全 文 ：Vol. 30 , No. 10
pp. 1008 - 1013 　Oct. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 10 期
2004 年 10 月 　1008～1013 页
甘蔗( Saccharum officinarum L1)品种遗传差异的 AFLP分子标记分析
李　鸣1 ,2 　谭裕模1 　李杨瑞1 ,2 , 3 　李容柏1 　高国庆1 Ξ
(1 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室 ,广西南宁 530007 ; 2 广西大学 ,广西南宁 530004)
摘 　要 　采用 AFLP技术 ,从 64 对引物中筛选出 5 对带型分布均匀、多态性丰富且分辨能力强的引物 ,对两个在生产上
广泛推广应用的甘蔗品种的 AFLP指纹图谱进行分析 ,计算了两品种间的遗传相似性和遗传距离。结果表明 ,5 对引物
在 2 个甘蔗品种间均存在显著的差异 ,其中多态性位点占总扩增位点的 1012 % ,区分率达 100 %。这对应用 AFLP技术鉴
定甘蔗品种的真伪提供了依据。本文还对甘蔗 AFLP分析体系的关键技术以及银染的安全性和可靠性进行了讨论。
关键词 　甘蔗 ( Saccharum officinarum L1) ;AFLP ;指纹图谱 ;品种鉴定
中图分类号 : S566
AFLP Molecular Analysis of Genetic Difference between Cultivars in Sugarcane
( Saccharum officinarum L1)
LI Ming1 ,2 , TAN Yu2Mo1 , LI Yang2Rui1 ,2 , 3 , LI Rong2Bai1 , GAO Guo2Qing1
(1 Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Laboratory , Nanning 530007 , Guangxi ;2 Guangxi University , Nanning 530004 , Guangxi , China)
Abstract 　Five pairs of AFLP primers from 64 pairs were selected , which had rich polymorphism1 The genetic diversity of
two sugarcane cultivars was analyzed with the fingerprinting mapped by the 5 primer pairs ,and the genetic similarity and
distance were estimated1 The results showed that there were distinct differences between the two cultivars1 The rate of the
polymorphism bands was 1012 % ,and the rate of identification was 100 %1The key techniques of AFLP analysis system ap2
plied in sugarcane ,the reliability and safety of silver staining were also discussed1
Key words 　Sugarcane ( Saccharum officinarum L1) ;AFLP ;Fingerprint ;Cultivar identification
　　甘蔗 ( Saccharum officinarum L1)优良新品种新资
源的引进 ,较大幅度地提高和改善了我国甘蔗的产
量和品质 ,也为甘蔗的杂交育种提供了大量亲本和
优良性状。尤其是近年来新台糖品种的大量引进应
用 ,使台湾品种占广西甘蔗种植面积的 70 %以上 ,
单产也由 1999 年的 57 t/ hm2 提高到现在的 6718 t/
hm2 ,榨季甘蔗蔗糖分从 20 世纪 90 年代的 12113 %
提高到现在的 13145 % (广西甘蔗研究所统计资
料) 。目前引进的品种中 ,有一些形态特征十分相
似 ,很难鉴别 ,给生产应用带来诸多不便。自 20 世
