估算　　用作图软件 Jo inM ap V ersion1. 4 进行。
2　结果与分析
2. 1　M 53 中抗白粉病基因的 RAPD 标记
对M 53、陕 7859 及其 F 2 单株进行了白粉病抗性鉴定, 结果表明 (表 1) , M 53 的白粉病
抗性是显性单基因控制的。对M 53、陕 7859、抗病池和感病池进行了RA PD 引物的筛选, 共
筛选了 360 个Operon 引物, 有 60 个引物能够在双亲间扩增出多态性, 占全部引物的16. 3%。
得到了一个特异的引物O PL 09, 特异片段的分子量约为 1700 bp, 在抗病亲本M 53 和抗病池
中出现了此条带, 而感病池和感病亲本陕 7859 缺乏此条带 (图 1)。
　　为检测引物O PL 09 的稳定性及其与抗病基因的连锁关系和遗传距离, 对M 53 和陕 7859
杂交F 2群体的单株 , 进行了RA PD 扩增 , 结果表明 , O PL 09与抗病基因是连锁的。用引物
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表 1　　抗白粉病鉴定结果
Table 1　　Identif ication of powdery m ildew resistance
品种
V arieties
株数
No. of p lants
株数　No. of p lants
抗
Resistance
感
Suscep tibility
期望比率
Expected ratio
ς2 P0. 01
M 53 50 50 0
Shaan7859 50 0 50
M 53XShaan7859F2 185 139 46 3∶1 0. 0013 3 6. 62
　　3 3 Significant difference
图 1　　引物O PL 09 对抗病和感病亲本、抗病和感病池及 F2 单株扩增结果
M. 分子量标准; 1. M 53; 2. 陕 7859; 3. 抗病池; 4. 感病池; 5～ 9.
感病单株; 10～ 14. 抗病单株; 3交换型单株; 箭头所指为O PL 09- 1700
F ig. 1　　RA PD patterns show ing the p resence or absence of the O PL 09- 1700
fragm ent in parents of the crossM 53×Shaan7859, bulks and F2
M. M olecular w eigh t m arker ΚDNA w as digested w ith E coRÉ and H indË ;
L ane 1. M 53; L ane 2. Shaan7859; L ane 3. resistance pool; L ane 4. suscep tible
pool; L anes 5～ 9. Suscep tible individuals of F2; L anes 10～ 14. resistance
individuals of F2; A sterisk indicate interchanged p lant; arrow indicates
the m arker O PL 09- 1700
O PL 09 的 77 个 F 2 单株分
别进行了 RA PD 扩增 (图
1) , 结果 67 个抗病单株中
60 株有RA PD 的特异带, 7
株无特异带; 在 10 株感病
单株中 3 株有特异带, 7 株
无特异带 (表 2)。交换值为
15. 5±3. 1 个交换单位, 说
明 O PL 09- 1700 是M 53 中抗
病基因的一个RA PD 标记,
O PL 09- 1700与抗病基因间的
遗传距离为 16. 8 cM。
2. 2　M 53 中抗白粉病基因
的 SSR 标记
根据遗传分析的结果
(另文发表) , M 53 的抗病
基因来源于D 染色体组 ,
表 2　　RAPD 标记OPL 09- 1700与抗白粉病基因的连锁遗传分析
Table 2　　L inkage analysis between powdery m ildew resistance gene and OPL 09- 1700
位点　Locus 基因型　Genotype ς2 交换率　Rec. freq (% ) P0. 01
A B AB A b aB ab ς2A ς2B ς2AB
Pm O PL 09- 1700 60 7 3 7 5. 933 1. 913 12. 483 15. 5±3. 1 6. 63
所以我们只对已定位于D 染色体组的 70 对引物进行了筛选。对M 53、陕 7859、抗病池和感
病池进行了特异 SSR 引物的筛选, 结果表明, 在所用的 70 对引物中, 有 29 对引物在亲本间
具有多态性, 占 40. 1%。得到了一个特异的引物WM S205, 在抗病亲本M 53 和抗病池中扩出
了一条特异带, 而陕 7859 和感病池中缺乏此带 (图 2)。其引物序列为: 左链 5′2CGA CCC
GGT TCA CT T CA G23′, 右链 5′2A GT CGC CGT T GT A TA GT G CC23′, 复性温度 60℃。
　　为检测引物WM S205 的稳定性及其与抗病基因的连锁关系和遗传距离, 对M 53 和陕
7859 杂交 F 2 群体的单株, 进行了引物WM S205 的 SSR 扩增, 结果表明, 在 67 个抗病单株
中有 61 株具有特异带, 有 6 株缺乏此带; 10 个感病单株均缺乏此带, 其交换值为 9. 4±2. 8
个遗传单位, 说明Xgwm 205 是M 53 中抗病基因的一个 SSR 标记 (表 3) , Xgwm 205 与抗病基
7144 期　　　　　　　　胡英考等: 小麦合成种M 53 抗白粉病基因的 RA PD 和 SSR 标记　　　　　　　　　

