全 文 ：第 27 卷 第 2 期 作　物　学　报 V o l. 27, N o. 2
2001 年 3 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ar. , 2001
玉米雄性不育性研究
　　Ð. 对玉米Y Ê -1不育胞质线粒体D NA RFL P 分析3
秦泰辰　徐明良3 3 　邓德祥　陈若雷3 3 3 　卞云龙
(扬州大学生物工程实验室, 江苏扬州 225009)
提　要　以玉米 T、S、C 群及新选育的 YÊ 21不育系为材料, 用这 4 类群不育胞质线粒体DNA , 经 4 种
限制性内切酶酶切, 长距凝胶分离酶切片段获得高分辨率的清晰谱带。再以 5 种线粒体特异的基因片
段作为探针与酶切条带杂交, 结果表明: T、S、C 群表现较多差异的杂交带型, 持有明显的多态性,
YÊ 21型杂交带与 T、S 群区别明显, 与C 群有少量差异。这为从遗传组成上区分不育胞质类群和 YÊ 21
型不育系的归群提供试验依据。
关键词　玉米; 线粒体DNA ; 雄性不育胞质; 限制性片段多态性
Study on M a le-Ster il ity in Zea m ays
　　Ð. RFL P Ana lysis of m tD NA of Y Ê -1 Type M a ize M a le-Ster ile Cytopla sm
Q IN T ai2Chen　XU M ing2L iang　D EN G D e2X iang　CH EN R uo2L ei　B IAN Yun2L ong
(B iotechnolog ica l L ab. , Y ang z hou U niversity , Y ang z hou 225009, Ch ina)
Abstract　　O ne set of m ale2sterile lines w ith the sam e nuclear backgrounds in m aize Cm s2T
U 8112、Cm s2s U 8112、Cm s2C U 8112 and Cm s2YÊ 21 U 8112 w ere u sed in ou r experim en t,
m tDNA w as p repared acco rd ing to Kem b le, R. J. ; H yb rid iza t ion had been described by
Sam b rook, J. , L ong length agro se gel electrophero sis can b ring ou t h igh reso lu t ion fo r E coRÉ , H ind Ë , B am H É and P astÉ rest ricted fragm en ts of m tDNA of co rn T、S、C group and
new YÊ 21 type m ale2sterile cytop lasm s. H yb rid iza t ion of 5 m tDNA specif ic p robes to
rest ricted m t DNA show n tha t m any differen t hyb rid ized bands w ere ex isted am ong T、S and
C group s, YÊ 21 type w as difference from T and S group , bu t there w as t iny difference w ith C
group in hyb rid ized bands. W e w ou ld app ly the techn ique of sequence analysis to the d ivision
of m asle2sterile YÊ 21 type.
Key words　　M aize; M itochondria l DNA ; M ale2sterile cytop lasm ; R FL P
采用核置换的方法由恢复系胞质获得玉米YÊ 21雄性不育系[ 1 ]后, 已从恢保关系、同工酶、
败育的细胞学行为、抗小斑病 T 小种特性等方面[ 2～ 5, 15 ]阐明了 YÊ 21不育胞质与 T、S 群不育
胞质有明显差别, 与C 群胞质也有差别。继之经线粒体DNA 酶切电泳分析, 酶切图谱表明:
　 3 本研究得到国家自然科学基金 (39270385)和江苏省科委基础理论研究项目 (91031)资助。3 3 本文由徐明良执笔完成初稿。3 3 3 参加部分工作, 现为中国科学院合肥等离子所博士生。
收稿日期: 1999210214, 接受日期: 2000201216
Received on: 1999210214, A ccep ted on: 2000201216

YÊ 21不育系与 T、S 群不育胞质差异显著, 但与C 群不育胞质相比, 仅在低分子量谱带表现有
较小区别[ 6 ]。本文报道以线粒体特异基因作为探针, 对玉米 YÊ 21型不育胞质线粒体DNA 进
行R FL P 分析的结果, 以进一步探求 YÊ 21不育胞质的从属类群。
1　材料和方法
1. 1　材料
1. 1. 1　供试材料为一组同核异质系: Cm s2T U 8112、Cm s2S U 8112、Cm s2C U 8112、Cm s2
YÊ 21U 8112, 转育世代为 8 代以上, 各性状均已稳定。
1. 1. 2　线粒体特异基因探针共 5 个, 分别来自水稻 (Cox 1、Cox 2) 和玉米 (a tp 6、rrn18s、
rrn26s)。
1. 1. 3　限制性内切酶为 E coR É、H ind Ë、B am H É 和 P astÉ。
1. 2　线粒体D NA 的制备
线粒体DNA 的制备程序根据 Kem b le [ 11 ]的方法加以改进。玉米种子经表面消毒后于
26℃暗培养 6 天左右, 剪取黄花苗, 加 2 倍体积 (vöw ) 预冷匀浆缓冲液 (10mm o löL T ris—
HC l、1 mm o löL ED TA、0. 5 m o löL 蔗糖, 用前加 0. 1 小牛血清蛋白、20 mm o löL Β—巯基乙
醇) , 于冰浴上碾磨匀浆过滤。滤液于 3, 000 röm in 离心 10 m in。上清液经 10000 röm in 离心
10 m in, 沉淀即为粗制线粒体。将 100 g 苗的粗制线粒体悬浮于 10 mL 匀浆缓冲液中, 加 0. 1
mL 浓度为 1 m o löL 的M gC l2 和 50 ΛL 浓度为 100 m gömL 的DN aseÉ 酶溶液, 混匀, 于冰上
消化 60 m in 后, 铺与预冷的 20 m l 清洗缓冲液 (10 mm o löL T ris2HC l、20 mm o löL ED TA、0.