纪 70 年代以来 ,有人尝试利用同工酶鉴别甘蔗品
种 ,但是由于同工酶存在稳定性较差、标记少等一些
缺点 ,在甘蔗指纹图谱的应用中受到了一定限制[1 ] 。
分子标记技术在甘蔗上已有初步研究 , 其中
Burquish 在 1991 年完成了甘蔗基因组的第一张分子
连锁图[2 ] 。冯斗等用 RAPD 对斑茅进行分类 ,提出
斑茅不宜列在甘蔗属 ,而应划入蔗茅属或另立新属
的观点[3 ] 。对于甘蔗 AFLP 研究的相关报道很
少[4 ] 。目前在国内还没看到有关甘蔗 AFLP 标记分
析的报道。　　　
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism ,
扩增片段长度多态性 ) 是荷兰科学家 Zabeau 和
Vos[5 ,6 ]于 1993 年建立起来的一种 DNA 多态性的分
子标记技术。由于不同基因组 DNA 的酶切位点存
在差异 ,因而产生了扩增片段长度的多态性。我们
试用 AFLP 技术进行甘蔗品种鉴定工作 ,以期为甘
蔗品种真伪的鉴别提供良好方法。Ξ基金项目 : 国家 863 计划子课题 (2001AA241191)资助。
作者简介 : 李鸣 (1977 - ) ,男 ,硕士 ,研究方向 :植物分子生物学。3通讯作者 :李杨瑞 ,教授 ,博士生导师。E2mail :nkya @public1nn1gx1cn
Received(收稿日期) : 2003205213 ,Accepted(接受日期) :20032122201

1 　材料和方法
111 　供试材料
　　试验在广西作物遗传改良生物技术重点开放实
验室进行 ,供试材料为新台糖 23 ( T23) 和水电 25
(T25 ,经广东、广西两省的甘蔗专家鉴定认可) ,均由
广西甘蔗研究所提供。
112 　模板 DNA的制备
取甘蔗幼嫩叶 3～5 g ,用液氮研磨成粉末 ,加 20
mL DNA 提取液 ( Tris2HCl pH 810 , 100 mmol/ L ;NaCl
500 mmol/ L ; EDTA pH 810 , 50 mmol/ L ;SDS 115 %) ,
混匀后置 65 ℃水浴 30 min ,加 5 mol/ L KAc 8 mL ,再
置冰浴 20 min ,加等体积氯仿/ 异戊醇 (24∶1) ,12 000
r/min 离心 10 min , 取上清液 , 用等体积预冷
(
- 20 ℃)的异丙醇沉淀 DNA ,沉淀物用 70 %乙醇洗
涤后溶于 500μL pH 810 的 TE中。依次分别加等体
积的酚/ 氯仿/ 异戊醇 (25∶24∶1) 和氯仿/ 异戊醇 (24∶
1) ,12 000 r/ min 离心 10 min 纯化 DNA ,用 2 倍体积
预冷 ( - 20 ℃) 无水乙醇沉淀 DNA ,DNA 溶于 500μL
pH 810 的 TE中 ,用 RNase 酶去除 RNA。
113 　AFLP扩增
实验分别采用 10 U 和 5 U 的两种酶 ( EcoR Ⅰ和
Mse Ⅰ) ,在 37 ℃和 65 ℃下分别酶切 480 ng 基因组
DNA 12 h 和 10 h。之后 ,酶切产物用 5 U T4 ligase 在
22 ℃下连接过夜。其余步骤同 Zabeau 和 Vos
(1993) [5 ,6 ] 。 Taq 酶由日本 TakaRa 公司生产提供 ,
用Biometra 生产的 Tgradient PCR 仪进行扩增 ,选择
性扩增结束后 ,加等体积上样缓冲液 ( 98 % for2
mamide 49 mL ,10 mmol/ L EDTA 110 mL ,bromophenol
blue 01125 g ,xylene cyanol 01125 g ) ,95 ℃变性 5 min ,
置冰上 10 min ,迅速上样。
114 　聚丙烯酰胺凝胶( 6 %)电泳和银染检测
11411 　聚丙烯酰胺凝胶电泳 　　用北京六一仪器
厂生产的 DYY212 型电脑三恒多用电泳仪和北京君
意东方电泳设备有限公司生产的高压电泳槽 (规格
50 cm ×21 cm ×0104 cm) ,单面电泳。配制 6 %聚丙
烯酰胺凝胶 50 mL ,含有 715 mL 40 % polyacrylamide
(acrylamide∶bisacrylamide = 19∶1) ,510 mL 10 ×TBE缓
冲液 , 24 g 尿素 , 40 μL TEMED , 250 μL 10 % APS