图 2　　引物WM S205 对抗病和感病亲本、抗病和感病池及 F2 单株的 SSR 扩增
M. 分子量标准; 1. M 53; 2. 陕 7859; 3. 抗病池; 4. 感病池; 529, 11213.
感病单株; 10, 14222. 抗病单株; 3交换型单株; 箭头所指为 Xgwm 205
F ig. 2　　SSR patterns show ing the p resence or absence of the Xgwm 205 fragm ent
in parents of the crossM 53×Shaan7859, bulks and F2 individuals
M. M olecular w eigh t m arker pBR 322 w as digested w ith M SP; L ane 1. M 53; L ane
2. Shaan7859; L ane 3. resistance pool; L ane 4. suscep tible pool; L anes 5～ 9,
11～ 13. Suscep tible individuals of F2; L anes 10, 14～ 22. resistance individuals
of F2; A sterisk indicate interchanged p lant; arrow indicates the m arker Xgwm 205
因间的遗传距离约为
9. 3 cM。 因 为 Xg2
wm 205 已定位于 5D S,
所以我们对 5D 上其它
SSR 引物进行了检测,
结果均无多态性。
2. 3　M 53 抗白粉病基
因的定位
由于 SSR 标记Xg2
wm 205 位于 5D S, 该
SSR 标记与抗病基因
是连锁遗传的, RA PD
标记O PL 09- 1700与抗病
基因也是连锁遗传的,
所以标记 Xgwm 205 与
标记O PL 09- 1700也是连
锁遗传的。在 77 个 F 2
单 株 中, 既 有 Xg2
wm 205 标记也有O PL 09- 1700标记的单株有 54 株, 有Xgwm 205 标记无O PL 09- 1700标记的单株
有 7 株, 无Xgwm 205 标记有O PL 09- 1700标记的单株有 9 株, 无Xgwm 205 标记无O PL 09- 1700
标记的单株有 7 株 (表 4) , Xgwm 205 与O PL 09- 1700标记的交换值为 27. 0±4. 1 个交换单位,
其遗传距离为 26. 1 cM。
表 3　　SSR 标记 Xgwm205 与抗白粉病基因的连锁遗传分析
Table 3　　L inkage analysis between powdery m ildew resistance gene and Xgwm205
位点　Locus 基因型　Genotype ς2 交换率　Rec. freq (% ) P0. 01
A C AC A c aC A c ς2A ς2C ς2AC
Pm Xgwm 205 61 6 0 10 5. 933 0. 733 25. 533 9. 4±2. 8 6. 63
表 4　　标记OPL 09- 1700与 Xgwm205 的连锁遗传分析
Table 4　　L inkage analysis between OPL 09- 1700 and Xgwm205 marker
位点　Locus 基因型　Genotype ς2 交换率　Rec. freq (% ) P0. 01
B C BC Bc bC bc ς2B ς2C ς2BC
O PL 09- 1700 Xgwm 205 54 9 7 7 1. 913 0. 733 6. 873 27. 0±4. 1 6. 63
　　由于Xgwm 205 位于 5D S, 与着丝粒间的遗传距离超过了 20 cM , 与抗白粉病基因间的遗
传距离为 9. 3 cM , 所以M 53 的抗白粉病基因一定位于 5D S, 它与 SSR 标记和RA PD 标记在
染色体 5D S 上的排列顺序如下 (图 3) , 抗白粉病基因位于中间, 两边分别为 RA PD 标记
O PL 09- 1700和 SSR 标记Xgwm 205。
3　讨论
采用R FL P 的方法, 小麦的分子遗传图谱已构建完毕, 已发表的小麦连锁图谱仅包括了
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图 3　　抗白粉病基因及其分子标记O PL 09- 1700
和Xgwm 205 在 5DS 染色体上的排列
F ig. 3　　The sequence of O PL 09- 1700,
Xgwm 205 and Pm gene in 5DS
很少的突变位点和重要的农艺性状基因, 产生这
种结果的主要原因是同工酶和 R FL P 在品种间
多态性低 (< 10% ) [ 15 ]。另外, R FL P 需DNA 的
量大, 有一定的技术难度, 需要同位素等条件也
限制了用R FL P 的方法标记重要农艺性状基因。
低水平的多态性和很慢的基因标记速度, 显然不
能满足标记辅助育种的需要。
在植物中, 含有一种称为微卫星或简单重复
序列的DNA 序列。微卫星具有丰富的多态性, 分布于整个基因组, 只需少量的DNA , 而且
微卫星基于 PCR , 方法简便适于自动化, 可很容易地分析大量的样品, 是理想的分子标记。
在小麦中, SSR 具有染色体特异性, 且其多态性比其它标记方法都高[ 16～ 19 ], 运用 SSR 和
R FL P 已经构建了小麦的第一张 SSR 图谱[ 12 ] , 运用 SSR 技术已得到了小麦矮秆基因 R h t8 和
R h t12 的 SSR 标记[ 4, 19 ]。
本研究中所得到的两个标记, 与抗病基因间的遗传距离仍较大。同时, 本研究中用于作
图的株数较少 (77 株) , 也有可能影响遗传距离的准确性, 因此, 进一步寻找紧密连锁的标记
和增加群体中单株数量是下一步研究的重点。
本研究中得到的 RA PD 标记虽然与抗病基因间的遗传距离较远, 但证明了利用 RA PD
的方法是可以进行基因标记的, 其前提是要严格控制反应条件, 在得到紧密连锁的标记后,
将其转化为稳定的 SCA R 标记。
随着分子标记技术的不断发展和完善, SSR 引物的不断克隆与定位, 高密度的分子图谱
在不久的将来即可完成, 这就为小麦重要农艺性状基因的定位与分子标记辅助育种开拓了一
条崭新的途径。
参　考　文　献
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