6 m o löL 蔗糖) 上, 10000 röm in 离心 20 m in, 即可获得纯化的线粒体。将纯化线粒体悬浮于
20 m l 洗涤液中, 10000 röm in 离心 10 m in。将沉淀的线粒体用 2 mL 裂解缓冲液 (10 mm o löL
T ris2HC l、10 mm o löL N aC l、1 mm o löL ED TA ) 同时加入 SD S 和蛋白酶 K 至终浓度 1% 和
100 Λgöm l, 于 37℃裂解 30 m in, 加入 5 ΛL 浓度为 10 m gömL 的RN ase 酶 5 ΛL , 进一步温育
30 m in 消化RNA。再用常规方法抽提线粒体DNA , 并将其置于- 20℃冰箱中保存。
1. 3　线粒体D NA 酶切片段电泳分离
线粒体DNA 各取 2 Λg, 用 4 种限制性内切酶 (E coR É、H indË、B am H É、P astÉ ) 酶
切, 体积 50 ΛL , 酶切 3h。酶切样品在 0. 8% 琼脂糖凝胶上电泳, 电泳胶板长 40 cm , 电压
45V , 电泳 48h, 电泳结束后在 0. 2 ΛgömL 溴化乙锭溶液中染色 1h, 经重蒸水漂洗后在紫外
灯下拍摄。
1. 4　探针标记与分子杂交
线粒体基因片段的制备参见杨金水等的方法[ 7 ]。调节DNA 浓度到 10 ngöΛL , 吸取 2ΛL , 采用随机 6 引物探针标记系统, 按厂家提供的方法标记探针。凝胶拍照后, 用印迹法将
线粒体DNA 片段转移到尼龙膜上, 80℃烘干 1 小时固定。杂交方法参见 J. Sam b rook 的《分
子克隆实验指南》第 2 版[ 10 ]。
2　结果
T、S、C 与 YÊ 21四种不育胞质经 4 种限制性内切酶酶切后, 用 5 个线粒体特异的探针杂
交, 其杂交谱带的变化见表 1。在大多数的探针与线粒体DNA 酶切片段杂交中, 胞质间出现
多态性。如Cox 1、a tp 6 和Cox 2 同所有 4 种酶的酶切谱带杂交; rrn26s 同 E coR É、H ind Ë 酶
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表 1　　5 种探针与 4 种不育胞质酶切片段的杂交
Table 1　　Hybr idization of 5 probe to restr icted m tD NA
bands of 4 male- ster ile cytoplasm s
T
(kb)
S
(kb)
C
(kb)
YÊ 21
(kb)
Cox 1 E coR É 5. 0 3. 4 5. 2 5. 2
H indË 3. 0 2. 5 3. 0 3. 0
2. 5 2. 5
B am H É 8. 0 8. 7 8. 0 8. 0
6. 8
P astÉ 7. 2 8. 2 7. 2 7. 2
Cox 2 E coR É 4. 0 4. 0 4. 0 4. 0
3. 0 3. 6 3. 6 1. 5
2. 4 1. 0 1. 5
1. 7
H indË 0. 7 0. 7 0. 72 0. 71
B am H É 3. 6 3. 6 3. 6 3. 6
3. 4
1. 8
P astÉ 3. 0 1. 9 2. 5 2. 5
a tp 6 E coR É 4. 7 4. 2 4. 2 4. 2
4. 0
H indË 5. 2 4. 2 5. 4 5. 4
4. 2 4. 2 4. 2
B am H É 7. 0 5. 8 5. 8 5. 8
5. 8
P astÉ 7. 2 3. 0 3. 8 3. 8
4. 6
3. 0
rrn26s E coR É 6. 0 4. 7 4. 7 4. 7
4. 7
4. 2
H indË
B am H É 3. 6 3. 6 3. 6 3. 6
P astÉ 3. 2 3. 2 3. 2 3. 2
rrn18s3 H indË
B am H É
　　3 暂失数据。
切谱带的杂交, rrn18s 与H ind Ë、B am H É
酶切谱带的杂交等。少数探针与线粒体
DNA 酶切片段杂交胞质间不出现多态性,
如 rrn26s 与B am H É、P astÉ 酶切片段的杂
交, 前者杂交带均为 3. 6 kb、后者都为 3. 2
kb (图 1)。4 种不育胞质间的多态性比较可
以清楚看到, T、S、C 间有许多差别的杂交
带。新筛选的 YÊ 21型不育胞质的杂交带与