(Ammonium persulfate 10 % W/ V ) 。在加入 TEMED
和APS后 ,立即灌胶 ,约 1 h 后 ,胶凝固。安装电泳
槽 ,上下槽分别倒入大约 300 mL 1 ×TBE 缓冲液。
在1 500 V 电压下 ,预电泳 40 min。以 4μL 变性的
PCR 产物上样。在 55 W功率下 ,电泳 215 h。
11412 　银染　　用 10 % 醋酸固定 30 min ,用 ddH2O
分别洗 3 min、2 min、1 min ,011 % AgNO3 (含 37 % 甲
醛 115 mL) 染色液染色 20 min ,用 ddH2O 快速冲洗 1
次 ,用 500 mL 3 %的 Na2CO3 (含 37 % 甲醛 115 mL ,
011 mol/ L Na2S2O3 150μL)显影液显色至一半的条带
出现时 ,用另外 500 mL 显影液显色至所有带清晰 ,
用 10 % 醋酸终止显影 3 min。用 EPSON Perfection
1650 扫描仪扫描 ,数据统计分析。
115 　数据统计
标记 AFLP 扩增片段大小 ,以 0 和 1 建立数据
库。在相同迁移率位置上 ,有带的记为 1 ,无带的记
为 0。参照 DNA 分子标记数据分析方法 ,将 AFLP
标记作为等位基因进行多态性研究 ,每一条扩增条
带视为一个性状 ,处理数据[7 ,8 ] 。根据 Nei &Li 的计
算方法计算两品种间的遗传相似度 ( Genetic similari2
ty)和遗传距离 ( Genetic distance , D) ,计算公式为 S =
2 NXY/ NX + N Y ,式中 S 为遗传相似度 , NX 、N Y 分别
为 X 和 Y 各自总扩增带数 , NXY为两者共有的带数 ,
S 表示 AFLP 谱带所显示的 2 个体间基因组相似程
度 , S 值愈小则变异愈大[9 ] 。遗传距离 ( D) 表示 2
个体间基因组的不同程度 , D = 1 - S 。
2 　结果与分析
211 　两个甘蔗品种形态特征比较
　　我们对两个甘蔗品种 T23 和 T25 的 26 个主要
的形态特征进行了调查和对比 ,结果列于表 1。由
表 1 看出 ,两个品种是非常相似的 ,在所列的 26 个
形态特性中 ,仅有 5 个性状略有差异和抗病性差别
较明显。
212 　DNA浓度和纯度的检测
经紫外分光光度计测定 ,其 OD260/ OD230比值大
于 210 , OD260/ OD280 比值在 118 左右 ,用 110 % A2
garose 凝胶电泳检测提取的 DNA 为一条清晰完整的
带 ,纯度符合 AFLP 要求 (图 1) 。
213 　选择性扩增和两品种的 AFLP多态性
建立甘蔗 AFLP 反应体系后 ,从 64 对引物中筛
选出 5 对条带较多、多态性丰富且分布均匀的引物 ,
其序号分别为 : E2/ M4、E4/ M5、E5/ M6、E3/ M7 和 E2/
M6。表 2 为 5 对引物对 2 个甘蔗品种选择性扩增的
结果。由表 2 可知 ,5 对引物共在 272 个位点上扩增
出条带 ,平均每对引物扩增位点 5414 个。引物 E4/
M5 扩增位点数最多为 69 个 ; E5/ M6 扩增位点数最
9001　10 期 李 　鸣等 :甘蔗 ( Saccharum officinarum L1)品种遗传差异的 AFLP分子标记分析 　　　

少 ,
表 1 甘蔗品种 T23 和 T25 形态特征比较
Table 1 Comparison of morphological characteristics of
sugarcane cultivars T23 and T25
形态特征
Morphological
characteristics
甘蔗品种
Sugarcane cultivar
T23 T25
节间形状 圆筒形 圆筒形
茎色 暗紫红色 暗紫红色
茎的大小 中茎 中茎
蜡质带 不明显 不明显
节间蜡层 较厚 较厚
芽着生位置 芽基稍离叶痕 芽基紧跟叶痕
芽沟 明显 不明显
芽翼 中等 ,着生于芽的上半部
中等 ,着生于芽的上半
部
芽的大小 中等 中等
芽的形状 卵圆形 卵圆形
57 号毛群 不发达 不发达
10 号毛群 最发达 一般
内叶耳形状 披针形 披针形
外叶耳形状 过渡形 过渡形
根点 2～3 排 ,不规则排列 4～5 排 ,不规则排列