T、S 群的差异显著, 与C 群较接近, 只在少
数探针与线粒体DNA 酶切片段的杂交中出
现差别, 如 Cox 2 与 E coR É 酶切带杂交, C
群有 4. 0 kb、3. 6 kb 和 1. 5 kb 三条带, 而
YÊ 21 型只有 4. 0 kb 和 1. 5 kb 二条带; 与
H ind Ë 酶切带杂交, C 群和 YÊ 21型杂交带
的大小分别为 0. 72 kb 和 0. 71 kb (图 2) ,
rrn18s 与 B am H É 的酶切带杂交, C 群比
YÊ 21型多一条低分子量的杂交带 (图 3)。这
些结果从线粒体的遗传组成上说明 YÊ 21型
不属于 T、S 群, 与所研究的 C 群较接近,
但也不完全相同。
杂交结果还显示探针与胞质线粒体
DNA 的酶切条带杂交中, 有相当一部分出
现 2 条或 2 条以上的杂交带。从 4 种不育胞
质来看, T 群这一特征最明显; 就探针而
言, 用Cox 2、a tp 6 杂交出现 2 条以上杂交带
的较多, 其余 3 个探针较少。这一现象从一
个侧面说明了玉米不育胞质线粒体DNA 组
成的复杂性。
3　讨论
3. 1　Y Ê -1型玉米不育胞质的归群
我室新育成的 YÊ 21型不育系, 已从群体、细胞水平进入分子水平的研究。结果表明,
YÊ 21不育胞质与 T、S 群有别, 与C 群较接近, 但也有差异, 这些研究初步结论与通过杂交后
显示的线粒体DNA 多态性结果也相吻合。但是我们研究仅应用了C 群单一胞质, P ring 根据
线粒体DNA 酶切图谱分析, 将C 群分为三个亚群CÉ、CÊ 和CË [ 14 ] , YÊ 21型不育胞质是否与
这三个亚群有关连, 需进一步试验。
应用酶切图谱对玉米不育胞质归类, 不失为一种可靠的方法, 而仅以此比较酶切图谱差
异还是不够的。由于玉米线粒体DNA 酶切条带, 常规酶切图谱可出现的约 60 条带, 分子量
相近或重复的条带又叠合一起, 区分较难。这点从分子杂交的结果可获说明, 因为用同一的
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图 1　　探针 ( rrn26s)与 4 种不育胞质酶切片段杂交
F ig. 1　　H ybridization of p robe ( rrn26s) to restr2
icted m tDNA bands of 4 m ale2sterile cytop lasm s
Y: m ale2sterile cytop lasm s of YÊ 21 type (YÊ 21型不育胞质)
C: m ale2sterile cytop lasm s of C group (C 群不育胞质)
S: m ale2sterile cytop lasm s of S group (S 群不育胞质)
T: m ale2sterile cytop lasm s of C group (C 群不育胞质)
N : no rm ale m ain tainer cytop lasm s (正常保持系胞质)
RC: resto rer C m ale2sterile cytop lasm s (恢复C 群不育胞质) 探针杂交在不同的空间出现的多态性在酶切图谱上无法区分。为此, 确定不育胞质还应以分子杂交为基础, 结合线粒体DNA 多态性分析, 以达到可信性。　　但是, 迄今对玉米胞质归群以及亚群区分的研究工作, 都是在胞质基因尚未探明的条件下进行的。仅仅按照相似线粒体DNA的谱带进行归群或区分亚群, 是难以说明群间或亚群间的遗传本质。据韦桂旺[ 8 ] 等报道, 在 44 个探针ö酶组合的R FL P 的研究工作中, 有 Cox Ê , Cob, pB cm H 3 个探针的R FL P 的分析可以较准确的对 T、C、S 3 种胞质进行归群, 聚于群内的线粒体DNA 遗
传距离几乎等于零, 聚于同一群内的雄性不
育材料持有专一恢复育性的效应。为此指出, 依据上述研究结果可以建立较为科学的R FL P
进行胞质分类体系。以探明胞质不育性原因。
图 2　　探针 (Cox 2)与不育胞质线粒体DNA
(E coR É H indË )酶切片段杂交
F ig. 2　　H ybridization of p robe (Cox 2) to
restricted m tDNA (E coR É、H indË )
Bands of m ale2sterile cytop lasm.