叶舌 新月形 新月形
叶鞘颜色 青绿色 ,老叶鞘略带紫色
青绿色 ,老叶鞘略带紫
色
褶皱带 平底三角形 平底三角形
成熟期 早熟 早熟
糖分 高糖 高糖
产量 高产 高产
叶色 深绿色 深绿色
叶宽 中等 中等
叶角度 斜举挺立、新叶尖直立、老叶尖端弯垂
斜举挺立、新叶尖直
立、老叶尖端弯垂
叶脱落性 易脱落 不易脱落
抗病性 抗黑穗病、霉菌病 ,易感染梢腐病
抗叶枯病、抵抗 1 生理
小种黑穗病、黄锈病、
叶烧病 ,易感染 3 生理
小种黑穗病
为 33 个 ; E2/ M4 多态性位点最多 ,为 8 个 ; E3/ M7 多
态性位点最少 ,为 3 个 ; E5/ M6 虽仅扩增出 33 条带 ,
但多态性却高达 1512 %。5 对引物共扩增出多态性
位点 28 个 ,平均每对引物多态性扩增位点为 516
个 , 多态性位点占总扩增位点的比例平均为
1012 % ;5 对引物对 2 个甘蔗品种的区分率达 100 %
(表 2) 。
图 1 甘蔗叶片基因组 DNA电泳结果
Fig11 The results of electrophoresis for genomic DNA
of sugarcane leaves
泳道 1～3、4～6 分别是品种 T23 和 T25 基因组 DNA。
M是λDNA/ Hind Ⅲ标记。
Lanes 1 - 3 and 4 - 6 are cultivars T23 and T25 , respectively.
M isλDNA/ Hind Ⅲmarker.
表 2 筛选出的 5 对 AFLP引物在 2 个甘蔗品种上的扩增结果
Table 2 Amplified results by 5 selected AFLP primers in 2 cultivars of sugarcane
引物序号
Primer No1
( E/ M)
选择碱基
Selective base
( E/ M)
扩增位点
Amplified loci
(No1) 多态性位点Polymorphic loci(No1) 多态性位点比例Ratio of polymorphic loci( %) 区分率Identified rate( %)
2/ 4 E + AAC/ M + CAT 68 8 1117 % 100
4/ 5 E + AGT/ M + CGC 69 5 712 % 100
5/ 6 E + ACG/ M + CTA 33 5 1512 % 100
3/ 7 E + ACT/ M + CTC 49 3 611 % 100
2/ 6 E + AAC/ M + CTA 53 7 1312 % 100
214 　两品种的遗传距离
图 2 为 5 对引物对 T23 和 T25 两个甘蔗品种选
择性扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染结果。我们
在图片分析时只记录 200～1031 bp 之间可以看得清
楚的条带 ,计算结果显示 ,两品种的遗传相似值为
01897 ,遗传距离为 01103 ,表明两品种具有较大的遗
传相似性和较近的遗传距离。
215 　亲缘关系鉴定
5 对引物扩增显示的多态性结果说明 T23 和
T25 这两个品种间在 DNA 一级结构组成上存在差
异 ,表 3 列出了各引物对在不同的区间扩增出的差
异条带数 ,虽然这两个品种间的相似性为 01897 ,但
是仍具有足够的遗传多样性 ,从而能够清楚地在分
子水平上区分这两个甘蔗品种。
0101 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

图 2 5 对引物绘制的两个甘蔗品种的 AFLP指纹图谱
Fig12 AFLP fingerprinting of two sugarcane cultivars with 5 pairs of primers
泳道 1 ,3 ,5 ,7 ,9 :品种 T23 和各引物 E2/ M4 ,E4/ M5 ,E5/ M6 ,E3/ M7 ,E2/ M6 ;泳道 2 ,4 ,6 ,8 ,10 :品种 T25 和各引物 E2/ M4 ,E4/ M5 ,E5/ M6 ,
E3/ M7 ,E2/ M6。M: GeneRulerTM 50 bp DNA ladder 标记。
Lanes 1 ,3 ,5 ,7 ,9 :cultivar T23 with primers E2/ M4 ,E4/ M5 ,E5/ M6 ,E3/ M7 and E2/ M6 ;respectively ; Lanes 2 ,4 ,6 ,8 ,10 :cultivar T25 with
primers E2/ M4 ,E4/ M5 ,E5/ M6 ,E3/ M7 and E2/ M6 ,respectively. M: GeneRulerTM 50 bp DNA ladder marker.
表 3 新台糖 T23 和 T25 的 AFLP鉴别标记
Table 3 AFLP markers identified in T23 and T25
DNA 片段
DNA fragment (bp)
E2/ M4 E4/ M5 E5/ M6 E3/ M7 E2/ M6
T23 T25 T23 T25 T23 T25 T23 T25 T23 T25
1 031 - 900 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
900 - 800 0 2 0 0 0 0 0 0 1 0
800 - 700 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1
700 - 600 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1
600 - 500 1 3 0 0 0 0 0 0 1 0
500 - 400 0 0 1 0 0 2 0 0 0 0
400 - 300 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
300 - 250 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1
250 - 200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
总差异带数
Total different bands 8 5 5 3 7
3 　讨论
一般甘蔗栽培种是由种间杂交而来 ,是高度杂
合的多倍体 ,染色体数量多 ,是遗传上最为复杂的作
物之一。因此 ,对甘蔗性状进行常规遗传分析比较
困难 ,Waldron 和 Glasziou 等应用酯酶、酸性磷酸酶和
亮氨酸氨肽酶同工酶进行甘蔗品种鉴定[10 ] ;Ruiz 和
Maribona 提出了以单一酶 ———过氧化物酶同工酶进
1101　10 期 李 　鸣等 :甘蔗 ( Saccharum officinarum L1)品种遗传差异的 AFLP分子标记分析 　　　

行品种鉴定的方法 ,并指出过氧化物酶具有多态性
和稳定性[11 ] 。但是用过氧化物酶同工酶进行甘蔗
品种鉴定时 ,李连芳等认为同一品种在不同地点 ,不
同生长期采样分析其酶谱存在差异[12 ] ,而杨文等则
认为甘蔗的过氧化物酶同工酶稳定性很好[13 ] 。现
代分子生物学技术为甘蔗的遗传研究提供了新的技
术手段。Besse 等用 AFLP 技术对甘蔗的遗传多样性
和遗传距离进行了研究[14 ] ,Lima 和 Garia 等用 AFLP
技术对甘蔗遗传相似性和亲缘关系进行了分析[4 ] 。
本研究用 5 对引物对 2 个形态特征非常相似的甘蔗
品种基因组 DNA 进行了 272 个位点的检测 ,共发现
多态性位点 28 个 ,占 1012 % ,即被检测出的位点中
有 1012 %的位点存在品种间变异。通常情况下 ,
AFLP 每一条扩增带都对应着一个基因 DNA 分子位
点 ,出现多态性扩增带 ,说明某个或某些品种在该位
点上存在变异[15 ,16 ]。因此 ,亲缘关系较近的种质间
差异小 ,反之 ,差异则大。实验结果表明两个品种有
较大的遗传相似性 ,但它们仍有一定的遗传差异 ,不
能当作同一个品种 (表 1、表 2) 。
图 3 基因组 DNA Eco RⅠ+ Mse Ⅰ双酶切结果
Fig13 The results of genomic DNA digested with
Eco RⅠ+ Mse Ⅰ
泳道 1～2 :品种 T23 ;泳道 3～4 :品种 T25。M: GeneRulerTM
100 bp DNA ladder Plus 标记。
Lanes 1 - 2 :Cultivar T23 ;Lanes 3 - 4 :Cultivar T25. M: GeneRulerTM
100 bp DNA ladder Plus marker.