3. 2　玉米线粒体D NA 结构的探讨
Bock [ 12 ]和杨金水等[ 9 ]的研究, 持有这样
的观点, 认为同一个探针与一种限制酶完全
酶切的线粒体DNA 杂交以后, 若显示多杂
交带, 而探针本身缺少这个限制酶的切割点,
这就表明, 该探针的序列在线粒体DNA 中
具有重复。当然应用分子杂交的方法能检测
到重复序列, 但有个前提, 即重复区段的限
制酶酶切位点已发生变化, 酶切后已产生大
小不同的片段。否则, 就是有重复序列, 由于
酶切带大小一致, 也仅能显示一条杂交带。
例如, 就按我们的研究表明: Cox 1 没有测试
后用的 4 种酶的酶切位点, Cox 1 与 C 群和
YÊ 21型不育胞质线粒体DNA 的 H indË 酶切
片段杂交呈现二条带, 阐明Cox 1 所在区段为
一重复序列, 它与其余酶的酶切片段杂交仅
有一条带, 表明重复序列上这些酶的酶切位
点没有发生变化。为此, 在检测是否发生有
重复序列时, 要应用多种限制性内切酶, 不
然难以得到有效检测结果。
在我们对不同类群的不育胞质DNA 的
R FL P 的分析中, 还出现一个特点是: 杂交带
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信号呈现强弱之别 (图 1) , 若线粒体仅有一主环结构, 那么, 重复序列的拷贝数应等同, 杂交
后的信号不可能差异很大。据 Fau ron [ 13 ]报道, 线粒体DNA 具有亚环结构 (反向重复) , 那么,
线粒体若有多个亚环结构组成, 重复序列在不同的亚环上, 因为线粒体亚环拷贝数不平衡,
就能导致杂交带信号的强弱。由此可见, 在分子水平上的分析可以说明线粒体结构的复杂
性。这也引出玉米不育胞质的归群还应从线粒体结构的复杂性上制定思路与技术。
图 3　　探针 ( rrn18s)与不育胞质线粒体DNA (B am H É , H indË )酶切片段杂交
F ig. 3　　H ybridization of p robe ( rrn18s) to restricted m tDNA (B am H , H indË )
Bands of m ale2sterile cytop lasm.
　　近年, 据韦桂旺[ 8 ]等研究指出, 探讨不育DNA 结构的差别以及这种差别与育性表型、效
应的相互吻合, 即指亚群的划分, 需要更多的探针ö酶组合进行广泛的测试, 以达到分离出胞
质育性基因。在试验中发现, 双型胞质DNA 具有 S 群与C 群相加的R FL P 图谱, 并聚结在 S
群与C 群胞质之间, 这样, 是否可以将其归类为 S 群的亚群, 这亚群间有什么遗传效应的差
异, 都需进一步探明。
参　考　文　献
1　秦泰辰, 邓德祥. 江苏农业科学, 1984, 6: 6～ 10
2　秦泰辰, 邓德祥等. 江苏农业学报, 1989, 5 (2) : 7～ 14
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5　秦泰辰, 陈建国等. 作物学报, 1995, 20 (6) : 637～ 648
6　秦泰辰, 张亚兵等. 江苏农业学报, 1997, 13 (3) : 146～ 148
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8　韦桂旺, 郑用琏等. 遗传学报, 1997, 24 (1) : 66～ 77
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10　J Sam brook. 分子克隆实验指南 (第二版). 长沙: 湖南科技出版社, 1992
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9812 期　　　秦泰辰等: 玉米雄性不育性研究　Ð. 对玉米 YÊ 21不育胞质线粒体DNA R FL P 分析