研究表明 AFLP 技术是鉴别甘蔗品种的有效手
段。甘蔗是无性繁殖作物 ,如果以真实的品种为供
试材料把某对引物绘制的 AFLP 指纹图谱确定为标
准图谱 ,则用同对引物绘制的待测甘蔗样品指纹图
谱与之相比即可辨别待测样品的真伪。另外 ,应用
AFLP 技术可以用来鉴别后代和对基因进行定位 ,还
可以将 AFLP 标记转换成 SCAR 标记进行分子标记
辅助育种。但是 AFLP 不同引物扩增的带型、数量
和分布均匀程度差异很大 ,区分能力也不相同 ,甚至
某些引物根本无法得到有效的扩增带。因此 ,在甘
蔗 AFLP 反应过程中引物的筛选是很有必要的。本
实验中共用了 64 对引物 ,从中选出的 5 对引物带型
分布均匀、多态性高 ,对甘蔗品种的分辨能力强 ,是
甘蔗 AFLP 品种鉴定中比较好的引物 (表 2、图 2) 。
在AFLP 分析的技术操作过程中 ,我们注意了
以下几方面的问题 : (1)保证 DNA 的完整性和纯度 ,
模板 DNA 无降解、无 RNA ,通过对 DNA 紫外分光光
度计检测 ,其 OD260/ OD230比值大于 210 ,OD260/ OD280
比值在 118 左右 ,纯度即达到 AFLP 技术的要求 ,用
1 % Agarose 凝胶电泳结果如图 1 所示 ,基因组 DNA
为一完整、无降解、无 RNA 的条带。(2) 保证双酶切
的彻底性 ,这是 AFLP 实验成败的关键因素之一 ,也
是实验结果可靠性和科学性的保证 ,如图 3 所示酶
切后基因组 DNA 呈均匀的弥散状 (Smear) 。(3) 保
证 PCR 条件的一致性和使用高质量的 Taq DNA 聚
合酶 ,从而保证了重复扩增结果的稳定性。(4) 银染
时严格控制每一步的时间和显影温度 ,以达到条带
清晰可辨 ,重演性好。
本实验研究采用银染法 ,避免了同位素对人体
的伤害和给环境带来的污染 ,研究结果显示银染虽
然达不到同位素检测的效果 ,但是它安全、可靠、易
于操作和掌握 ,同样能把 AFLP 指纹图谱技术重复
性高、安全可靠、多态性检出率高等 DNA 指纹技术
的特点、优点表现出来。利用 AFLP 技术来鉴定和
检测甘蔗品种的真伪和纯度可以获得客观、准确和
科学的结果。
致 　谢 :广西甘蔗研究所提供相关数据 ,广西作物遗
传改良生物技术重点开放实验室吕维莉、罗瑞鸿、魏
源文、邓智年和朱汝财等人给予帮助 ,实验室提供条
件并给予大力支持 ,在此一并表示感谢。
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3101　10 期 李 　鸣等 :甘蔗 ( Saccharum officinarum L1)品种遗传差异的 AFLP分子标记分析